PLoS ONE: Basal Cancer Cell Survival Involverer JNK2 Undertrykkelse af en roman JNK1 /c-Jun /Bcl-3 Apoptotisk Network

Abstrakt

Baggrund

Reguleringen af ​​apoptose under basale (ikke-stress) betingelser er afgørende for normal pattedyr udvikling og også for normal cellulær omsætning i forskellige væv i hele livet. Mangelfulde regulering af basal apoptose, eller dens perturbation, kan resultere i hæmmet udvikling og /eller sygdomstilstande, herunder cancer. I modsætning til stress-induceret apoptose regulering af apoptose under basale betingelser er dårligt forstået. For at løse dette problem, vi har sammenlignet basal- og stress-induceret apoptose i humane epitelceller af normale og ondartede oprindelse. Til dette formål fokuserede vi vores undersøgelse af de modstående pro-apoptotisk JNK /anti-apoptotiske NFKB veje.

Metode /vigtigste resultater

Kombinatorisk RNAi plus gen knockout var ansat til at få adgang til og kortlægge basal lovgivningsmæssige veje for apoptose. Follow-på, dybdegående analyser inkluderet eksogen udtryk for fosforylering mutanter og kromatin immunofældning. Vi viser, at basal apoptose konstitutivt undertrykkes af JNK2 i en række humane cancercellelinier. Denne effekt blev ikke observeret i ikke-kræftceller. Silencing JNK2 af RNAi resulterede i JNK1-afhængig apoptose af cancerceller via opregulering af AP-1 faktor c-Jun. Uventet opdagede vi, at JNK1 og c-Jun fremme basal apoptose i fravær af “Aktivering phosphoryleringer” typisk induceret af stress. Hypo-phosphoryleret c-Jun akkumuleret til høje niveauer efter JNK2 lyddæmpning, auto-reguleret sit eget udtryk og undertrykt udtryk af Bd-3, en usædvanlig IKB protein og regulator af NFKB. Basal apoptose blev medieret af komponenter af TNFa respons pathway men var mekanistisk adskiller sig fra TNFa-induceret apoptose.

Konklusioner /Signifikans

Vores resultater viser, at mekanistisk distinkte veje operere at regulere apoptose i pattedyrceller under basal (fysiologisk) versus stressinducerede betingelser. Vi beskriver også et hidtil ukendt apoptotisk netværk der regulerer basal overlevelse af cancerceller. Sådanne oplysninger er afgørende for forståelsen af ​​normal cellulær omsætning i pattedyrs udvikling og efterfølgende gennem hele livet. Disse oplysninger åbner også nye muligheder for terapeutisk intervention i human proliferative sygdomstilstande herunder cancer

Henvisning:. Ahmed SU, Milner J (2009) Basal Cancer Cell Survival Involverer JNK2 Undertrykkelse af en roman JNK1 /c-Jun /Bcl -3 Apoptotisk Network. PLoS ONE 4 (10): e7305. doi: 10,1371 /journal.pone.0007305

Redaktør: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: August 10, 2009; Accepteret: September 7, 2009; Udgivet: 6. oktober, 2009

Copyright: © 2009 Ahmed, Milner. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev understøttet af en Yorkshire Cancer Research core forskningsprogram pris til JM. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

c-jun N-terminale kinaser (JNK’erne) er medlemmer af den mitogenaktiverede proteinkinasefamilie (MAP-kinaser, MAPK’er) og aktiveres som reaktion på cellulært stress [1], [2]. Som reaktion på stress JNK1 og JNK2 aktiveres via dobbelt phosphorylering af T183 og Y185 ved MAPK kinaser (MAPKK), specielt MKK4 og MKK7 [3], [4]. MAPK’er og MAPKKs indgår i en signaltransduktion super-familie, der omfatter de ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK’er) og p38 MAPK. Funktionerne af JNK1 og JNK2 bestemmes af celletypen og af arten af ​​den stress der er ansvarlig for deres aktivering. Indledende studier identificeret JNK’erne ved deres evne til at phosphorylere den N-terminale ende af c-Jun, et medlem af den aktiverende protein 1 (AP-1) transkriptionsfaktor familie [5]. Efterfølgende JNK’erne blev vist at phosphorylere og regulere aktiviteten af ​​andre AP-1-proteiner såvel som yderligere proteiner involveret i celleproliferation og apoptose, herunder p53, c-myc, Bcl-2 og Bim [2], [6].

AP-1 faktorer er en gruppe af strukturelt og funktionelt relaterede medlemmer af jun-protein familien (c-jun, JunB og Jund) og Fos proteinfamilien (c-Fos, FosB, fra-1 og fra-1) [7]. Dimerisering inden for disse familiemedlemmer danner en AP-1 transkriptionsfaktor og den relative forekomst af individuelle AP-1 underenheder og dimer sammensætning er vigtige faktorer, der bestemmer celle skæbne. Repertoiret af AP-1 dimer sammensætning tillader skræddersyning af en AP-1-medieret respons af individuelle celletyper til en given stimulus. Post-translationel modifikation og protein omsætning er to mekanismer til regulering AP-1-aktivitet. For eksempel, som reaktion på stress transaktiveringspotentialet af c-Jun aktiveres ved JNK-medieret N-terminal-phosphorylering [8], [9], mens stabiliteten af ​​c-Jun-proteinet er nedreguleret via GSK-3-medieret C-terminale phosphorylering som er rettet mod c-Jun til ubiquitinylation og nedbrydning via E3 ligase Fbw7 [10].

en vigtig aktivator af JNK apoptosecyklus er tumornekrosefaktor α (TNFa), et pro-inflammatorisk cytokin som regulerer celleoverlevelse via fremme enten celleproliferation eller apoptose [11]. TNFa i indgreb med dens trimer receptor, TNFR1, ved den ydre overflade af cellemembranen. TNF /TNFR1 interaktion resulterer i dannelsen af ​​et intracellulært heterogen proteinkompleks (kompleks 1) ved cytoplasmatiske hale af TNFR1. På sin side fører dette kompleks til aktivering af JNK- og også af IKB kinase (IKK). Elegant undersøgelser

in vitro

in vivo

har vist, at i hepatocytter udsat for TNF, aktiveret JNK1 phosphorylerer og aktiverer E3 ubiquitinligase ITCH [1], [12]. Aktiveret ITCH inducerer ubiquitinylation og nedbrydning af cFLIP (cellulære FLICE-hæmmende protein) som ellers specifikt hæmmer aktiveringen af ​​pro-caspase 8 (også kaldet FLICE). Caspase 8 aktivering resulterer i apoptose [1], [10]. Denne pro-apoptosecyklus er opvejes af NFKB som opregulerer c-FLIP udtryk og dermed hæmmer pro-caspase 8 aktivering og apoptose [13].

NFKB er en transskription faktor sammensat af homo- eller heterodimerer af medlemmer af Rel familie af proteiner, herunder p65 (RelA), RelB, c-Rel, P50 og P52 (revideret i [14]. Transskription aktivering domæner er fraværende i P50 og P52, der således behov for at danne heterodimerer for at transaktivere målrette gener. Den vigtigste samling er en heterodimer af p65-p50, men forskellige dimer kompositioner dannes også. NFKB er underlagt regulering af protein-protein interaktioner med IKB proteiner. kBa og IκBβ fortrinsvis målrette p65-P50 heterodimerer. Phosphorylering af IKB af IKB kinaser udløser IKB-nedbrydning med frigivelse af dimert NFKB der translokerer til kernen og regulerer genekspression. Bcl-3 er en usædvanlig IKB som fortrinsvis binder p50-p50 og p52-p52 NFKB homodimerer [15], [16]. Bcl-3 er yderligere skelnes fra andre IKB proteiner i, at det kan lokaliseres til kernen, er det ikke nedbrydes ved aktivering af NFKB og det besidder syv snarere end seks, ankyrin gentagne domæner. Kernelokalisering af Bcl-3 er forenelig med dens evne til at danne et ternært kompleks med DNA-bundne p50: P50 homodimerer af NFKB, og også for at hjælpe optagelsen af ​​p50 ind i kernen (se [17] og referencer deri). Bcl-3 blev først beskrevet i kronisk lymfatisk leukæmi [18] og den betragtes som en putativ oncoprotein.

Ud over deres roller i stress respons JNK1 og JNK2 også fungere under basal, ikke-stress betingelser som fremgår af vævsspecifikke abnormiteter observeret i JNK1 – /- og JNK2 – /- mus. F.eks JNK1 – /- mus udviser nedsat T-celledifferentiering og defekte immunitet [19]. Vigtigere JNK1 – /- mus også udvikle spontane intestinale tumorer, hvilket indikerer, JNK1 fungerer som en tumorsuppressor for denne vævstype [20]. Men mekanismerne i JNK1 og JNK2 fungerer under basale, fysiologiske forhold er dårligt forstået.

For at undersøge de enkelte roller JNK1 og JNK2 i humane epitelceller under basale betingelser, vi ansat en kombination af (i) RNAi induceret i fravær af påført belastning, (ii) gen knock-out cellelinier, og (iii) eksogent gen ekspression. I en række humane cellelinier opdagede vi, at JNK1 er aktivt pro-apoptotiske men konstitutivt inhiberes ved tilstedeværelsen af ​​JNK2 i cancerceller. Denne effekt blev ikke observeret i ikke-kræftceller. Co-tavshed eksperimenter viste, at disse basale, modsatrettede pro- og anti-apoptotiske funktioner JNK1 og JNK2 er stort set uafhængig af up-stream kinaser MKK4 og MKK7. Dette var konsistent med mangel på mærkbar ændring i JNK1 phosphorylering trods JNK1-afhængig apoptose efter udtømning af JNK2. Yderligere forsøg viste, at det basale JNK1 pro-apoptotiske vej involverer c-Jun plus komponenter af TNFa-responsiv MAP kinase pathway kombineret med NFKB-vejen via c-Jun-medieret nedregulering af Bcl-3. Således den basale regulering af cancer celleoverlevelse synes at være afhængig af de modstående funktioner JNK2 /Bcl-3 (pro-overlevelse) og JNK1 /c-Jun (pro-apoptotisk) og at være under konstitutiv kontrol af JNK2.

Resultater

Selektiv knock-down af JNK2 øger JNK1 udtryk

for RNAi vi ansat syntetiske siRNA’er under betingelser som tidligere påvist at give effektiv knock-down af target mRNA uden aktivering af p53 cellulære stressrespons [21], [22]. RNAi kontroller inkluderet BCR-ABL siRNA, som ikke har nogen mRNA target i epitelceller og derfor tjener som en ikke-funktionel siRNA kontrol, og lamin A /C siRNA, som er rettet mod lamin A /C mRNA og tjener som en funktionel siRNA kontrol (Fremgangsmåder ). Selektiv knock-down af JNK1 og JNK2 mRNA blev gengivet med to forskellige siRNAs for hvert mål (Metoder og fig. S1). Effektiviteten af ​​mRNA-knockdown blev bestemt ved kvantitativ PCR og var ens for både JNK1 og JNK2 (-75% reduktion;. Se figur 1A til JNK1-mRNA-niveauer). RNAi-induceret nedregulering af lamin A /C eller JNK1 inducerede ikke nogen ændring i p53 eller p21

WAF1, en p53-afhængig målgen (fig. 1B til JNK1 siRNA og fig. S2 for lamin A /C siRNA) , hvilket bekræfter, at betingelserne i RNAi

per se

ikke indlede en p53 stress respons. Men JNK2 silencing resulterede i en -3 gange stigning i p53-protein (fig. 1B), hvilket antyder, at JNK2 direkte eller indirekte regulerer omsætning af p53-protein. Dette er i overensstemmelse med den rapport, JNK’erne kan regulere den basale omsætning af p53 [23]. Interessant, co-nedregulering af JNK1 med JNK2 ophævet stigningen i p53 (fig. 1B), hvilket indebærer, at JNK1 og JNK2 udøve koordinerede virkninger på omsætningen af ​​p53.

(A) JNK1 mRNA-niveauer, og ( B) JNK1, JNK2, og også p53 og p21 proteinniveauer bestemmes 48 timer efter transfektion med JNK1- og JNK2-siRNA’er som indikeret (fremgangsmåderne). (C) Fase kontrast billeder af HCT116 celler 48 timer efter transfektion med JNK1- og JNK2-siRNA’er. (D) Apoptose bestemt ved annexin V mærkning af siRNA-behandlede celler i forhold til ubehandlede kontroller i en række humane cellelinjer (Methods. Bemærk: apoptose resultater er repræsentative for mindst tre gentagne forsøg, medmindre fejlsøjler er inkluderet for gentagelse analyser af en enkelt eksperiment). (E) Caspase 8 og dets spaltningsprodukter, aktiverede caspase 7 og effektor caspase 3 efter RNAi-medieret inaktivering af JNK1 og JNK2 som angivet. Actin = lastning kontroller. HCT116 p53 + /+ og HCT116 p53 – /- er isogene kloner af humane HCT116 kolorektal cancer celler (metoder)

uventet i HCT116 kolorektal kræftceller JNK2 knock-down konsekvent resulterede i en ca. 50%. stigning i JNK1 mRNA-niveauer og et -3 gange stigning i JNK1 proteinniveauer (fig. 1A og 1B). Lignende resultater for JNK1 mRNA blev opnået i isogene HCT116 p53

+ /+ og HCT116 p53

– /- celler (. Figur 1A og 1B), hvilket indikerer, at virkningen er p53-uafhængig. Således i HCT116-celler, tilstedeværelsen af ​​JNK2 direkte eller indirekte undertrykker basale JNK1 ekspressionsniveauer.

JNK2 knock-down inducerer apoptose

Knock-down af JNK2 resulterede i apoptose i en række cancer cellelinjer, herunder HCT116 celler (fig. 1C og 1D). Apoptose blev bestemt ved annexin V farvning (metoder) og involverede pro-caspase 8 aktivering og effektor caspaser 3 og 7 (fig. 1E). Denne apoptotiske effekt af JNK2 udtømning var uafhængig af p53 som vist ved HCT116 p53 – /- celler (. Fig 1C og 1D). I ikke-kræftceller har JNK2 lyddæmpning ikke inducere apoptose (ARPE19 og MCF10A epitelceller, og WI-38 fibroblaster) trods effektiv JNK2 mRNA knock-down (fig. 1D og data ikke vist). I modsætning til JNK2 lyddæmpning, har nedregulering af JNK1 ikke påvirke levedygtigheden i nogen af ​​de testede (fig. 1C og 1D) cellelinier. Samlet indikerer disse resultater, at JNK2, men ikke JNK1, er afgørende for basal levedygtighed i en række humane cancercellelinier, herunder MCF7 brystcancer epitelceller, men er undværlig for basal levedygtighed af ikke-cancerceller, herunder MCF10A breast epitelceller.

Apoptose er JNK1-afhængig

Vi næste co-lyddæmpet JNK1 med JNK2 for at undersøge deres funktionelle kobling i reguleringen af ​​kræft celle overlevelse. I alle tilfælde, hvor JNK2 silencing induceret apoptose fandt vi, at co-silencing JNK1 med JNK2 reddet JNK2-fattige celler fra apoptose (fig. 1D). konkluderer derfor vi, at JNK1 og JNK2 counter-balance hinanden i vedligeholdelse af kræftcellen levedygtighed, og at JNK2 konstitutivt undertrykker JNK1-medieret apoptose under basale betingelser.

JNK1-afhængig apoptose er uafhængig af et forstærket JNK1 S63 /73 phosphorylering

ovenstående resultater indikerer, at JNK1 primes at inducere apoptose i humane epitelcancerceller men konstitutivt undertrykt af JNK2. Både JNK1 og JNK2 er nedstrøms mediatorer af MAP-kinase apoptosecyklus og aktiveres som reaktion på stress ved MKK4 og /eller MKK7 fosforylering på T183 /Y185 (Indledning). Vi næste sammenlignet JNK1 og JNK2 phosphorylering under basal (RNAi) og stress-induceret (UV eller TNF) betingelser.

Som forventet UV-bestråling induceret stærk fosforylering på rester T183 /Y185 både JNK1 og JNK2 proteiner i HCT116 celler (fig. 2A). Tilsvarende behandling af HCT116 celler med TNFa inducerede også JNK1 og JNK2 phosphorylering på T183 /Y185 (fig. 2B, øvre panel). I dette sidstnævnte tilfælde JNK1 phosphorylering dominerede løbet JNK2 phosphorylering. Disse resultater viser klart phosphorylering af JNK1 og JNK2 som reaktion på genotoksisk stress (UV) og receptor-medieret stress (TNFa) i HCT116-celler. Både UV-bestråling og TNF-induceret apoptose (data ikke vist)

(A) Sammenligning af JNK1 /JNK2 fosforylering status i kontrol, JNK2-tavshed og efter UV-bestråling (HCT116 celler; Metoder).. p-JNK1 = phosphoryleret JNK1, pJNK2 = phosphoryleret JNK2 (pile). (B) Virkninger af TNFa på phosphorylering status JNK1, JNK2 og c-Jun. (C) Co-lyddæmpende c-Jun med JNK2 redder HCT116 celler fra apoptose (annexin V mærkning Metoder). (D) JNK1, JNK2 og c-Jun-proteinniveauer 48 timer efter RNAi-medieret inaktivering af JNK2 og c-Jun. P53 og p21 proteinniveauer er også vist. (E) c-Jun mRNA niveauer efter JNK1 og JNK2 lyddæmpning. (F) Fold stigning i c-Jun mRNA-niveauer i HCT116 celler sammenlignet med ARPE19 celler 48 timer efter JNK2 lyddæmpning. (G) Knockdown af c-Jun mRNA og protein niveauer i HCT116 p53 + /+ celler efter c-Jun siRNA behandling.

Under basale betingelser, når JNK1 var aktivt pro-apoptotiske efter JNK2 lyddæmpning, der var nogen mærkbar stigning i JNK1 T183 /Y185 fosforylering (fig. 2A, sammenligne kontrol vognbane med JNK2 siRNA bane). Dette er i skarp kontrast til stress-inducerede betingelser (figur 2A;. Sammenligne JNK2 siRNA lane med UV bane). udlede vi således at JNK1 er i stand til at fremme apoptose i fravær af ‘aktiverende’ T183 /Y185 phosphoryleringer, der karakteristisk induceres som reaktion på stress. Co-tavshed up-stream kinaser MKK4 eller MKK 7 med JNK2 kun delvist reddet JNK1-afhængig apoptose (fig. S3), yderligere underbygger evne JNK1 til at fremme apoptose i fraværet af forbedrede T183 /Y185 phosphoryleringer.

Vi konkluderer, at, under basale betingelser, kan JNK1 aktivt fremme apoptose uden at undergå forbedret T183 /Y185 fosforylering karakteristisk for den cellulære stress respons. Denne basale pro-apoptotiske funktion JNK1 er tydelig i humane epitelcancerceller (men ikke i ikke-cancerceller) og konstitutivt inhiberes af endogen JNK2. For at undersøge den basale apoptosecyklus under JNK1 kontrol vi næste gennemført en række co-tavshed eksperimenter til formål at identificere væsentlige pro-apoptotiske mediatorer forbundet med JNK1-afhængige apoptose efter JNK2 lyddæmpning.

c-Jun er en afgørende mediator af basal apoptose og er underlagt modsatrettede effekter af JNK1 og JNK2

for at spørge, om c-Jun er nødvendig for apoptose under basale betingelser, vi samarbejdede lyddæmpet c-Jun med JNK2 (figur 2;. effektiviteten af c-Jun-mRNA knockdown er vist i fig. 2G). Resultaterne viser tydeligt, at c-Jun co-nedregulering redder JNK2-lyddæmpet HCT116-celler fra apoptose således identificere c-Jun som en væsentlig mediator af apoptose omfattet JNK2 undertrykkelse under basale betingelser (fig. 2C).

c-Jun-proteinet akkumuleret til høje niveauer efter JNK2 silencing i HCT116-celler (figur 2D;. forøget c-Jun blev også observeret i RKO og LoVo celler efter JNK2 lyddæmpning, ikke vist) parallelt med en stigning i c-Jun-mRNA (fig. 2E). Interessant nok blev denne virkning afskaffes ved JNK1 blev co-lyddæmpet med JNK2 (fig. 3A til c-Jun-proteinet og fig. 2E for c-Jun-mRNA), hvilket indikerer, at opregulering af c-Jun er afhængig af fortsatte tilstedeværelse af JNK1 . JNK1 silencing alene forårsagede et fald i c-Jun-mRNA og protein (fig. 2E og fig. S4). Disse kombinerede observationer indikerer, at JNK1 og JNK2 udøver modsatrettede virkninger på c-Jun-ekspression og at JNK1 er nødvendig for opretholdelse af basale c-Jun-mRNA og protein ekspressionsniveauer, mens JNK2 konstitutivt undertrykker c-Jun-mRNA og protein-ekspressionsniveauer. Lignende resultater blev observeret i HCT116 p53

+ /+ og HCT116 p53

– /- celler (se for eksempel figur 2E.). Interessant forøgede c-Jun-mRNA-niveauer blev ikke observeret i JNK2-lyddæmpet ARPE19 celler (Fig. 2F) stemte overens med manglen af ​​apoptose i disse celler (fig. 1D).

(A) Samlet c-Jun-proteinet og phosphoryleringer på S63, S73 og T91 følgende enten UV-bestråling (højre bane) eller JNK1 og JNK2 RNAi-induceret nedregulering. (B) Skematisk viser

c-Jun

amplikonet anvendes til påvisning c-Jun på promotoren. (C) Total og phosphorylerede former for c-Jun bundet ved C-Jun-promotor detekteret ved chromatin immunoprecipitation (chip) med c-Jun og c-Jun phospho-specifikke antistoffer. Histogram viser fold-berigelse i forhold til IgG kontroller (metoder).

Vores resultater identificerer modsatrettede effekter af JNK1 og JNK2 på c-Jun. I denne henseende adskiller de sig fra iagttagelser gjort under anvendelse af en “kemisk genetik ’tilgang, hvor den katalytiske ATP-bindende lomme af JNK2 blev udvidet ved mutation [2]. Konklusionen fra denne sidstnævnte tilgang var, at JNK1 og JNK2 både positivt regulere c-Jun udtryk. Det er imidlertid muligt, at udvidelse af ATP-bindende lomme af JNK2 kan forstyrre den rumlige molekylære organisation af den tilstødende β-streng-lignende område af JNK2 protein. Da denne β-streng-lignende domæne er vigtig for JNK2 protein-protein interaktioner foreslår vi, at lokaliseret forstyrrelse på dette site kan kompromittere de bindende egenskaber for JNK2 protein til sit mål substrater. Dette kan påvirke funktionen af ​​mutant JNK2 på måder ud over de forventede effekter på molekylært adgang til den udvidede ATP bindende lomme af JNK2

En anden undersøgelse, der sammenligner murine fibroblaster afledt af JNK1 -. /- Og JNK2 – /- mus angivet, at JNK1 og JNK2 kan fungere som modsatte regulatorer af c-Jun [3]. Vore egne resultater, under basale betingelser, er i overensstemmelse med denne rapport og viser, at i HCT116 celler (i) JNK2 lyddæmpende resulterer i opregulering af c-Jun-mRNA ledsaget markant akkumulering af c-Jun-proteinet, og (ii) opregulering af c-Jun under disse betingelser er afhængig af JNK1.

opregulering af JNK1 i JNK2-depleterede celler er uafhængig af c-Jun

Da basal opregulering af c-Jun (i JNK2-udtømte celler) kræver JNK1 (se ovenfor) vi spekulerede på, hvis c-jun på sin side, er nødvendig for opregulering af JNK1-protein efter JNK2 silencing (fig. 1B). Men stigningen i JNK1 konsekvent overholdes i JNK2-lyddæmpet celler var upåvirket af co-lyddæmpende c-Jun med JNK2 (figur 2D;. Øverste panel). Dette indikerer, at øget mRNA og protein ekspression af JNK1 følgende JNK2 udtømning er uafhængig af c-Jun.

Hypo-phosphoryleret c-Jun binder c-Jun-promotor

Stress-induceret S63 /S73 phosphorylering af c-jun ved JNK kinaser frigiver c-jun fra en hæmmende kompleks således at c-jun til at binde og transaktivere mål initiativtagere [24]. Stressinduceret phosphorylering af c-Jun i HCT116-celler behandlet med UV-bestråling er vist i fig. 3A. Men selv om vi observeret høj akkumulering af c-Jun protein efter JNK2 lyddæmpning (figur 3A;. JNK2 siRNA bane) var uafhængig af øget N-terminal fosforylering på S63, S73 eller S91 (figur 3A).

JNK2 silencing inducerer en markant stigning i c-Jun-mRNA-niveauer (se ovenfor, fig. 2E). At spørge, om øgede c-Jun-transkripter henføres, i det mindste delvist, til en positiv auto-regulerende feed-back loop udførte vi chromatin immunoprecipitation (chip) til c-Jun /c-Jun promotorkomplekser (fig. 3B og 3C) . I ubehandlede HCT116 celler var c-Jun udetekterbar på c-Jun-promotor (fig. 3C, kontroller). Efter UV-bestråling c-Jun blev phosphoryleret ved S63 og S73 (fig. 3A) og den phosphorylerede protein blev bundet ved C-Jun-promotor som angivet ved chipanalyse anvendelse af anti-phospho-T63 /73 c-Jun-antistoffer (fig. 3C). I JNK2-fattige celler, under basale betingelser, ingen ændring i c-Jun T63 /73 phosphorylering var klart i forhold til kontrollerne (fig. 3A). Alligevel c-Jun i disse celler var bundet til c-Jun-promotor (fig. 3C). Manglende phosphorylering af kromatin-bundne c-Jun blev bekræftet ved mangel på reaktivitet med anti-phospho-T63 /73 c-Jun-antistoffer (figur 3C. Sammenligne prøver fra UV-bestrålede celler med JNK2-lyddæmpet celler). Således konkluderer vi, at S63 /73 hypo-phosphoryleret c-Jun binder sig til sin egen promotor efter JNK2 udtømning og forventes at bidrage til de høje c-Jun mRNA ekspression niveauer (-9-dobling i forhold til kontrol, se fig. 2E) induceret under disse basale betingelser.

c-Jun-protein akkumulering korrelerer med tab af phosphorylering på S243

Det er muligt, at c-Jun holdes ved lave niveauer i HCT116 celler, lavere end observeret for ikke -cancer ARPE19 celler (data ikke vist), via kontinuerlig c-Jun proteinnedbrydning. Nedbrydning af c-Jun involverer C-terminal-phosphorylering ved S243, som primer c-Jun for GSK3-medieret phosphorylering på T239. Dette genererer et bindingssted for Fbw7 E3 ubiquitin ligase, hvilket resulterer i polyubiquitinylation og c-Jun-nedbrydning [10]. I vores nuværende studie bemærkede vi, at JNK1 lyddæmpning forårsagede en svag men reproducerbar forøgelse i c-Jun S243P (se figur 4B-4D;. Kontrol bane cp JNK1 siRNA lane S243P immunblots). Omvendt JNK2 tavshed reproducerbart forårsaget reducerede niveauer af c-Jun 243P, undertiden målbart trods massiv ophobning af total protein (figur 4B-4D;. Kontrol bane cp JNK2 siRNA for S243P immunblots). Således JNK1 og JNK2 udøve modsatrettede virkninger på c-Jun fosforylering på S243, en modifikation forbundet med de-stabilisering af c-Jun-protein.

(A) viser skematisk steder af phosphorylering af c-Jun by JNK, GSK -3 og ERK, samt deres respektive funktionelle konsekvenser. Bemærk, at S243P er en forudsætning for T239 fosforylering (angivet med buet pil). (B) Immunoblots viser virkninger af JNK1, JNK2 og GSK3 lyddæmpning, alene og i kombinationer, på et panel af HCT116 cellulære proteiner. (C) og (D) Immunoblots efter kombinatorisk lyddæmpning af JNK1 og JNK2 med Fbw7 og ERK. (E) Vigtige pro-apoptotiske mellemprodukter bestemt ved co-nedregulering med JNK2. (F) Apoptose efter JNK2 lyddæmpning under basale betingelser er uafhængig af Bax som det fremgår af Bax +/- og Bax – /-. HCT116 isogene kloner

GSK3, ERK, Fbw7 og ITCH er væsentlige mediatorer af basal JNK1-afhængig apoptose

i en ny serie co-tavshed eksperimenter vi vise, at kinaser GSK3, ERK, og ubiquitin 3 ligase Fbw7 er også vigtige mediatorer af JNK1-afhængig apoptose i JNK2-udtømte celler (fig. 4E). Men ingen af ​​disse komponenter syntes at ramme mod S243 phosphorylering eller akkumulering af c-Jun-proteinet (figur 4B, 4C og 4D,. Lanes GSK3, Fbw7 og ERK henholdsvis). Dette var uventet, eftersom, som reaktion på stress, er alle tre blevet forbundet med c-Jun nedbrydning via S239 og S243 phosphorylering (ERK og GSK3 henholdsvis) og ubiquitinmedieret nedbrydning (Fbw7) [10], [25], [26] . Det lader til, at, under basale betingelser, GSK3, ERK og Fbw7 funktion som væsentlige mediatorer af apoptose via substrater andre end c-Jun.

Bax og CKII kan undværes for den basale JNK1 /JNK2 apoptosecyklus

Efter stress Bax er et pro-apoptotisk formidler af JNK-induceret apoptose [27], [28]. At spørge, om Bax også er nødvendig for den basale JNK1 /JNK2-regulerede apoptosecyklus vi brugte isogen Bax +/- og Bax – /- HCT116 celler [2]. JNK2 silencing induceret apoptose i både HCT116 Bax

+/- og HCT116 Bax

– /- celler (Fig 4F.), Hvilket indikerer, at Bax ikke er nødvendig for apoptose under disse basale betingelser. Co-silencing CKII, en formodet kinase for c-Jun [3], heller ikke redde JNK2-fattige HCT116 celler fra apoptose (fig. 4E). Således både Bax og CKII synes undværes for den basale JNK1 /JNK2 apoptosecyklus.

Samspil mellem c-Jun og ITCH

pro-apoptosecyklus induceret af TNF kulminerer i phosphoryleret JNK1-afhængig aktivering af ITCH, nedbrydning af c-FLIP og caspase 8 aktivering (se indledning). Her viser vi, at ITCH er også et vigtigt pro-apoptotisk mediator reguleret af JNK1 /JNK2 under basale betingelser, og at co-silencing ITCH med JNK2 redder celler fra apoptose (fig. 5A og 5B).

(A) og (B) Protein og apoptotiske niveauer observeret efter ITCH og JNK2 silencing i HCT116-celler. (C) Komplekser af endogene ITCH-c-Jun proteiner detekteret før JNK2 lyddæmpning mistes efter JNK2 udtynding.

For yderligere at undersøge den pro-apoptotiske rolle ITCH under basale betingelser, vi udførte immunopræcipitation /immunoblot analyse for endogene komplekser af ITCH-c-Jun før og efter RNAi-medieret silencing af JNK2 (fig. 5C). Betydeligt, ITCH-c-Jun-komplekser var påviselige under kontrol betingelser, men disse komplekser blev tabt efter JNK2 silencing (fig. 5C).

Apoptose forløber via c-FLIP og caspase 8

Køben- silencing caspase 8 med JNK2 reddede celler fra apoptose (fig. 4E). Denne virkning blev begrænset til basale betingelser siden caspase 8 RNAi undladt at redde apoptose efter UV-bestråling (data ikke vist). c-FLIP lyddæmpning alene induceret apoptose i HCT116 celler [29]. Co-silencing c-Jun, GSK3, eller Fbw7 med c-FLIP undladt at redde celler fra apoptose (fig. 6A), hvilket indikerer, at hver af disse pro-apoptotiske mellemprodukter fungere opstrøms af c-FLIP (fig. 7A-skematiske ). Således basal og stressinducerede apoptotisk MAP-kinase pathways konvergerer ved niveauet af c-flip. Som forventet, co-silencing caspase 8 med c-FLIP reddet celler fra apoptose (fig. 6a og 6b).

(A) Niveauer af apoptose observeret efter co-dæmpning af c-FLIP med pro-apoptotiske mediatorer . (B) Protein niveauer viser pro-caspase 8 spaltning og c-Jun akkumulering efter c-FLIP tømt af RNAi.

(A) Skematisk viser vildtype c-Jun (vægt-c-Jun) og ikke-phosphorylatable mutant c-Jun-konstruktioner. (B) Annexin V måling af apoptose efter overekspression af vildtype-c-Jun eller mut-c-Jun som angivet. (C) Immunoblots viser total og phosphoryleret c-Jun efter overekspression, vist SIRT1 loading kontrol. (D) Niveauer af apoptose efter kombineret siRNA behandling i nærvær eller fravær af ikke-mål mut-c-Jun, (se materialer og metoder).

Over-ekspression af exogene c-Jun inducerer apoptose

Vi næste stillede hvis høje ekspression af c-Jun alene er tilstrækkelig til at inducere apoptose. Over-ekspression af exogent vildtype c-Jun-induceret apoptose i HCT116 cancerceller (fig. 7A og 7B). Vigtigere, over-ekspression af et c-Jun-phosphorylering mutant, hvori S63, S73, T91 og T93 er alle muteret til alanin, også induceret apoptose således igen håndhæve evidens for pro-apoptotiske funktioner af hypo-phosphoryleret c-Jun (Fig . 7A og 7B). Bemærk, at exogen ekspression af et andet protein, SIRT1, ikke inducerer apoptose i HCT116-celler [22] viser, at de foreliggende resultater er specifikke for c-Jun. Proteinekspression fra c-Jun-konstruktioner og phosphorylering status viser fosforylering på alle lokaliteter undersøgt på vildtype c-Jun (fig. 7C). Dette er tegn på cellulær stress som reaktion på exogent gen overekspression. Bemærk at dette er i modsætning til den vedvarende c-Jun hypo-phosphoryleret status efter RNAi-medieret gen-nedregulering under de basale betingelser, der anvendes i hele dette arbejde (se for eksempel fig. 3A). C-Jun-fosforylering mutant manglede reaktivitet med anti-phospho-S63, S73 og T91-antistoffer som forventet (antistof til phosphoserin 93 var ikke tilgængelig). Selv om både mutante og vildtype exogene c-Jun-proteinerne blev phosphoryleret ved T239 og S243 (fig. 7C) mener vi, at dette var ikke-essentielle for induktion af apoptose siden endogent c-Jun er påkrævet for apoptose trods manglende C-terminal-phosphorylering (se for eksempel fig. 4B-4D følgende JNK2 silencing). Betydeligt, over-ekspression af exogent c-Jun havde ikke inducere apoptose i ikke-cancer ARPE19 celler (Fig. 7B). Disse overordnede observationer yderligere re-håndhæve vores konklusioner (i) at forhøjede niveauer af hypo-phosphoryleret c-Jun er pro-apoptotisk i HCT116 kræftceller, og (ii), at effekten er specifik for cancerceller (HCT116) og er ikke observeret