PLoS ONE: Transkriptionel og Epigenetisk forordning af KIF14 Overekspression i æggestokkene Cancer

Abstrakt

KIF14

(kinesin familiemedlem 14) er en mitotisk kinesin og en vigtig onkogen i flere kræftformer. Tumor

KIF14

ekspressionsniveauerne uafhængigt prædiktive for dårligt resultat, og i kræftceller KIF14 kan modulere metastatisk adfærd ved at opretholde passende niveauer for celleadhæsion og migration proteiner ved cellemembranen. KIF14 er således en spændende potentiale terapeutisk mål. Forståelse KIF14 regulering i cancerceller er afgørende for udviklingen af ​​effektive og selektive behandlinger til at blokere sin tumorigen funktion (er). Vi har tidligere fastslået, at tæt på 30% af serøse æggestokkene kræftformer (OvCa tumorer) udviser lavt niveau genomisk gevinst, hvilket indikerer en mekanisme af

KIF14

overekspression i tumorer. Vi rapporterer nu om transkriptionel og epigenetisk regulering af

KIF14

. Gennem promotor deletionsanalyser, vi identificeret en

cis

reguleringsmyndigheder region, der indeholder bindingssteder for Sp1, HSF1 og YY1. siRNA-medieret knockdown af disse transkriptionsfaktorer demonstrerede endogene regulering af

KIF14

overekspression af

Sp1

YY1

, men ikke

HSF1

. CHIP eksperimenter bekræftede en berigelse af både SP1 og YY1 binding til den endogene KIF14 promoter i OvCa cellelinier med høj

KIF14

udtryk. En stærk korrelation blev set i primære serøse OvCa tumorer mellem

Sp1

,

YY1

KIF14

udtryk, yderligere beviser for, at disse transkriptionsfaktorer er vigtige aktører i

KIF14

overekspression. Hypometylering mønstre blev observeret i primære serøse OvCa tumorer, hvilket tyder på en mindre rolle for promotor methylering i kontrollen af ​​

KIF14

genekspression. miRNA udtryk analyse fastslået, at miR-93, miR-144 og miR-382 havde signifikant lavere niveauer af ekspression i primære serøse OvCa tumorer end normale væv; behandling af en OvCa cellelinje med miRNA efterligner og inhibitorer specifikt moduleret

KIF14

mRNA-niveauer, der peger på potentielle nye mekanismer

KIF14

overekspression i primære tumorer. Vores resultater afslører flere mekanismer i KIF14 opregulering i kræftceller, der tilbyder nye mål for terapeutiske indgreb for at reducere KIF14 i tumorer, der sigter mod en forbedret prognose

Henvisning:. Thériault BL, Basavarajappa HD, Lim H, Pajovic S, Gallie BL, Corson TW (2014) Transkriptionel og Epigenetisk forordning af

KIF14

overekspression i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (3): e91540. doi: 10,1371 /journal.pone.0091540

Redaktør: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrig

Modtaget: Juni 21, 2013; Accepteret: 13 februar 2014; Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Thériault et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af det amerikanske forsvarsministerium Karriereudvikling Award; bevilge # OC080083, og Marsha Rivkin æggestokkene Cancer Center Scientific Scholar Award. Dette arbejde blev også støttet delvist af Indiana Klinisk og Translational Sciences Institute finansieret, dels af de amerikanske National Institutes of Health, National Center for Fremme Translationelle Sciences, Klinisk og Translational Sciences Award (TR000163, TWC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

KIF14

blev først identificeret som et onkogen og en bidragyder til malign transformation i børnekræft retinoblastoma [1]. Lokaliseret på kromosom 1q32.1, genomisk gevinst på

KIF14

forekommer hos op til 50% af retinoblastomer [1] – [3]. Vores gruppe og andre har tidligere vist, at KIF14 protein og mRNA overudtrykt i flere cancertyper inklusiv ovariecancere (OvCa tumorer) [4] – [10]. Vi rapporterede også, at samlede resultat af serøse OvCa patienter kan forudsiges på grundlag af

KIF14

mRNA-ekspressionsniveauer i deres primære tumorer. Yderligere analyse af disse prøver viste, at ekspressionen af ​​

KIF14

mRNA og protein overskrider niveauerne forventede baseret på kopien nummer gevinst alene, hvilket tyder på en opregulering i transskriptionskontrol i kræftceller versus deres respektive normale kolleger.

Der er i øjeblikket 45 menneskelige kinesiner klassificeret i 14 forskellige familier. Hos mennesker

KIF14

er et mitotisk kinesin tilhører den N-3 familien. Selv om dens cellulære funktion er endnu ikke fuldt belyst,

KIF14

spiller en afgørende rolle i færdiggørelsen af ​​cytokinesen, og kan også fungere i den primære cilium [11]. Det interagerer med protein-regulator af cytokinese en (PRC1) og Citronen kinase gennem specifikke domæner til at understøtte korrekt celledeling [12], [13]. Silencing

KIF14

hjælp siRNA inducerer cytokinese svigt resulterer i flerkernede celler, aneuploidi, og apoptose [12]. En midlertidig akkumulering af KIF14 protein observeres i mitotiske celler, i overensstemmelse med dens funktion [12]. Vi har for nylig demonstreret i brystkræft cellelinier, direkte interaktion af KIF14 med Radil, en afgørende mediator af Rap1a-medieret integrin inside-out signalering, derved at styre Radil-Rap1a aktivitet ved cellemembranen og fremme celleadhæsion og migrering [14].

de struktur og funktion af andre kinesiner er ret godt forstået, er langt mindre kendt om deres regulering på DNA-niveau. Et studie beskrevne roller transkriptionsfaktorer Sp1 og E2F1 i henholdsvis aktivering og undertrykker transkriptionen af ​​det humane mitotiske centromeren-associeret kinesin (MCAK) promotor [15]. Ingen undersøgelser er endnu ikke rapporteret om

KIF14

. Forståelse mekanismen for sin genregulering er afgørende, da

KIF14

fremstår som et vigtigt mål i kræftbehandling.

Vi har nu rapporterer identifikation af en formodet

cis

reguleringsmyndigheder region

KIF14

promotor huser bindingssteder for transkriptionsfaktorer

Sp1

,

YY1

HSF1

. Gennem siRNA Knockdown og chip assays, viser vi, at Sp1 og YY1, men ikke HSF1 direkte bindes til

KIF14

promotor og styre endogene

KIF14

niveauer i OvCa cellelinjer. Desuden både

Sp1

YY1

ekspressionsniveauerne korrelerer med

KIF14

mRNA-ekspression i primære serøse OvCa tumorer, viser deres potentielle rolle i at opretholde et højt KIF14 niveauer i OvCa tumorceller . Methylering analyse afslørede, at den menneskelige

KIF14

promotor er i vid udstrækning hypomethylated i OvCa primære tumorer, normale ovarievæv, og cellelinier, hvilket viser, at methylering er usandsynligt at regulere

KIF14

overekspression inden OvCa tumorer. Dog kan en differentieret methylering mønster findes i OvCa tumorer udtrykker meget høj KIF14.

miRNA udtryk analyse af primære OvCa tumorer og cellelinier afslørede tre formodede regulatorer (MIR-93, miR-144 og MIR-382) af

KIF14

udtryk, har dokumenteret, roller i tumorigenese i kræftceller. Vi fastslået, at disse kandidat miRNA direkte kunne modulere

KIF14

mRNA-ekspression, hvilket indikerer deres betydning i at opretholde forhøjede KIF14 tumor niveauer. Vores resultater afsløre en kompleksitet reguleringsmekanismer kørsel

KIF14

overekspression i OvCa tumorer, og understreger betydningen af ​​at forstå

KIF14

regulering til i sidste ende at målrette dette gen for terapeutisk fordel.

Materialer og metoder

Konstruktion af Luciferase Reporter plasmider

Seksten forskellige længder af

KIF14

promotor (548 bp, 966 bp, 1514 bp, 1666 bp, 1787 bp, 1898 bp, 2032 bp, 2150 bp, 2245 bp, 2327 bp, 2366 bp, 2401 bp, 2466 bp, 2536 bp, 2898 bp, 4555 bp) alle dele fælles sekvenser ved deres proximale ende blev amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR) fra genomisk DNA fra sunde retina ved anvendelse KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) (tabel S1). Promoter fragmenter blev subklonet i StrataClone ™ Blunt PCR Kloning Vector pSC-B (Stratagene) og verificeres for korrekt indføring og orientering ved restriktionsfordøjelse. PCR-produktet blev skåret ud under anvendelse Kpn1 /Sma1 restriktionssteder og indsat i pGL3-Basic Vector (Promega) ved supplerende lokaliteter opstrøms for luciferasegenet genererer reporterkonstruktioner pGL3-548, pGL3-966, pGL3-1514, pGL3-1666, pGL3 -1787, pGL3-1898, pGL3-2032, pGL3-2150, pGL3-2245, pGL3-2327, pGL3-2366, pGL3-2401, pGL3-2466, pGL3-2536, pGL3-2898, og pGL3-4555. Sekvenser af alle 16-konstruktioner på linje med reference- sekvenser fra NCBI website. Den pRSV-luciferasereporterplasmid blev venligst stillet til rådighed af Dr. A. Schimmer, Ontario Cancer Institute.

Cell Culture

SKOV3 (en slags gave fra Dr. Mark Nachtigal, University of Manitoba) [ ,,,0],16] og HeLa-celler (ATCC) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin /L-glutamin (P /S /G) (Invitrogen). OvCa 429 celler (Dr. Mark Nachtigal) [16] blev dyrket i alfa-MEM indeholdende 10% FBS og P /S /G. Weri-RB1 retinoblastomceller (positiv kontrol for Sp1-binding) blev dyrket i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) indeholdende 10% FBS (PAA Laboratories), P /S /G, 10 pg /ml insulin og 55 uM β-mercaptoethanol. Cellekulturer blev holdt ved 5% CO

2 med fugtighed i en 37 ° C inkubator. Cellelinie identitet blev bekræftet ved korte tandemgentagelse profilering.

Transfektion af reporterkonstruktioner og siRNA

trypsineret celler blev podet ved en densitet på 5 x 10

4 celler /ml. 24 timer efter podning lige store mængder (0,5 ug) af både reporter og cytomegalovirus-β-galactosidase (pCMV-β-gal, Promega) konstruktioner blev cotransficeret ind i tre eksemplarer plader med 12 brønde under anvendelse af Gene Juice (Novagen). For at evaluere den endogene effekt af transskription faktor knockdown på

KIF14

niveauer, et sæt af 3 siRNAs (Sigma Aldrich) for

HSF1

,

Sp1

, og

YY1

blev transficeret med et beløb på 0,5 nmol i 60 mm skåle. Målsekvenser for hver siRNA er anført i tabel S2. Transfektioner blev udført i tre eksemplarer i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger og gentaget mindst tre gange.

Luciferase og β-galactosidase assay Salg

Celler, som blev cotransficeret med reporter og pCMV-β-gal-konstruktioner blev høstet 24 timer efter transfektion. Cellelysater blev fremstillet og undersøgt for luciferaseaktivitet under anvendelse af Luciferase Assay System (Promega) i overensstemmelse med dens protokol. Luciferaseaktivitet blev normaliseret til p-galactosidase-aktivitet (målt ved hydrolyse af det kolorimetriske substrat ONPG [

O

nitrophenyl β-D-galactopyranosid], Sigma) og udtrykkes som en relativ procentdel af pRSV-Luc kontrol.

kliniske prøver

Tyve-seks friske frosne OvCa tumorprøver, ti friske frosne normale ikke-neoplastiske æggestokke fra patienter, der gennemgår ooforektomi for ikke-onkologiske forhold og fire normale æggelederne epitel væv blev opnået fra universitetet Health Network (UHN) Biobank. Den UHN Research Ethics bestyrelse godkendte studiet af vævsprøver og tilhørende kliniske data (# 08-0884-TE), og alle væv blev indløst med skriftligt informeret samtykke. Kliniske data knyttet til de UHN Biobank prøver blev gennemgået af en gynækologisk onkolog og gynækologisk patolog at sikre dataintegritet og kvalitet, og alle UHN Biobank væv (tilstødende H E farvede objektglas) blev gennemgået af en gynækologisk patolog at sikre prøver indeholdt 80 % tumorceller.

Real-time PCR

Tooghalvfjerds timer efter transfektion med siRNA blev cellelinjer høstet og totalt RNA isoleret ved TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. OvCa tumor og normalt ovarie og tubal epiteliale RNA’er blev også isoleret ved TRIzol-reagens som beskrevet tidligere [8]. Første-streng cDNA blev fremstillet ud fra 1 ug totalt cellulært RNA med 100 uM tilfældige hexamere primere, 20 U RiboLock RNase inhibitor (Fermentas), og 200 U Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i et endeligt volumen på 20 pi. 1 pi syntetiseret cDNA blev tilføjet til 1X TaqMan PCR Master Mix (ABI), og 1X TaqMan Gene Expression Assay primer-probe mix til

KIF14

(Hs00978216_m1),

Sp1

(Hs00916521_m1),

YY1

(Hs00231533_m1), og

HSF1

(Hs01027608_g1). Mean ekspression af tre husholdningsgener blev anvendt som en endogen kontrol:

TBP

(Tata-box-bindende protein, Hs_99999910_m1),

HPRT

(hypoxanthin phosphoribosyltransferase, Hs99999909_m1) og

GAPDH

(glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hs99999905_m1). Tredobbelte Reaktionerne blev udført for hvert gen, og hver prøve, og PCR udført under anvendelse af SDS 7900HT systemet (ABI) som beskrevet [8]. SDS 2.1 software (ABI) blev anvendt til at beregne ΔΔCt relative ekspression værdier, normaliseret til endogene kontrol gener og i forhold til enten vektorkontrol (for cellelinje siRNA transfektioner) eller ekspression af normalt ovarie og tubal epitel vævsprøver (for målinger væv).

Western blot-analyse

Tooghalvfjerds timer efter transfektion siRNA, celler blev høstet og lyseret med puffer indeholdende 20 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1% Triton X-100, og proteaseinhibitorerne aprotinin, leupeptin og phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). Totalt cellulært protein blev kvantificeret ved Bradford-assay (BioRad). 30 ug blev sat på en 4-12% gradient SDS-PAGE færdigstøbte gel (Lonza) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran og blokeret med 5% BLOTTO (BioRad) i Tris-bufret saltvand-0,05% Tween-20 ( TBST). Primære antistoffer mod KIF14 (Bethyl), Sp1, YY1 og HSF1 (Abcam) og β-tubulin (Sigma) var ansat til at detektere endogent protein udtryk. Peberrodsperoxidasemærket sekundære antistoffer (Chemicon) blev påvist under anvendelse af et kemiluminescens-reagens (Denville) og inkuberet med fotografisk film (Denville). målinger Signal intensitet blev beregnet ved hjælp af Photoshop CS3.

chromatin Immunfældning (chip) Indhold

chip assays blev udført med Imprint® chromatin Immunfældning Kit (Sigma) i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev 1 × 10

5-celler blev dyrket, og proteinet-DNA-komplekser tværbundet med 1% formaldehyd (slutkoncentration), efterfulgt af nuklear fraktionering og DNA klipning via sonikering. Immunopræcipitationer blev udført i 90 minutter ved stuetemperatur med antistoffer mod Sp1, YY1, HSF1 (Abcam), RNA polymerase II (positiv kontrol) og IgG (negativ kontrol). Tværbindingerne blev tilbageført, DNA blev ekstraheret og blev anvendt til både endpoint og real time PCR. Endpoint PCR blev udført i 25 pi reaktioner med KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen) og passende udformet primerpar (target promoter sekvens: Fremad: TTA caa tgt gaa GTC TTC gat gta; Reverse: CTC tac TCC, cac ccc gc; RNA Pol II target sekvens: hGAPDH-Fremad: CAA TTC ccc atc TCA GTC gt; hGAPDH-Reverse: tag tag CCG GGC FTT handle tt, 246 bp). PCR-betingelserne var som følger: 95 ° C i 2 min efterfulgt af 40 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 30 sek, annealing ved 58 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek, og dernæst en endelig forlængelsesperiode på 72 ° C i 10 min. Produkter blev visualiseret under anvendelse af agarosegelelektroforese. målinger Signal intensitet blev beregnet ved hjælp af Photoshop CS3. Real time PCR blev udført tre gange ved anvendelse af 1 pi ChIP DNA pr reaktion, sammen med 1X TaqMan Master Mix (ABI), 500 nM af hver primer og 250 nM probe. Primere var Fremad: tga cac CCA CTT CAA CGA gg og Reverse: TCT ctg aat GCT GGA CTC gc, og sonden var cac GCT TTA GCA GAA ccc gag gag, mærket med FAM og ZEN quencher (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA). Reaktioner blev kørt under anvendelse af standardparametre på en ViiA7 instrument (Life Technologies). Ct-værdier blev normaliseret til IgG prøver og relative mængde (RQ) beregnet efter RQ = 2

-ΔCt.

miRNA cDNA syntese og kvantitativ real-time PCR

Total RNA-ekstraktion var udført som beskrevet ovenfor. Et kommercielt tilgængeligt miRNA cDNA-syntese kit (TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) blev anvendt til revers transkribere kandidat- miRNA med specifikke RT-primere (TaqMan® miRNA assays, Applied Biosystems). Sekvensspecifikke assays (TaqMan® real-time PCR assays, Applied Biosystems, tabel S3) blev anvendt til at detektere modne kandidat miRNA fra primær tumor vævsekstrakter.

RNU44

, en lille ikke-kodende RNA med bred og konstant vævsfordeling (Applied Biosystems), blev anvendt som den endogene kontrol. Tredobbelte Reaktionerne blev udført for hvert gen, og hver prøve, og PCR udført under anvendelse af SDS 7900HT systemet (ABI) som beskrevet [8]. SDS 2.1 software (ABI) blev anvendt til at beregne ΔΔCt relative ekspression værdier, normaliseret til endogen kontrol (

RNU44

) og i forhold til ekspression af normalt ovarie og tubal epiteliale vævsprøver (for målinger tumorvæv) eller IOSE celler (for OvCa cellelinjer).

miRNA efterligner og inhibitorer

SKOV3 celler i 12-brønds plader blev transficeret med 50 nM miR93, miR144 og miR382 efterligner eller inhibitorer eller tilsvarende ikke-kodende kontrol efterligner eller inhibitor (Applied Biosystems) under anvendelse af 3 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen) reagens i henhold til fabrikantens anvisninger. Efter 72 timers transfektion blev totalt RNA isoleret og cDNA syntetiseret som beskrevet ovenfor. Ekspressionsniveauer af KIF14 og miRNA af interesse blev analyseret som ovenfor, med qPCR udført under anvendelse af et Applied Biosystems VIIa ™ 7 real time PCR system. Den relative ekspression værdier (RQ) af KIF14 eller miRNA normaliseret til endogene kontrol gener og i forhold til kontrol behandling blev beregnet under anvendelse VIIa ™ 7 version 1.2 software.

Methyleringsanalyse

Genomisk DNA blev isoleret fra primære OvCa tumorvæv og normalt ovarie kontroller som beskrevet tidligere [8]. Genomisk DNA (200 ng) blev modificeret og oprenses under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt bisulfit modifikation kit (Imprint® DNA Modification Kit, Sigma) ifølge producentens instruktioner. En CpG øen blev identificeret (https://cpgislands.usc.edu/) inden for 4500 bp

KIF14

promoter region (-2371 til at -1129) (figur S1A), og methylering-specifikke primere (~120 bp) mod den største CpG ø i

KIF14

promotor ved hjælp af online software Methprimer var designet (https://www.urogene.org/methprimer/) (Figur S1B). Primer sekvenser var som følger: methyleret specifik: Fremad: att taa agg ggg TTA agt ttt ACGT; Omvendt: gat AAT TAA handle CCG ata acc GTC; Umethylerede-specifikke: Fremad: att taa agg ggg GTT agt ttt atgt; Omvendt: CAA taa TTA aac tcc aat aac CATC. En fjerdedel af det oprensede bisulfit-behandlet DNA (5 pi af en 20 pi eluat) blev anvendt i methylering PCR-reaktion. End-point PCR-reaktioner blev udført i 25 pi slutvolumen med Maxima Hot Start Taq-polymerase (Fermentas). PCR-betingelserne var som følger: 94 ° C i 3 minutter efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek, og dernæst en endelig forlængelsesperiode på 72 ° C i 10 min. Produkter (~120 bp) blev visualiseret under anvendelse af agarosegelelektroforese. Densitometri blev udført på gråtonebilleder med Image J. Verifikation af bisulfit konvertering af DNA blev udført med umodificerede calponin-specifikke primere (figur S2) som beskrevet [17].

Statistisk analyse

Expression værdier (luciferaseaktivitet, mRNA, miRNA eller protein udtryk) blev vurderet mellem normale væv kontroller og OvCa tumorvæv eller kontroller og behandlede grupper ved hjælp af parrede eller uparrede t-test. KIF14 ekspression efter miRNA inhibitor /mimic behandling blev analyseret ved envejs ANOVA. Medmindre andet er angivet, blev alle statistiske analyser udført ved hjælp af Graph Pad Prism 4.0. Korrelationer mellem

KIF14

vinde vs

KIF14

ingen gevinst kategorier, og

Sp1

,

YY1

HSF1

mRNA-ekspression blev analyseret hjælp Pearsons korrelationskoefficient (r).

Resultater

Identifikation af en

KIF14

cis regulatorisk region i æggestokkene kræftceller

en 4500 bp region genomisk DNA umiddelbart opstrøms for det humane

KIF14

transskriptionsstartstedet blev amplificeret fra normal human DNA og deletions- reporter analyser blev udført ved kloning sekventielt mindre regioner af

KIF14

promotoren ind i pRSV-Luc promotorregion. Luciferaseaktivitet blev målt i OvCa429, SKOV3 og HeLa-celler, og promotor-aktivitet blev beregnet i forhold til pRSV-Luc-ekspression (sat til 100%). Hele promotorregion konstrukt (pGL3-4555) viste luciferaseaktivitet tæt på den for den positive kontrol (pRSV-Luc). En meget aktive region blev identificeret mellem -2366 og -2245 bp, hvilket viser lignende aktivitet til den fulde promotorkonstruktionen, men betydeligt mere luciferaseaktivitet sammenlignet med alle andre deletionskonstruktioner for alle tre cellelinier (P 0,05, figur 1). Bioinformatisk analyse af denne aktive region via online analyse software (Genomatix) identificerede formodede transkriptionsfaktor bindingssteder for

Sp1

,

YY1

HSF1

(figur 1), hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​en potentiel

cis

regulatoriske region i

KIF14

promotor.

promoter deletionskonstruktioner kondenseret til Luciferase blev testet for aktivitet i HeLa, SKOV3 og OvCa429 celler. pRSV-Luc, positiv kontrol, 0, tom vektor kontrol. Tal er basepar i forhold til det transkriptionelle startsted (0). Bioinformatik analyse (Genomatix) af de mest aktive region i

KIF14

promotor (-2366 til at -2245) identificerede formodede bindingssteder for transkriptionsfaktorer YY1, HSF1 og Sp1. Transkriptionsfaktor genkendelsessteder er understreget, og plads inden sekvens betegner placeringen af ​​deletionskonstruktioner. N = 3, * Betydning på

P

0,05, uparret t-test.

P

= 0,01 (HeLa);

P

= 0,01 (SKOV3);

P

= 0,03 (OvCa429).

Sp1 og YY1 endogent regulere KIF14 udtryk i OvCa cellelinjer

Vi testede, om disse transkriptionsfaktorer påvirket

KIF14

mRNA-ekspression af siRNA-medieret knockdown af endogen

Sp1

,

HSF1

YY1

i SKOV3 og OvCa429 celler. Forbigående knockdown resulterede i en betydelig reduktion af transskription faktor (

Sp1

,

HSF1

,

YY1

) mRNA (figur 2A, B). Mens knockdown af

HSF1

havde ingen signifikant effekt på

KIF14

genekspression,

Sp1

YY1

knockdown resulterede i faldet betydeligt

KIF14

mRNA, hvilket tyder på, at både SP1 og YY1 fungere som forstærkere af

KIF14

transskription. Som svar på

Sp1

YY1

knockdown, et fald i transskription faktor protein-ekspression og tilhørende KIF14 protein blev bekræftet via immunoblots (Figur 3) SKOV3 celler. Mens HSF1 proteinniveauer faldt som reaktion på knockdown, blev ingen signifikant ændring i KIF14 proteinekspression set. Lignende resultater blev set for OvCa429 celler (data ikke vist), hvilket indikerer, at

Sp1

YY1

kan styre ekspression af

KIF14

i OvCa cellelinjer. Reduktionen i KIF14 mRNA og proteinekspression i respons på Sp1 knockdown var mindre end med YY1 knockdown, og kunne sandsynligvis være relateret til effektiviteten af ​​transkriptionsfaktoren knockdown (figur 2A, B og figur 3A, B). Reduktionen i

KIF14

mRNA og protein var mere udtalt i svar på

YY1

knockdown, tyder på, at YY1 kan være en vigtig aktør i reguleringen af ​​

KIF14

overekspression i disse celler.

siRNA knockdown af endogen

Sp1

(orange),

HSF1

(grøn), og

YY1

(rød) transkriptionsfaktorer, og måling af deres mRNA-ekspression sammen med tilsvarende

KIF14

mRNA-niveauer (blå) via realtids-PCR i A SKOV3 og B OvCa429 celler. Y-akser: normaliseret mRNA udtryk i forhold til håne. GL2, kontrol siRNA; N = 3, * Betydning på

P

0,05, uparret t-test. Tre forskellige siRNA-molekyler (A, B, C) blev anvendt til at vælte hvert gen. P-værdier for panel A (SKOV3 celler):

P

= 0,02 for Sp1 udtryk (orange) med Sp1 siRNAs A, B, og C;

P

= 0,03 (siRNA-A),

P

= 0,047 (siRNA-B),

P

= 0,04 (siRNA-C) i KIF14 udtryk (blå) .

P

= 0,001 for HSF1 udtryk (grøn) med HSF1 siRNAs A, B, og C;

P

= 0,23 (siRNA-A),

P

= 0,12 (siRNA-B),

P

= 0,4 (siRNA-C) i KIF14 ekspression (blå) .

P

= 0,01 for YY1 udtryk (rød) med YY1 siRNAs A, B og C;

P

= 0,006 for KIF14 udtryk (blå) med YY1 siRNAs A, B, og C. P-værdier for panel B (OvCa429 celler):

P

= 0,03 til Sp1 udtryk (orange) med Sp1 siRNAs A, B og C;

P

= 0,05 (siRNA-A),

P

= 0,04 (siRNA-B),

P

= 0,045 (siRNA-C) i KIF14 udtryk (blå) .

P

= 0,003 for HSF1 udtryk (grøn) med HSF1 siRNAs A, B, og C;

P

= 0,31 (siRNA-A),

P

= 0,45 (siRNA-B),

P

= 0,39 (siRNA-C) i KIF14 ekspression (blå) .

P

= 0,02 (siRNA-A),

P

= 0.01 (siRNA-B),

P

= 0,01 for YY1 udtryk (rød);

P

= 0,02 (siRNA-A),

P

= 0,001 (siRNA-B),

P

= 0,006 (siRNA-C) i KIF14 udtryk (blå) .

En siRNA knockdown af endogen Sp1 (orange), HSF1 (grøn), og YY1 (rød) transkriptionsfaktorer, og måling af deres protein-ekspression sammen med tilsvarende KIF14 protein niveauer (blå) via immunoblot i SKOV3-celler. x-aksen: normaliseret proteinekspression forhold til håne. B repræsentant immunoblot af KIF14 og transskriptionsfaktor ekspression. Tal repræsenterer normaliserede udtryk værdier for eksperimentet vist. Lignende resultater blev set med OvCa429 celler. GL2, kontrol siRNA; N = 3; *,

P

0,05 til transskription faktor ytringsfrihed; #,

P

0,05 for KIF14 udtryk, uparret t-test.

P

værdier for panel A (SKOV3 celler):

P

= 0,009 (siRNA-A),

P

= 0,003 (siRNA-B),

P

= 0,006 (siRNA-C) i Sp1 udtryk (orange);

P

= 0,005 (siRNA-A),

P

= 0,007 (siRNA-B),

P

= 0,004 (siRNA-C) i KIF14 udtryk (blå) .

P

= 0,01 for HSF1 udtryk (grøn) med HSF1 siRNAs A, B, og C;

P

= 0,54 (siRNA-A),

P

= 0,65 (siRNA-B),

P

= 0,41 (siRNA-C) i KIF14 udtryk (blå) .

P

= 0,001 for YY1 udtryk (rød) med YY1 siRNAs A, B og C;

P

= 0,01 (siRNA-A),

P

= 0,02 (siRNA-B),

P

= 0,005 (siRNA-C) i KIF14 ekspression (blå) .

for at kontrollere, om Sp1 og YY1 kunne associere direkte med

KIF14

promotor, kromatin immunoprecipiation (chip) analyser blev udført i SKOV3, OvCa429 og HeLa-celler. Vi fandt, at både SP1 og YY1, men ikke HSF1 udviste en meget højere bindingsaffinitet til

KIF14

promotorregion end IgG-kontrol (højere relative ekspressionsniveauer værdier figur 4). OvCa429 celler viste den største berigelse af binding til både SP1 og YY1 (over 10 gange, figur 4A, B), mens SKOV3 og HeLa-celler viste mere beskedne berigelse (i gennemsnit 4-fold, figur 4A, B). Binding af HSF1 til KIF14 promotoren var meget mindre udtalt (i gennemsnit 2 gange for alle cellelinier, figur 4C). Berigelse med Sp1 og YY1 binding blev også vist via endepunkt PCR (fig S3). Disse resultater bekræfter vores mRNA og protein ekspression resulterer ved at vise, at både SP1 og YY1 kan binde direkte til

KIF14

promotor. Kombineret, disse data viser, at Sp1 og YY1 endogent kan regulere

KIF14

udtryk i OvCa cellelinjer.

chip assays af endogent YY1, Sp1 og HSF1 efterfulgt af real time PCR med

KIF14

promotorregionen (-2300 til -2133) i cellelinier SKOV3, OvCa429, og HeLa sammenlignet med IgG (negativ kontrol). Værdier repræsenterer gennemsnitlige mængde promoter region produkt i forhold til IgG kontrol. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse for tredobbelte analyser.

Sp1 og YY1 overekspression korrelerer med KIF14 overekspression

Vi har tidligere dokumenteret genomisk gevinst på

KIF14

i op til 30 % af primære OvCa tumorer, der korrelerer med meget høj overekspression af

KIF14

mRNA (

KIF14

hØJ) [8]. Disse data tyder på, at genomisk gevinst er en mekanisme, hvorigennem

er KIF14

overudtrykt i disse tumorer. For at afgøre om

KIF14

overekspression i OvCa tumorer kan også være knyttet til transkriptionel regulering, vi målte mRNA udtryk for

Sp1

,

YY1

HSF1

i en delmængde af OvCa tumorvæv med (15 prøver) og uden (50 prøver)

KIF14

genomisk gevinst. I OvCa tumorer uden genomisk gevinst (50), vi dikotomiseret prøverne i to grupper baseret på median udtryk, til enten

KIF14

HØJ eller

KIF14

Lav grupper, som vi har tidligere rapporteret [8]. Mange af de 19

KIF14

HØJE OvCa tumorer udtrykt betydeligt højere niveauer af

Sp1

YY1

mRNA (figur 5) end dem med

KIF14

LAV overekspression (31), hvilket indikerer potentielle roller for Sp1 og YY1 at opretholde høje

KIF14

niveauer i tumorer.

HSF1

mRNA-niveauer var ens i alle OvCa tumorer, dermed mindre tilbøjelige til at være vigtige i reguleringen

KIF14

mRNA. Den gennemsnitlige

YY1

udtryk niveau i primære OvCa tumorer er meget højere end den gennemsnitlige

Sp1

udtryk niveau; sammen med

YY1

knockdown data i cellelinier (figur 2 og 3), tyder disse resultater, at YY1 er en vigtig regulator af KIF14 overekspression i OvCa tumorer. Til støtte for denne, blev en stærk korrelation ses mellem

KIF14

Sp1

eller

YY1

udtryk, eksisterede mens ingen for

HSF1

(tabel 1 og Figur S4D-F). Tumorer med KIF14 genomisk gevinst viste ingen transkriptionsfaktor korrelation (tabel 1 og figur S4A-C), hvilket bekræfter, at genomisk gevinst er den mekanisme styrer

KIF14

overekspression i disse tumorer. Interessant, en andel (ca. 40%) af

KIF14

HØJE tumorer viste

Sp1

YY1

udtryk tæt på normale væv niveauer (figur 5), yderligere implicerer andre biologiske mekanismer til potentielt kontrollere

KIF14

overekspression i OvCa tumorer.

Kvantitativ mRNA-ekspression analyse af primære OvCa tumorer med

KIF14

HIGH (rød) og <