PLoS ONE: Undertrykkelse af IFN-induceret Transskription ligger til grund IFN Mangler Dannet ved Aktiveret Ras /MEK i Human Cancer Cells

Abstrakt

Visse onkolytiske virus udnytte aktiveret Ras-signalering for at kopiere i kræftceller. Konstitutiv aktivering af Ras /MEK-vejen er kendt for at undertrykke effektiviteten af ​​interferon (IFN) antiviralt respons, som kan bidrage til Ras-afhængige viral onkolyse. Her har vi identificeret 10 humane cancercellelinier (ud af 16) med forøget følsomhed over for antivirale virkninger af IFN-α efter behandling med MEK-inhibitor U0126, hvilket antyder, at Ras /MEK pathway ligger til grund deres reducerede følsomhed over for IFN. At bestemme, hvordan Ras /MEK undertrykker IFN respons i disse celler anvendte vi mikromatrice at sammenligne IFN-induceret transkription i IFN-sensitive SKOV3-celler, moderat resistente HT1080 celler og HT1080-celler behandlet med U0126. Vi fandt, at 267 gener blev induceret af IFN i SKOV3-celler, mens kun 98 gener blev induceret i HT1080 celler på samme tidspunkt. Endvidere ekspressionen af ​​et distinkt delmængde af IFN inducerbare gener, der omfattede RIGI, GBP2, IFIT2, BTN3A3, MAP2, MMP7 og STAT2, genoprettet eller øget i HT1080 celler, når cellerne blev co-behandlet med U0126 og IFN. Bioinformatisk analyse af de biologiske processer, der er repræsenteret ved disse gener viste øget repræsentation af gener involveret i den antivirale respons, regulering af apoptose, celledifferentiering og metabolisme. Endvidere indføres konstitutivt aktive Ras i IFN følsomme SKOV3-celler reduceret deres IFN følsomhed og evne til at aktivere IFN-induceret transkription. Dette arbejde viser for første gang, at aktiveret Ras /MEK i humane cancerceller inducerer nedregulering af en specifik undergruppe af IFN-inducerbare gener

Henvisning:. Christian SL, Zu D, Licursi M, Komatsu Y, Pongnopparat T , Codner DA, et al. (2012) Undertrykkelse af IFN-induceret Transskription ligger til grund IFN Mangler Dannet ved Aktiveret Ras /MEK i humane cancerceller. PLoS ONE 7 (9): e44267. doi: 10,1371 /journal.pone.0044267

Redaktør: Elankumaran Subbiah, Virginia Polytechnic Institute og State University, USA

Modtaget: 18. maj 2012; Accepteret: 31 juli 2012; Udgivet: 7. september, 2012 |

Copyright: © Christian et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af canadiske Institutes for Health Research (www.cihr-irsc.gc.ca), tilskud numre MOP74429 og ROP99020. SLC blev understøttet af en praktikant pris fra Beatrice Hunter Cancer Research Institute med midler fra Cancer Research Training Program som en del af The Terry Fox Foundation Strategisk Health Research Training Program i Cancer Research på CIHR (www.bhcri.ca). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

onkolytisk virus specifikt replikere i cancerceller, men ikke i normale celler, ved at udnytte forskelle i det intracellulære miljø af tumorcelle der fremmer abnorm cellevækst [1], [2], [3], [4] . Konstitutiv aktivering af Ras-signalering blev oprindeligt rapporteret at blive brugt af onkolytisk reovirus at øge sin replikative evne [5]. Efter opdagelsen af ​​reovirus onkolyse, andre vira, såsom vildtype herpes simplex virus (HSV) [6], vesikulær stomatitis-virus (VSV) [4], influenzavirus (delNS1 stamme) [7], adenovirus (VAI mutant) [ ,,,0],8], blev poliovirus [9], og Newcastle disease-virus [10] fundet at tilsvarende udnytte aktiveret Ras-signalvejen for onkolyse. Ras er en membranbundet GTP-bindende protein, der virker som en molekylær kontakt tændes for downstream veje til at regulere proliferation, differentiering og transformation [11]. I den kanoniske Ras-vejen, GTP-bundet Ras aktiverer sin nedstrøms mediator, Raf kinase. Aktiveret Raf phosphorylerer derpå og aktiverer MEK1 /2 kinaser, som phosphorylerer og aktiverer ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK) 1 og 2. ERK1 /2 kan så aktivere eller inhibere transkription faktorer for at fremme celleoverlevelse og proliferation [12]. Aktiverende mutationer af Ras er blevet fundet hos ca. 30% af alle humane tumorer [13]. Endvidere i fravær af den aktive mutation af Ras, Ras-vejen ofte aktiveres ved uhensigtsmæssig aktivering af sine upstream signaling komponenter, såsom epidermal vækstfaktor receptor, HER2 /neu og Src [14].

Multiple cellulære mekanismer, der ligger til grund for Ras afhængig viral onkolyse er blevet identificeret. Inhibering af den antivirale dobbeltstrenget RNA-aktiveret proteinkinase (PKR) ved Ras blev oprindeligt beskrevet som en vigtig mekanisme til onkolytisk virusreplikation i tumorceller [5], [6]. Det har også vist sig, at aktiveret Ras fremmer uncoating og frigivelse af onkolytisk reovirus som øger produktionen af ​​afkom-vira [15]. Ras aktivering øger også effektiviteten af ​​cap-uafhængig oversættelse af onkolytiske poliovirus [9]. Desuden har vi og en anden gruppe rapporterede, at aktivering af Ras-vejen kan forhindre effektiv aktivering af type I interferon (IFN) antiviral reaktion i humane cancerceller og muse fibroblastceller [16], [17], [18], hvilket tyder at defekten af ​​IFN respons induceret af aktiverede Ras er en af ​​de fælles mekanismer for viral onkolyse.

IFN’er udskilles cytokiner, der har flere virkninger i kroppen, herunder anti-viral, anti-proliferative og immunomodulatoriske roller. Som sådan er IFN’er anvendes i behandlingen af ​​virale sygdomme, såsom hepatitis C-virus-infektion, behandling af cancer og dissemineret sklerose. IFN binder til IFN-α-receptoren (IFNAR) [19] fører til aktivering af to tyrosinkinaser, Janus kinase 1 (JAK1) og tyrosin kinase 2 (Tyk2), som er forbundet med IFNAR [20], [21]. JAK1 og Tyk2 derefter phosphorylere signal transducer og aktivator af transkription (STAT) 1 og STAT2, som derefter forbinder med det DNA-bindende protein IFN regulatoriske faktor 9 (IRF9), til dannelse af et heterotrimert transkriptionsfaktor betegnet IFN-stimuleret gen faktor 3 (ISGF3) [22], [23]. Binding af ISGF3 til IFN-stimuleret responselement (ISRE) i promotorerne for IFN-inducerbare gener inducerer ekspressionen af ​​hundredvis af gener kollektivt kendt som IFN-stimulerede gener (ISG), mange med anti-virale, anti-proliferative og immunmodulerende funktioner [24]. Imidlertid kan effektiviteten af ​​IFN være begrænset af anti-IFN-proteiner kodet af virale genomer eller af endogene cellulære suppressorer regulerer IFN signalering [21].

Tidligere påviste vi, at en IFN følsomt virus, VSV, var i stand til replikere i NIH3T3-celler med aktiverede Ras /MEK mens IFN forhindrede infektion af kontrol NIH3T3-celler [16]. Noser et. al. [25] rapporterede også, at inhibering af Ras /MEK i humane cancercellelinier gendannet antivirale responser induceret af IFN. Disse undersøgelser viser klart, at Ras /MEK-aktivering ligger til grund IFN værdiforringelse i kræftceller. I en opfølgende undersøgelse, fandt vi, at aktiveret Ras /MEK undertrykt transskription af STAT2, som er en af ​​de væsentlige IFN signalering komponenter [17]. IFN-medieret beskyttelse mod virusinfektion blev kun delvist restaureret i RASV12 transformerede NIH3T3 celler med overekspression af STAT2. Men når Ras /MEK-vejen blev inhiberet af MEK-inhibitor U0126 i RASV12 celler, IFN var så effektive til at inducere et antiviralt respons som i vektor kontrolceller. Derfor er det usandsynligt, at nedregulering af STAT2 udtryk er den eneste mekanisme, der er involveret i Ras /MEK medieret IFN undertrykkelse. Her, desuden angive mekanismen for Ras-medieret inhibering af IFN-respons, analyserede vi inddragelse af Ras /MEK pathway i regulering IFN-induceret transkription i humane cancercellelinjer.

Resultater

følsomhed menneskelige kræftceller til IFN-inducerede Antiviral respons

først, vi valgte 16 kræft cellelinjer afledt fra forskellige typer af tumor (3 bryst, en livmoderhalskræft, 4 kolon, en fibrosarkom, 2 melanom , 3 æggestokkene og 2 prostata cellelinjer) og målt deres modtagelighed for den anti-virale effekt induceret af IFN. Cellerne blev behandlet med IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1.000 og 5.000 U /ml) i 16 timer og derefter udfordret med VSV ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 1 til 24 timer. Det samlede niveau for onkolyse blev evalueret under anvendelse krystalviolet farvning. Baseret på den effektive dosis (cytopatisk virkning (CPE) 50) af IFN, der er defineret som den effektive IFN-koncentration, som fremkalder en beskyttelse på 50% mod VSV-infektion, blev cellelinierne opdelt i følgende tre grupper: IFN følsomme: cellelinjer med CPE50 mindst 10 U /ml, IFN moderat resistent: cellelinjer med CPE50 mellem 10 til 5.000 U /ml, og IFN helt resistent: cellelinjer med CPE50 over den maksimale koncentration af IFN testede vi (5.000 U /ml) (fig . 1). Som vist i tabel 1, tre cellelinier (HeLa, SKBR3 og SKOV3) var følsomme for IFN mens 9 cellelinier (A375, DLD-1, HT29, HTB129, HT1080, MCF-7, MDAH, MDA-MB468 og SW48) viste moderat resistens mod IFN-behandling. I modsætning hertil 4 cellelinjer (DU145, HCT116, LNCaP og PA-1) ikke reagerer på IFN inden koncentrationsområdet IFN undersøgt.

IFN følsom (A), moderat resistente (B) og fuldstændigt resistente cellelinier (C) blev identificeret ved forbehandling af celler med IFN (0, 10, 50, 100, 500, 1000 og 5000 U /ml) i 16 timer og derefter udfordret med VSV ved en MOI på 1 i 24 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af krystalviolet farvning og udtrykt som gennemsnitlige procentvise forhold til de ikke-inficerede kontrolbrønde (n = 3 brønde). Et repræsentativt forsøg er vist.

Restaurering af IFN Følsomhed ved MEK Hæmning i IFN Moderat eller Helt Resistente kræftceller

Vi afgøres næste, om aktivering af Ras /MEK pathway reducerer IFN-induceret antiviralt respons i IFN moderat eller fuldstændigt resistente cancercellelinjer. IFN følsomheder af cellelinjer blev undersøgt i tilstedeværelsen af ​​en MEK-inhibitor U0126. Cellerne blev behandlet med IFN (0, 12,5, 25, 50, 200, 500 og 2000 U /ml) og U0126 (0, 2,5, 5, 10 og 20 uM) i 16 timer og derefter udfordret med VSV ved en MOI på 1 i 24 timer. Infektionen blev kvalitativt evalueret ved Western blot analyse af det virale VSV-G-protein. Effektiviteten af ​​U0126 på MEK-inhibering blev verificeret ved analyse af ERK-phosphorylering, det primære mål for MEK [13]. MEK-inhibering øget følsomhed 10 cancercellelinier på IFN (A375, DLD-1, DU145, HCT116, HT1080, HT29, HTB129, MDA468, MDAH og PA-1) (U0126 responsive cellelinier), men havde ingen effekt i 3 cancercellelinier (LNCaP, MCF7 og SW48) (U0126 ikke-responsive cellelinier) (fig. 2 og fig. S1). For eksempel VSV replikeres i HT1080 cellerne i nærvær af IFN (50 og 200 U /ml), mens VSV-replikation blev inhiberet i celler behandlet med den samme mængde af IFN i kombination med U0126 behandling (fig. 2A). HT1080 celler var også lidt reduceret VSV-infektion i nærværelse af 20 pM U0126 alene. Tilsvarende blev IFN-induceret antiviralt respons restaureret i HT29, HCT116 og MDAH celler, når Ras /MEK pathway inhiberes af U0126. I modsætning hertil har vi ikke observere restaurering af IFN-inducerede antiviralt respons på enhver kombination af koncentrationer af U0126 og IFN i LNCaP og MCF7-celler tyder på, at deres IFN modstand reguleres af andre end aktiveret Ras /MEK vej cellulære faktorer. Den samme analyse blev udført for at undersøge fremme af IFN-induceret antiviralt respons i de andre cellelinier (A375, DLD-1, DU145, HTB129, MDA468, PA-1 og SW48) (fig. S1).

(A) cellelinier blev inficeret med VSV (MOI = 1) i 24 timer efter behandling med IFN (0-5000 U /ml) med eller uden U0126 (0-20 uM) i 16 timer. Western blot-analyse blev anvendt til at detektere viral protein (VSV-G) niveauer, niveauet af phosphoryleret ERK (p-ERK) med GAPDH anvendt som en loading kontrol. Prøverne blev analyseret på to membraner samtidig benytter identiske betingelser for inkubation og detektion. Et repræsentativt eksperiment ud af 3 er vist. (B) blev bestemt Viral afkom produktion efter infektion med VSV (MOI = 1) i 24 timer efter behandling med IFN (50 eller 2000 U /ml) og med U0126 (0, 5, 10 eller 20 uM) i 16 timer.

restaureringen af ​​antiviral reaktion fra MEK hæmning i de fire U0126-responsive cellelinier blev bekræftet af afkom virus assay (fig. 2B). HT1080-celler, der er inficeret med VSV, viste en signifikant reduktion i afkomsvirus produktion med kombineret behandling med IFN (50 U /ml) og alle koncentrationen af ​​U0126 (5, 10 og 20 uM). Endvidere U0126 (20 uM) alene viste en beskeden, men statistisk signifikant reduktion i viral afkom. I de andre cellelinier (HT29, HCT116 og MDAH), viste den kombinerede IFN og U0126 behandling en betydelig og statistisk signifikant reduktion i viral afkom produktion i forhold til IFN alene eller U0126 eneste behandling indikerer øget respons på IFN på MEK hæmning.

Disse resultater indikerer, at aktivering af Ras /MEK-vejen undertrykker IFN-inducerede antivirale aktiviteter i nogle cancercellelinier. Vi fandt ingen sammenhæng mellem hverken IFN lydhørhed eller U0126 lydhørhed, og kræft celletyper.

Effekt af Ras /MEK Hæmning om IFN-induceret transskription

For at undersøge, hvordan aktiveret Ras /MEK undertrykker IFN respons i humane cancerceller, vi gennemførte globale genekspression analyse og identificerede gener med statistisk forøget udtryk i forhold til den ubehandlede tid-matchede kontrol (se supplerende oplysninger [File S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7] for fuldstændige lister af differentielt udtrykte gener). Først har vi sammenlignet ekspression af IFN inducerbare gener i IFN følsomme SKOV3-celler og moderat resistente HT1080-celler (fig. 3A). Ved IFN-stimulering i 6 timer blev 267 gener opreguleret i SKOV3 celler, mens kun 98 gener blev induceret i HT1080 celler. Halvfjerds gener blev induceret almindeligvis i både SKOV3 og HT1080-celler, mens 197 IFN inducerbare gener blev opreguleret kun i SKOV3-celler og 28 IFN inducerbare gener kun i HT1080 celler. Disse resultater viser at IFN-induceret transkription undertrykkes i IFN moderat resistente HT1080 celler sammenlignet med IFN følsomme SKOV3-celler.

(A) Venn diagrammer fra DNA microarray analyse viser global undertrykkelse af IFN-regulerede gener i HT1080 celler sammenlignet at SKOV3 celler. Vist er antallet af gener betydeligt opregulerede (FDR 0,01) efter 6 timer efter IFN behandling i de SKOV3 vs. HT1080 cellelinier. (B) Venn-diagram, der viser antallet af gener betydeligt opregulerede (FDR 0,01) i HT1080-celler efter behandling med IFN, U0126 eller begge IFN og U0126 i 6 timer eller 12 timer som angivet. (C) Venn-diagram sammenligner gener opreguleres med “beskyttende” behandlinger i hver celletype (IFN for SKOV3 celler og IFN /U0126 til HT1080 celler).

Vi afgøres så, om hæmning af Ras /MEK kunne ændre den transskriptionelle respons af HT1080 celler på IFN. IFN eneste behandling aktiveret transkription af 98 gener på 6 timer og 167 gener ved 12 timer, mens U0126 eneste behandling induceret ekspression af 636-gener på 6 timer og 97 gener på 12 timer (fig. 3B). Kombineret behandling af IFN og U0126 induceret transkription af 652 gener på 6 timer og 354 gener på 12 timer. Disse resultater viser, at aktiveret MEK undertrykker IFN-induceret transkription i IFN moderat resistente HT1080 celler. Interessant nok fandt vi 111 gener på 6 timer (tabel S1) og 135 gener på 12 timer (tabel S2) blev signifikant induceret af den kombinerede behandling med IFN og U0126 mens enten behandling alene ikke inducerede ekspression, hvilket viser sand synergistisk regulering af genekspression af IFN og Ras /MEK undertrykkelse. Disse gener omfatter mediatorer af anti-viral funktion (f.eks. Apobec3 [26], IFIT2 [27], [28], [29], RSAD2 (viperin) [30], GBP2 [31] og MAP2 [32], [33 ], [34]), aktivatorer af anti-viral signaltransduktion, (f.eks. RIGI [35]), regulatorer af antigen bearbejdning og præsentation (f.eks. IFI30 (forgyldt) [36], BTN3A3 [37] og PSME1 [38] ), og regulatorer af tumorudvikling (f.eks. MMP7 [39]). Da VSV replikerede mere end 30 gange mindre effektivt i HT1080 celler behandlet med IFN og U0126 forhold til gruppen behandlet med IFN kun eller U0126 (Fig. 2B), mener vi, at nogle af de gener opregulerede ved den kombinerede behandling i HT1080-celler (111 gener på 6 timer 135 gener ved 12 timer) har en signifikant anti-viral funktion. Vi derefter sammenlignet generne induceres i HT1080 ved den kombinerede behandling af IFN og U0126 til dem, der induceres i SKOV3 celler ved IFN eneste behandling for yderligere at indsnævre hvilke gener kan være de essentielle gener, der er nødvendige for en beskyttende anti-viral IFN-respons (fig. 3C ). Vi fandt, at 36 gener almindeligvis blev induceret ved 6 timer og 26 gener på 12 timer, i de to forsøgsgrupper (tabel S3).

Gene ontologi (GO) analyse blev udført for at bestemme den biologiske proces i forbindelse med generne identificeret som ændret betydeligt i HT1080 celler behandlet med IFN kun, U0126 kun vejledende, og både IFN og U0126 (tabel 2 og fig. 4). Behandling med U0126 alene eller både IFN og U0126 i 6 timer grupperet sammen indikerer, at disse behandlinger har ændret ekspression af gener med lignende funktioner (GO overrepræsentation). Tilsvarende de 12 timers behandlinger med U0126 alene eller kombineret behandling resulterede i de mest lignende GO overrepræsentation grupper. IFN-only behandlingsgrupper (6 og 12 timer) klynge sandsynligt, fordi en relativt lille antal GO kategorier ændres, når sammenlignet med de andre behandlingsgrupper. Samlet set gener faldt i 312 GO kategorier, der var forbundet med 3 GO overrepræsentation klynger hvor klynge 3 kan yderligere opdeles i 11 undergrupper klynger. Klynger 1, viste 3A, 3B, 3D og 3I øget GO overrepræsentation som reaktion på kombineret U0126 og IFN behandling i forhold til enten behandling alene. Disse klynger inkluderet GO kategorier forbundet med NF-KB-signalering, antiviralt respons, immunrespons, regulering af apoptose, kemokinsignalering, cellulære udvikling, og metabolisme. I modsætning hertil havde klynger 3C, 3E, 3F, 3H og 3K reduceret kategorier GO-overrepræsentation ved kombineret behandling, hvilket indikerer, at tilsætning af IFN-stimulering resulterede i tab af genregulering af gener, der tilhører GO kategorier forbundet med cellemotilitet, DNA-reparation og celledeling. Derfor MEK-inhibering ændrer typer af gener, der kan induceres af IFN behandling ud over at øge det samlede antal gener induceres.

Gener med betydeligt opreguleres eller nedreguleres ekspressionsniveauer sammenlignet med kontrol blev analyseret for overrepræsentation af GO kategori i forhold til den observeret i genomet. Markant overrepræsenterede GO kategorier (FDR 0,05) er vist med den højeste FDR = 0 vist i rødt og kategorier med FDR ≥0.05 eller fraværende vist med blåt

Sammen disse analyser viser, at. Ras /MEK vej undertrykker udtryk for ISGs involveret i antiviral reaktion på flere niveauer, herunder påvisning af patogen forbundet mønstre, aktivering af anti-viral signalering kaskade og direkte anti-virale effektor gener.

Validering af Restaurering af IFN -induceret genekspression ved MEK Inhibition

Kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) blev udført for at bekræfte ændringerne i genekspression observeret i microarray analyse under anvendelse HT1080 celler behandlet med IFN og /eller U0126 (fig. 5 ). Otte gener (IFIT2, GBP2, MAP2, Rigi, STAT2, BTN3A3, MMP7 og ID2) blev udvalgt på grundlag af deres biologiske funktioner og genekspression ændringer som reaktion på IFN og /eller U0126 behandling. IFIT2, GBP2, MAP2 og MMP7 blev opreguleret kun HT1080 celler behandlet med både U0126 og IFN efter 6 timer, mens der blev observeret gen-induktion i IFN alene og U0126 eneste grupper på det senere tidspunkt (12 timer). BTN3A3 blev induceret ved kombineret behandling ved begge tidspunkter, men ikke af U0126 alene eller IFN eneste behandling. Endvidere Ras /MEK-inhibering med U0126 var i stand til at fremme genekspression af RIGI og STAT2 på 12 timer i fravær af IFN, som tidligere beskrevet [17], [40]. Vi fandt, at ID2, som ikke er en IFN-inducerbart gen, blev opreguleret kun ved U0126 behandling og den kombinerede behandling, men ikke af IFN-behandling. De fleste af de ændringer i genekspression blev bekræftet ved RT-qPCR, men på grund af forskellen i følsomhed og statistisk styrke af de to forskellige teknikker, ikke alle gen ændringer blev identificeret som statistisk signifikant i begge analyser. For eksempel blev RIGI fundet at være induceret i HT1080 celler ved IFN eneste behandling anvendelse af RT-qPCR, men ikke i microarray analyse.

Niveauet af genekspression i HT1080 celler venstre ubehandlet, behandlet med IFN (50 U /ml), med U0126 (20 uM) eller med IFN og U0126 i 6 timer eller 12 timer blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Den relative ekspression blev beregnet sammenlignet med 6 timers ubehandlet kontrol efter normalisering mod GAPDH ekspressionsniveauer. (N = 3, * P 0,01 i forhold til tid-matchede kontrol, ** P 0,05 sammenlignet med alle andre grupper).

Effekter af Ras-aktivering på IFN-induceret Transskription i IFN Sensitive SKOV3 celler

for yderligere at undersøge undertrykkelse af IFN transskription af aktiverede Ras, genereret vi SKOV3 celler (IFN-sensitive), der udtrykker konstitutivt aktive Ras mutant (SKOV3-RASV12, klonerne 10 og 15). Ras /MEK-aktivering i de mutante celler blev bekræftet ved Western blot analyse under anvendelse af anti-phosphoryleret ERK, og Ras antistoffer (fig. 6A). Vektor kontrol SKOV3 og SKOV3-RASV12 celler blev behandlet med IFN (0, 12,5, 25, 50 og 100 U /ml) i 16 timer og derefter udfordret med VSV ved en MOI på 1. Western blot-analyse af VSV-G-protein ved 24 timer efter infektion viste, at VSV klart replikerede mere effektivt i Ras-transformerede SKOV3 mutanter (klon 10 og 15) end i kontrolgruppen SKOV3-celler i nærvær af IFN (fig. 6B). Vi målte også afkom virale niveauer 48 timer efter infektion at kvantificere graden af ​​virusinfektion (fig. 6C). Efter aftale med western blot analyse, fandt vi, at afkom virus produktion var signifikant højere i Ras-transformerede SKOV3 mutant end i kontrol SKOV3 celler behandlet med IFN (50 og 100 U /ml). For yderligere at fastslå, om faldet i IFN-følsomhed ved indførelse af aktive Ras induceres af nedreguleringen af ​​IFN-induceret transkription undersøgte vi ændringerne IFN-induceret transkription af 5 gener (GBP2, IFIT2, MAP2, STAT2 og Rigi), som vi tidligere identificeret til at blive nedreguleret af Ras /MEK i HT1080 celler (figur 5). Induktion af GBP2, IFIT2, MAP2 og RIGI blev hæmmet i Ras-transformerede SKOV3 celler i forhold til at styre SKOV3 celler ved 12 timer efter IFN stimulation mens STAT2 induktion ikke var væsentligt påvirket (fig. 7). Disse resultater viser, at aktiveret Ras-signalering undertrykker transkriptionen af ​​visse IFN-inducerbare gener fører til nedgang i cellulær følsomhed for IFN.

(A) Western blot-analyse under anvendelse af anti-Ras, at phosphoryleret ERK eller GAPDH antistof bestemme Ras /MEK-aktivering i kontrol SKOV3 og Ras forvandlet SKOV3 (klon 10 og 15). Kontrol SKOV3 og Ras transformerede SKOV3-celler blev behandlet med IFN (0, 12,5, 25, 50 og 100 U /ml), og derefter udfordret med udfordret med VSV (MOI på 1). Infektion blev vurderet ved (B) Western blot-analyse for VSV-G-protein og GAPDH ved 24 timer infektion og ved (C) afkomsvirus assay ved 48 timer efter infektion.

Ekspressionen af ​​GBP2, IFIT2 , MAP2, RIGI og STAT2 i kontrol SKOV3 og Ras-transformerede SKOV3-celler (klon 15) ved 12 timer efter IFN-stimulering (0, 12,5, 50 og 100 U /ml) blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Den relative ekspression blev beregnet i forhold til de ubehandlede kontrol SKOV3 celler efter normalisering mod GAPDH ekspressionsniveauer. (N = 3, * P 0,05 og ** P 0,01 sammenlignet med IFN-koncentration-matchede kontrol).

Diskussion

Som vist tidligere, nedskrivning af IFN respons i kræftceller betragtes som en af ​​de fælles mekanismer for viral onkolyse [3], [10]. Aktivering af Ras /MEK-vejen er blevet rapporteret at undertrykke antivirale responser induceret af IFN [4], [16], [17], [25], [40]. I denne undersøgelse vi først undersøgte et panel af humane cancercellelinjer og bestemt 1) deres modtagelighed over for IFN til frembringelse af en anti-viral tilstand, og 2) evne til MEK-inhibitor, U0126, at genoprette IFN følsomhed. Vi fandt, at 13 ud af de 16 testede cellelinjer var moderat eller fuldstændigt resistente over for IFN anti-viralt respons. I 10 ud af disse 13 cellelinier blev følsomheden over for IFN genoprettet ved behandling med MEK-inhibitor. Disse resultater antyder, at aktiverede Ras /MEK-vejen ligger til grund cancercelle resistens over for antivirale virkninger induceret af IFN. For yderligere at undersøge den underliggende mekanisme for den undertrykkende virkning af Ras /MEK pathway på IFN-respons, gennemførte vi global genekspression analyse for at bestemme IFN-induceret transskriptionelle aktiviteter i IFN følsomme SKOV3 og IFN moderat resistente HT1080 celler. Vi fandt, at der var en væsentlig reduktion i antallet af gener induceret ved IFN i HT1080 celler sammenlignet i SKOV3-celler (276 gener i SKOV3, 98 gener i HT1080-celler;. Figur 3A). Endvidere MEK inhibition restaureret IFN evne til at aktivere transkription i HT1080-celler, som vi fandt, at yderligere 111 gener på 6 timer og 135 gener på 12 timer blev udtrykt i HT1080 celler behandlet med både IFN og U0126 (fig. 3B), hvilket indikerer, at aktiveret Ras /MEK undertrykker transkription af en gruppe af IFN-inducerede gener. Endelig var vi i stand til at vise, at ekspressionen af ​​konstitutivt aktive Ras i IFN følsomme SKOV3 celler reduceret deres evne til at aktivere IFN-induceret transskription og etablere IFN-induceret antiviral respons. Disse resultater viser tydeligt, at aktiveret Ras /MEK vej undertrykker transskription af visse IFN inducerbare gener til at etablere IFN svækkelse i humane cancerceller.

Vi kan hypotesen flere mulige underliggende mekanismer for den udbredte undertrykkelse af IFN-induceret transskription af Ras /MEK-vejen. 1) Ras /MEK regulerer aktiviteten af ​​en transskriptionel co-regulator til ISGF3, såsom positive co-regulatorer IRF1 [41], [42] og SP3 [43] eller de negative co-regulatorer NF-KB [44] , og IFN-konsensussekvens bindende protein [45]. I dette tilfælde, IFN-inducerbare gener, som kræver op- eller nedregulering af et co-regulator til deres ekspression ville blive undertrykt i celler med aktiveret Ras /MEK. 2) Ras /MEK undertrykker de basale ekspressionsniveauerne af nøglekomponenter i IFN signalvejen. Utilstrækkelige ekspressionsniveauer af disse komponenter fører til den globale svækkelse af IFN-induceret antiviralt respons svarende til den nedregulering af STAT2 udtryk, vi observerer i NIH3T3-celler, der overudtrykker konstitutivt aktive Ras [17]. 3) ekspression af IFN-inducerbare gener kan undertrykkes ved epigenetiske mekanismer. For eksempel kan interaktionen af ​​STAT2 med BRG1 [46], en vigtig del af ATP-afhængige kromatin remodeling SWI1-SnF2 kompleks [46], ændrer udtryk for en delmængde af IFN-regulerede gener. Mens regulering af BRG1 ved Ras ikke er påvist, har nedregulering af det beslægtede protein, BRM1, blevet rapporteret [47]. Tilsvarende Ras-medieret regulering af DNA-methylering [48] eller histon modifikation [49], hvis målrettet mod IFN-regulerede gener, kunne globalt undertrykke deres ekspression. 4) Endelig kan Ras /MEK pathway aktivere eller opregulere negative regulatorer af IFN vejen, såsom SOCS [50] eller PIAS [51]. Disse negative regulatorer kan undertrykke transkription af IFN inducerbare gener identificeret til at være nedreguleres af Ras /MEK i denne undersøgelse.

Analyse af de biologiske processer, der er repræsenteret i de gensæt viste, at antallet af biologiske processer er ramt af IFN og U0126 var højere end både U0126 eller IFN alene. Desuden er antallet af forskellige GO repræsenterede gruppers var højere ved 6 timer sammenlignet med 12 timer i enten U0126 alene eller kombineret behandling tyder på, at langvarig stimulering begrænser antallet af biologiske processer, der kan udføres af de gener, som udtrykkes . Som forventet, IFN kunne regulere gener kendt for reaktionen på virus og NF-KB-signalering, men den kombinerede behandling øgede repræsentation af flere antivirale GO kategorier, såvel som gener er vigtige for cytokin regulering. Endvidere sammenlignet med U0126 alene behandling kombineret U0126 og IFN behandling faldt repræsentation af gener, der er ansvarlige for DNA-replikation og reparation, cellecyklusregulering og cellemotilitet. Samlet, den kombinerede behandling forøgede antivirale /inflammatorisk genekspression respons i forening med nedsat repræsentation af gener, der fremmer vellykket celledeling.

Interessant nok blev en undergruppe af gener induceret almindeligvis af de to beskyttende behandlinger, IFN behandling i SKOV3-celler og kombineret IFN og U0126 behandling i HT1080-celler (tabel S3). Disse gener omfattede C14orf159 gen, der for nylig er blevet vist at have bred anti-viral funktion, og MOV10 og IFI44 gener vist at have mere begrænset antiviral aktivitet [52]. Tilsvarende medlemmer af anti-retroviral APOBEC3 [53] og Indtræk [53] genfamilier blev induceret af begge beskyttende behandlinger. IFIT2 er for nylig blevet påvist at have anti-viral funktion [27], [28], [29] og anti-proliferativ funktion [54]. Desuden IFIT2 interagerer med mikrotubuli [27] tyder på, at IFIT2 kan associere med IFN-opreguleret MAP2 at forstyrre virion samling og /eller transport ved at regulere mikrotubulusdynamik [32], [33], [34]. Desuden identificerede vi også kritiske antivirale gener, såsom guanylat-bindende protein (GBP) -2 [31] og RIGI [35], som er synergistisk induceret i HT1080 celler behandlet med U0126 og IFN. Derfor er disse data giver yderligere beviser på betydningen af ​​disse gener for at etablere en vellykket anti-viral respons. Fremtidige undersøgelser vil søge at identificere de præcise roller af disse gener, enten enkeltvis eller i kombination, til at mediere den beskyttende IFN anti-viral respons og regulering viral onkolyse.

Der var ingen sammenhæng mellem væv oprindelse human cancer celler, der anvendes i denne undersøgelse og følsomhed over for IFN eller evne U0126 at genoprette IFN responsivitet.