PLoS ONE: en pilotundersøgelse Brug Next-Generation Sequencing i fremskredne kræftformer: Feasibility og Challenges

Abstrakt

Formål

Nye anticancer midler, der er målrettet en enkelt celleoverfladereceptor, opreguleret eller amplificeret genprodukt, eller muterede gen, er blevet mødt med nogen succes til behandling af fremskredne cancere. Men patienters tumorer stadig i sidste ende gøre fremskridt på disse behandlinger. Hvis det var muligt at identificere et større antal kan målrettes sårbarheder i en persons tumor, kan flere mål udnyttes med brug af specifikke, terapeutiske midler, hvilket muligvis kan give patienten levedygtige terapeutiske alternativer.

Eksperimentel Design

i denne sonderende undersøgelse, brugte vi næste generations sekventering teknologier (NGS), herunder hele genomet sekventering (WGS), og hvor det er muligt, hel transkriptom sekventering (WTS) for at identificere genomiske begivenheder og tilhørende udtryk ændringer i avancerede kræftpatienter.

Resultater

WGS på parret tumor og normale prøver fra ni avancerede kræftpatienter og WTS på seks af disse patienters tumorer blev afsluttet. Et patientens behandling var baseret på mål og veje identificeret af NGS og patienten havde en kortvarig PET /CT respons med en signifikant reduktion i sin tumor-relaterede smerter. At designe behandling planer er baseret på oplysninger fået fra NGS, flere udfordringer opstod: NGS indberetningsforsinkelser, formidling af resultater til out-of-state deltagere og deres behandling onkologer, og kæde af forældremyndigheden håndtering for friske biopsiprøver for Clinical Laboratory Improvement Ændringer ( CLIA) target validering.

Konklusion

Mens den indledende indsats var en langsommere proces end forventet på grund af en lang række spørgsmål, demonstrerer vi muligheden for at bruge NGS i avancerede kræftpatienter, så behandlinger for patienter med voksende tumorer kan forbedres

Henvisning:. Weiss GJ, Liang WS, Demeure MJ, Kiefer JA, Hostetter G, Izatt T, et al. (2013) en pilotundersøgelse Brug Next-Generation Sequencing i fremskredne kræftformer: Feasibility og udfordringer. PLoS ONE 8 (10): e76438. doi: 10,1371 /journal.pone.0076438

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: April 24, 2013; Accepteret: August 23, 2013; Udgivet: 30 oktober 2013

Copyright: © 2013 Weiss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var tilvejebragt af National Foundation of Cancer Research (www.nfcr.org) og Lee T. Hanley fond for kræft i bugspytkirtlen Research (https://www.tgenfoundation.org/netcommunity/page.aspx?pid=1196). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Patienter med fremskreden kræft ofte udstødning behandlingsmuligheder. De kan deltage i fase I eller fase II forsøg med nye anticancer midler, hvis de opfylder typisk strenge støttekriterier og har adgang til centre, der kan administrere testpræparater agenter. Når patienter deltager i disse forsøg, nye agenter i gennemsnit giver responsrater på mellem 5% og 10% i en fase I indstilling og 12% i et fase II indstilling [1] – [3]. Patienterne har også en mulighed for bedste understøttende behandling i et forsøg på at løse deres symptomer.

For nylig har der været en eksplosion af interesse i at udvikle nye anticancer midler, der er mere målrettet, som regel mod en celleoverfladereceptor eller en opreguleret eller amplificeret genprodukt eller muteret gen. Denne tilgang er møde med en vis succes (fx trastuzumab mod HER2 /

neu

i brystkræftceller, erlotinib mod EGFR-mutant ikke-småcellet lungekræft, etc.). Men patienters tumorer stadig i sidste ende gøre fremskridt på disse behandlinger, fordi de indeholder flere genomiske abnormiteter, og rettet mod en enkelt abnormitet er ikke tilstrækkelig til at forhindre progression. Hvis det var muligt at identificere en større række mål i et individs tumor hvor der findes midler, der potentielt kan målrette dem, kunne flere mål løses under anvendelse af specifikke terapeutiske midler, og måske reducere risikoen for progression. I sidste ende forestiller fleste forskere udnytte flere midler til at ramme flere mål er til stede i en patients tumor. Men identifikation og anvendelse af de relevante lægemidler er fortsat en udfordring.

Vi har tidligere gennemført et prospektivt multicenter undersøgelse udnytte molekylær profilering af tumorer ved immunhistokemi (IHC), at fluorescerende in situ hybridisering (FISH), og mikromatrice finde potentielle lægemiddelkandidater og udvalgte behandlinger i overensstemmelse hermed [4]. Sixty-seks af 84 patienter blev behandlet på grundlag af molekylær profilering af deres tumor. For 18 af disse 66 patienter, behandlingen afledt ved molekylær profilering, førte til en progressionsfri overlevelse forholdet ≥1.3, hvilket tyder på en behandling fordel. Molekylær profilering støttede tegn på en ny behandling ikke i første omgang overvejet af investigator, i en patientpopulation, der var stærkt forbehandlet og refraktære over for tidligere behandlinger.

For at bygge videre på dette første skridt i retning af personlig terapi, vi brugte næste- generation sekventering teknologier (NGS), herunder hele genomet sekventering (WGS), og hvor det er muligt, hel transkriptom sekventering (WTS) for at identificere genomiske begivenheder og tilhørende udtryk ændringer i avancerede kræftpatienter. Vi brugte WGS at sekventere tumor biopsi DNA og matches germlinie DNA fra ni avancerede kræftpatienter til at identificere centrale somatiske forandringer. Kimcellelinje DNA blev samplet fra hvide blodlegemer og tumor-DNA blev udtaget fra tumorceller. For seks af disse patienter, vi også anvendt WTS at sekventere totalt RNA isoleret fra tumoren, sammen med ikke-patient total RNA kontroller. Fordi genekspressionsprofiler variere mellem vævstyper, og sundt væv kunne ikke tages biopsi fra en patient for sammenligning, kommercielt indkøbt normal RNA for den tilsvarende væv blev sammenlignet med RNA isoleret fra tumoren. Vi derefter evalueres transkriptom ændringer og udførte integrerede genomik analyser [5] med WGS data for at identificere potentielle druggable mål. Her demonstrerer vi gennemførligheden og fremhæve de udfordringer ved at bruge NGS teknologier i et prospektivt måde avancerede kræftpatienter.

Metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og blev godkendt af vestlige Institutional Review Board (WIRB® Protocol # 20.101.288) (NCT01443390). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienter, herunder skriftligt samtykke til offentliggørelse af de kliniske detaljer og billeder.

Undersøgelse Mål

Det primære formål med denne undersøgelse var at identificere så mange genomiske ændringer som muligt i fremskredne kræftformer, så som at udvide udvalget af potentielle handlingsrettede mål med behandlinger, der var kommercielt tilgængelige eller kliniske forsøg. Det sekundære formål var at udvikle en arbejdsgang fra tumor biopsi til behandling; ja, skal denne proces forekomme i en kort nok tidsramme, for patienter at drage fordel af disse supplerende oplysninger i udviklingen af ​​en behandlingsplan. Dette omfattede måle den tid fra biopsi til færdiggørelse og endelige analyse af NGS på patientens tumor og ikke-tumor prøver, undersøger den hyppighed, hvormed der opnås brugbare sekvens data som funktion af procent tumor involvering i biopsi, og vurdere sammenhængen mellem anti -tumor aktivitet af behandlinger identificeret af NGS.

Study design

begrundelsen for denne undersøgelse er, at NGS kunne anvendes til at identificere ikke kun én, men mange genomiske abnormiteter, der kunne målrettes under anvendelse potentielt tilgængelig behandlinger i avancerede kræftpatienter. Denne enkelt center, prospektiv, single-arm pilotundersøgelse udført hos patienter med fremskreden kræft, der skred på standard systemisk terapi eller hvis hans eller hendes tumortype havde ikke en standard systemisk terapi. Denne undersøgelse var sonderende karakter. For at deltage, skal patienterne have været alder ≥18 og villig til at gennemgå en biopsi eller kirurgisk indgreb for at opnå væv, medmindre en frossen tumor indsamlet mindre end 8 uger før var tilgængelige. Interesserede deltagere blev gjort opmærksom på, at få en ny biopsi kan ikke være en del af patientens rutinemæssig pleje for deres malignitet. Andre støtteberettigelseskriterier inkluderet: baseline laboratorium data indikerer acceptabel knoglemarvsreserve, lever og nyrefunktion, Karnofsky performance status ≥80%, og den forventede levealder 3 måneder. Deltagelse på et andet klinisk forsøg med behandling før eller under deltagelse i denne undersøgelse var tilladt. Vigtigste udelukkelseskriterier var symptomatiske eller ubehandlede centralnervesystemet (CNS) metastaser, kendte aktive infektioner, der kræver intravenøs antimikrobiel behandling, gravide eller ammende kvinder, eller tumor, der var utilgængelige for en biopsi. Personer med kendt HBV, HCV, eller HCV-infektion (er), der kræver antiviral behandling blev også udelukket, da denne population ofte er udelukket fra første-in-human onkologi kliniske forsøg; hvilket begrænser mulighederne for potentielle behandlingsmuligheder for denne gruppe. Alle kvalificerede patienter havde fuldblod og en frisk frosset tumor prøve indsamlet og sendt til analyse. Disse fremgangsmåder og oplysninger om rå sekventering data er beskrevet yderligere i den supplerende afsnit. Vi oprindeligt forventet ca. 100 dage fra friske tumor biopsi til færdiggørelse af NGS. Efter NGS analyse blev udført, de Delforsøgsledere gennemgik resultaterne, og når det er klinisk relevant, valgte mål for validering af en CLIA-certificeret (Clinical Laboratory Improvement Ændringer) laboratorium. For fem patientprøver med lav tumor procentdel blev exome sekventering tilsat for at identificere potentielle handlingsrettede mål. Efter målvalidering blev en rapport til den behandlende onkolog med potentielle behandling anbefalinger, som kan anvendes på hans /hendes skøn.

Resultater

Patient Kendetegn

Alle patienter blev set og vurderet med henblik på optagelse i denne undersøgelse mellem oktober 2010 og februar 2012 på et enkelt center. For at undgå arbejde flow forsinkelser på tilgængelige NGS maskiner, screening for patienter blev fordelt for at tillade ikke mere end to potentielle kandidater om måneden. Som centrum forestår undersøgelsen modtager henvisninger fra hele landet for fase 1 studier, nogle personer kom fra ud af staten for en planlagt screening og samtykke evaluering, og efter bekræftelse af berettigelse, fortsatte med en frisk tumor biopsi inden 24 timer. Dette blev gjort for patienten bekvemmelighed at give mulighed for rejse hjem igen kort efter den første vurdering. Det skabte logistiske udfordringer med opfølgning og formidle resultaterne tilbage til den behandlende læge. For patienter, der bor inden for køreafstand, tilmeldingsprocessen var ens, selvom biopsi ikke altid planlagt til næste dag.

Tabel 1 viser egenskaberne ved de 11 patienter, der givet samtykke til denne undersøgelse. Størstedelen af ​​patienterne var mænd, med en gennemsnitsalder på 59 år (i intervallet 20 til 69 år). Notatet på tidspunktet for samtykke, alle undtagen en patient (patient 9) havde udviklet på mindst én tidligere systemisk behandling for fremskreden sygdom (3, interval 0-8). Patient 9, diagnosticeret med fremskreden adenosquamøst karcinom i bugspytkirtlen, undergik systemisk behandling og efterfølgende skred efter NGS resultater blev tilgængelige.

Figur 1 detaljer koncernregnskabet standarder for rapportering Trials (CONSORT) diagram viser strømmen af de 11 patienter, som givet samtykke og blev evalueret for undersøgelsen. To patienter (patienter 1 og 5) gennemgik tumor biopsi og havde tilstrækkelig DNA til rådighed for NGS analyse, på grund af mangel på tilstrækkelig tumor cellularitet observeret i de indsamlede prøver (tabel 1 og tabel S1). For de resterende ni patienter med fremskreden cancer, udførte vi WGS på både tumor-DNA, såvel som germlinie DNA isoleret fra fuldblod med henblik på at identificere både somatiske ændringer; henholdsvis. WGS målinger og sammenfattende statistik for hver af de ni patienter er vist i tabel S1. Seks patienter havde tilgængelig tumor RNA, lykkedes analyseret af WTS. I de sidste tre patienter (patienter 9, 10 og 11) indskrevet på denne undersøgelse, vi foretog en mere involveret biologisk analyse af de forsamlede genomiske data at skelne bemærkelsesværdige biologiske veje, der kan blive berørt i patientens kræft at identificere mulige terapeutiske mål.

* – Prospective berigelse analyse blev udført før diskutere resultaterne med patienten og behandling onkolog for de sidste tre patienter indskrevet

af de 9 patienter med WGS og /eller exome. sekventering og /eller WTS analyse til rådighed, vi identificerede potentielle mål og veje for alle, men patient 2 (88,9%) (tabel 1). For vores sekundære mål, den gennemsnitlige tid fra biopsi til færdiggørelse og endelige analyse af NGS på patientens tumor og ikke-tumor prøver var 91 dage (interval 46-243 dage). De vigtigste årsager til afvigende var enten sekventering instrument problemer eller et resultat af lav tumor procentdel i prøven kræver exome sekventering for at identificere potentielle handlingsrettede mål. For den anvendte protokol, exome sekventering krævede mere input DNA (3 ug) end WGS (1 ug) og givet oplysninger om kodende regioner og flankerende utranslaterede områder af genomet. For syv af sagerne blev de indledende tumorprøver indsendes direkte til vores institution for patologi vurderingen, så tumor procentdel kunne konstateres. Den mindste tumor cellularitet indhold for en vellykket NGS var 30% (Tabel 1).

Hele genom sekventering

For fuldstændig pilotundersøgelse blev sekventering udført af syntese teknologi og 100 bp parret ende kemi . Vi genereret over 19 milliarder i alt læser fra WGS for gennemsnitlige kortlagte dækningsområder spænder fra 17 × til 71 ×. SNP (enkelt-nukleotid polymorfisme) kaldelse blev udført under anvendelse af to separate opkaldere at reducere falsk negativ-raten. For at vurdere den overordnede kvalitet af variant data blev kimlinie SNP’er kaldt og overgangen til transversion og dbSNP (enkelt-nukleotid polymorfisme Database) [6] 129 konkordanslinier nøgletal blev beregnet. For alle patienter, de forandring /transversion ratio var i området fra 2,01 til 2.24, og dbSNP 129 konkordans rate varierede fra 86,0 til 89.4 (tabel S1). Fra blev påvist systematiske fejl med hensyn til nucleotidsubstitutioner disse analyser, de SNP’er identificeret kraftigt korrelere med almindelige genetiske variationer, og af høj kvalitet variant kald blev udført. For alle patienter der var i alt 5778 kodning genomiske begivenheder identificeret (median = 15,5). Patient 2, en kvindelig aldrig-ryger med metastatisk lunge adenocarcinom, nærede de fleste af disse kodning genomiske begivenheder (n = 4137), herunder en ikke-synonyme TP53 mutation (G226V) med 100% mutant allel særligt udtryk, og en interstitiel 8Q CNV (antal kopier variation) vinde omfatter MYC. Patient 11, en kvindelig med metastatisk bronkial carcinoid, havde færrest kodende genomiske begivenheder (n = 4). Exome sekventering blev udført på tumorprøver fra patienter 6, 7, 8, 10, og 11 med målinger i tabel S1. CNV resultater er vist i tabel S2.

Hele transkriptom sekventering

WTS blev udført i seks patienter (tabel 1 og tabel S1) og tilsvarende ikke-patient normalt væv RNA baseret på den primære tumor oprindelse . Fordi normalt tilstødende væv ikke blev opsamlet fra patienter under biopsi, blev totalt RNA for den relevante væv kommercielt købt. RNA biblioteker blev forberedt på disse prøver og sekventeret med respektive tumor RNA biblioteker. Tumor WTS data blev sammenlignet med tilsvarende normale væv WTS data til at identificere ekspression ændringer i tumorbiopsier. Hver af de analyserede tumorer havde gener med væsentlige udtryk ændringer med q. 0,05, korrigeret for multipel testning (median antal gener differentielt udtrykt 1731, range 495-2,323) (tabel S3)

Kopier nummer Variation

Amplifikationer og udeladelser blev påvist ved identificere områder, hvor der var en delta (+/-) i log2FC (som beskrevet ovenfor) er større end 2 standardafvigelser medianen log2FC over arm af kromosom blive afhørt. Delta blev beregnet ved at fratrække de endelige punkter på ca. 1 MB glidende vindue. Desuden at de fundne områder nødvendige være mindre end 14 MB i længden at blive markeret som et samlingspunkt begivenhed. Tabel S2 indeholder alle fokale begivenheder, som indeholder COSMIC gener for patienter 2, 3, 4, 7 og 8. Patienter 9 og 11 havde ikke nogen fokale begivenheder, der indeholdt COSMIC gener. Patienter 6 og 10 havde ikke nogen fokale hændelser (se tabel S3 og figur S7)

Prospective Berigelse Analyse

For indskrevet de sidste tre patienter, vi udførte berigelse analyse af WGS og /eller exome sekventering og WTS. Detaljer for den enkelte patient er som følger:

Patient 9 adenosquamøst karcinom i bugspytkirtlen

Af de ni patienter, der havde tumorer analyseret af NGS, patient 9 (adenosquamøst bugspytkirtel kræft) er den eneste person hvis behandling var baseret på mål og veje identificeret af NGS. Kun to typer af data var tilgængelige for analyse på dette patientens væv, single nukleotid variationer (SNV) og WTS. Ingen signifikante områder af ændringer blev observeret i kopital data.

De øverste 20 kanoniske kort beriget i WTS data vises i figur S1. Fælles biologiske mekanismer, der er forbundet med disse top 20 berigede kort omfatter vedhæftning, cytoskeletal remodellering og immune /kemotaksisplader processer. Sådanne berigelser indebære en generaliseret aktivering af ekstracellulær matrix remodellering der kan være relateret til fænotype for denne sjældne tumortype. To kort af note i top tyve vej kort berigelser er særlige bugspytkirtlen kræft kort bygget specifikt til opsamlingsprocesser ændret i kræft i bugspytkirtlen. Disse kort titlen, ‘Tumor-stroma interaktioner i bugspytkirtelkræft “og” rolle stjerneformige celler i progression af kræft i bugspytkirtlen “, fremhæve yderligere mulig stromale /ECM samspil inden for denne tumor. Den “rolle stjerneformige celler i progression af kræft i bugspytkirtlen ‘kort er præsenteret i figur S2.

En yderligere observation fra inspektion af overlagte WTS data på signalering maps er mulig inddragelse af TGF-beta medieret epitelial til mesenkymale overgang i denne tumor. Den “Udvikling Regulering af epitelial til mesenkymale overgang (EMT)” kortet (figur S3), fremhæver de WTS data overlejret som repræsenteret ved de termometre siden knuder i diagrammet. En rød termometer betyder, at genet overudtrykkes og blå betyder, at genet underexpressed.

To ligander, TGF-beta 1 og TGF-beta 2 er begge opreguleres sammen med deres beslægtede receptor, TGF-beta receptor type, II. Den kombinerede opregulering af vækstfaktorer /receptor par punkter til potentielle betydning af denne signalering par være “aktiv” i denne tumor. Yderligere beviser, der forbinder TGF beta signalering til EMT er fremhævet ved opregulering af lef-1, TCF8 og E2A transkriptionsfaktorer. Disse transskriptionsfaktorer fungerer nedstrøms for TGF beta at signalere til EMT. Yderligere bevis for deres aktivering er nedreguleringen af ​​E-cadherin, som er kendetegnende for EMT fænotype. Tilstedeværelsen af ​​EMT fænotype ville varsle relative resistens over for mange terapeutiske midler og betyde en metastatisk tumor.

Yderligere inspektion af WTS data afslører overekspression af mulige mål for intervention. Som nævnt ovenfor ligand /receptor-parret regulering antyder aktivering og opregulering af neuropilin 1 og VEGF-A. Dette kan repræsentere sårbarhed over for antiangiogene terapier. Yderligere mål, der blev opreguleres er ESR1, ABL1, GART, VDR og ERBB2.

Patient 9 tumor havde bemærkelsesværdige mutationer i KRAS (G12R) og PIK3CA (R93W). Begge disse mutationer aktivere signalering for vækst og proliferation. Disse sameksisterende mutationer antyder, at kombineret målretning af MEK /ERK og PI3K /AKT til behandling af denne tumor ville være mere effektiv end målretning blot én af de to mutationer. Mens KRAS mutation blev valideret af CLIA test, regionen, der indeholder PIK3CA mutationen var ikke en del af en kommerciel test og dermed ubekræftet under CLIA betingelser. En anden fremtrædende SNV er i genet RAD50 (Q737R), som koder for et protein, der er involveret i DNA dobbeltstrenget brud reparation. Mangelfuld funktion i RAD50 er blevet forbundet med sensibilisering over for cisplatin og forøget følsomhed over for PARP-inhibitorer [7].

Patienten blev indledningsvis behandlet med cisplatin og gemcitabin og derefter skred frem. På det tidspunkt blev den WGS /WTS resultater til rådighed, og patienten indskrevet på en fase I PI3K hæmmer og MEK-inhibitor kombination undersøgelse. Patienten havde en kortvarig PET /CT respons på denne undersøgelse (figur 2) og dette blev også ledsaget af en dramatisk nedgang i hans smerter fra moderat til ingen (4/10 til 0/10 på det visuelle smerte skala).

18-fluorodeoxyglukose positronemissionstomografi /computertomografi (PET /CT) billeder skildrer (A) aksial skive ved baseline og (B) aksial skive efter 30 dage på behandling. Den gule pil peger på to hypermetaboliske lymfeknuder i B og C. I B, standard optagelse værdi (SUV) af den venstre lymfeknude er 9,8 og lymfeknuderne til højre er 7,5, mens SUV af den venstre lymfeknude er 3,1, og lymfeknude til højre er 3.5 i C.

patient 10 metastatisk papillære renalcellecarcinom

data til analyse for denne patient bestod kun af SNVs og WTS som ingen kopi nummer afvigelser blev identificeret. De øverste 20 kanoniske kort afslører fælles temaer omkring cellecyklus, kromosom /spindel-funktion, celleadhæsion og EMT overgang. Én vej at bemærke er den “Celle cyklus spindel samling og kromosom adskillelse ‘kortet (figur S4). En række gener involveret med dette kort opreguleres i denne tumor, herunder druggable target AURKB (log2ratio = 6,3). Spindel samling og kromosom adskillelse er afgørende for celledeling med en række onkologiske lægemiddelmål forbindelse med denne proces. To SNVs er også til stede i gener (STAG1 (F802Y) og NUMA1 (L1400P)) i denne vej og foreslå betydningen af ​​disse ændringer i denne tumor.

Andre veje med statistisk signifikans, som indeholder vigtige bemærkninger om biologi denne tumor og til mulige terapeutiske muligheder er noteret. Den “EGF- og HGF-afhængig stimulering af metastaser i mavekræft ‘kort afslørede opregulering af HGF og dens receptor MET. Dette kort blev konstrueret fra mavekræft specifikke oplysninger, selvom mange kræftformer deler lignende signalveje og molekyler. Under både receptor og ligand opreguleres antyder en autokrin signaleringsmekanisme. Som vist i figur S5, er alfa-6 /beta-4 integrin komponenter opreguleres og funktion i forening med MET at aktivere nedstrøms signaltransduktion. Den mulige involvering af MET er en vigtig observation, da det er i øjeblikket en attraktiv onkologi narkotika mål.

Yderligere inspektion af data viste tilstedeværelsen af ​​ændringer på RNA-niveau af potentielle lægemiddelkandidater. Den angiogene signalering ligand VEGFA, TOP2A, og NMU mRNA’er opreguleres. Disse tre gener er mål for de nuværende onkologi agenter. Derudover MGMT mRNA, som er en DNA-reparation gen, der overfører resistens over for temozolomid, nedreguleres, hvilket antyder temozolomid som en behandlingsmulighed. Endelig denne tumor har en SNV i genet APTX som koder for et protein involveret i DNA-reparation, der kunne formidle følsomhed irinotecan [8].

Patient 11 metastatisk bronkial neuroendokrine kræft Salg

Tre typer af genomisk oplysninger til analyse fra dette patientens væv inkluderet WTS, CNV (tabel S2), og SNV data. Kun fire SNVs i to gener, KRT4 og GOLGA6L10, blev identificeret, hvilket resulterer i WTS og CNV data driver biologiske fortælling om denne tumor. Figur S6 viser de 20 kanoniske pathway kort fra berigelse analyse af patient 11 data. Temaerne repræsenteret af titlerne på disse kort er ikke så kortfattet som i patient 10, men igen, vi observerer cytoskeleton og selvklæbende kort dominerer. Notatet er ingen cellecyklus eller kromosom centric kort beriget muligvis antyder en minimalt mitotisk tumor. Med hensyn til gen-mål, var der flere specifikke overudtrykte gener, herunder KIT, PDGFRB, EGFR, FGFR1 og SPARC. Det skal bemærkes, at der ikke kopital variationer blev set i disse gener.

Diskussion

I denne sonderende pilotundersøgelse, vi bygget på vores forudgående erfaring med potentielle molekylær profilering. Da dette er en ny teknologi, var der forventet og uforudsete udfordringer stødt i løbet af undersøgelsen adfærd. Bestanden af ​​patienter evalueret i denne pilot havde avanceret kræftformer med sygdomsprogression og desværre, for to personer, blev tilgængelig resultaterne efter signifikant klinisk forværring eller død (patienter 2 og 3). Mens undersøgelsen var i gang, udgifter til sekventering fortsatte med at falde, og forbedrede værktøjer til WTS og integration af WGS med WTS opstået. Således WTS tilsattes fremadrettet fra patient 7 fremefter. For patient 2, WTS var muligt, som der var til rådighed tumor til RNA ekstraktion. De supplerende oplysninger fra WTS for patient 2 blev derefter videresendt til den behandlende onkolog. Udover utilstrækkelig tumor-DNA (patienter 1 og 5), teknologien og workflow af prøve behandling forbedres, hvor vi var i stand til at indarbejde exome sekventering (patienter 6, 7, 8, 10, og 11), når tumor indhold procent var utilstrækkelig fra prøven biopsi . Dette lægges til det samlede sekventering og analyse tid for disse patienter (tabel 1) [9] – [12]. Bemærk, at WGS var den foretrukne modalitet under udførelsen af ​​denne undersøgelse. WGS giver bedre kopiantal opløsning og evnen til at identificere omlejringer som inversioner, der spænder en enkelt exon i et tumorsuppressorgen. Med denne type inversion, er der ingen rammeskift og tumor-suppressor gen udtrykkes på et normalt niveau. Uden isoform eller splejsning analyse, ville denne ændring blive savnet af IHC fordi den stadig er udtrykt på proteinniveauet, selv om proteinet er inaktivt på grund af de manglende aminosyrer [5]. Vi anerkender, at exome sekventering giver dybere dækning for at identificere kodning mutationer. Nyere strategier kan fange det bedste af begge WGS og exome sekventering af omfatter lange indsætte lavvandede hele genomer og dyb exome sekventering til at indfange komplekse rearrangementer og opnå en højere følsomhed til at indfange kodning mutationer.

En anden udfordring realiseres efter undersøgelsen var igangværende var kæden af ​​forældremyndigheden håndtering efter friske biopsiprøver. Fordi de første tumorer analyserede ikke undergår DNA /RNA-behandling på et CLIA laboratorium, kunne den efterfølgende planlagte validering af mål fra den samme frisk prøve ikke verificeres af en CLIA-certificeret test. Derudover omtrentlige 2 uger forsinkelse for clia validering kombineret med en median tid på 91 dage for NGS resultater bliver tilgængelige var problematisk. For patient 9 tumor blev KRAS (G12R) mutation valideret ved hjælp af et CLIA-certificeret test. For alle, men en patient (patient 2), en potentielt druggable mål med enten en kommercielt tilgængelig eller testpræparater terapi blev identificeret. For patient 11, havde WGS ikke give et mål, og kun WTS bidrog til at identificere druggable mål. Integrationen af ​​Epigenomics analyse kunne også faktor som endnu et lag til at lette identifikationen af ​​druggable mål med eksisterende behandlinger.

Selv om der ikke er nogen tekniske eller logiske forsinkelser i NGS, fortolkning og anvendelse af denne information til klinisk praksis er fyldt med usikkerhed. Ikke alle SNVs identificeret af WGS vil have en skadelig virkning på proteinfunktion. Så den blotte identifikation af SNVs, selv når valideret i et CLIA-certificeret test, garanterer ikke, at målrette det vil føre til en stabilisering eller et fald i tumor byrde. Vi må også erkende, at intratumor heterogenitet og klonal evolution kan komplicere vores udtænkt behandlingsstrategier for patienter baseret på resultater fra en enkelt tumor biopsi [13], [14].

Under udførelsen af ​​denne undersøgelse, indså vi, at med en median tidsramme på 91 dage til at rapportere fra NGS resultater, patienter med en fremragende præstation status og lav tumorbyrde er mere tilbøjelige til at have targets identificeret som kan handlet på. Med forbedrede effektivitet, der reducerer tid til at få NGS resultater og rimelige omkostninger, kan vi forestille NGS kan anvendes mere globalt til avancerede kræftpatienter. Selv under den relativt korte tid, at denne undersøgelse blev tilmelding, vi observerede betydelige forbedringer i sekventering analyser og sænket omkostningerne reagens. Andre nylig rapporteret temmelig imponerende resultater med 27% svarprocent til tilgængelige målrettede behandlinger bruger mere finite sekventering teknologi til at identificere druggable mål [15]. Samlet set demonstrerer vi muligheden for at udføre NGS teknologier i et prospektivt måde avancerede kræftpatienter. Vi forventer, at i ikke til fjern fremtid NGS teknologier vil blive mere let tilgængelige til indbygning i rutinemæssig pleje af avancerede onkologiske patienter.

Konklusion

Mens den indledende indsats var en langsommere end forventet proces på grund til en række spørgsmål, vi vise, at NGS kan udnyttes i kliniske situationer, uanset om denne tilgang vil føre til reelle og sammenhængende patient fordel endnu ikke bevist.

Støtte Information

File S1.

Supplerende oplysninger

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s001

(DOCX)

Figur S1. Salg Patient 9 WTS data kanoniske kort. Denne figur illustrerer de 20 kanoniske kort beriget i WTS data for patient 9.

doi: 10,1371 /journal.pone.0076438.s002

(TIFF)

Figur S2.

rolle stjerneformige celler i progression af kræft i bugspytkirtlen. Denne figur illustrerer rolle stjerneformige celler i bugspytkirtelkræft progression

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s003

(TIFF)

Figur S3.

Udvikling Regulering af epitelial til mesenkymale overgang. Denne figur illustrerer den mulige inddragelse af TGF-beta medieret epitelial til mesenkymale overgang

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s004

(TIFF)

Figur S4.

Udvalgt kanoniske kort for Patientsikkerhed 10: Celle cyklus spindel samling og kromosom adskillelse. Denne figur illustrerer cellecyklus spindel samling og kromosom adskillelse, herunder opreguleret og druggable mål, aurora-B (AURKB)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s005

(TIFF)

Figur S5 .