PLoS ONE: Virkningen af ​​3D mikromiljø på Fænotype, Gene Expression, og EGFR Hæmning af kolorektal cancer Cell Lines

Abstrakt

Tre-dimensionelle (3D) tumor cellekulturer dyrket i laminin-rig-ekstracellulær matrix ( lrECM) anses for at afspejle humane tumorer mere realistisk sammenlignet med celler dyrket som monolag på plast. Her har vi systematisk undersøgt virkningen af ​​ECM på fænotype, genekspression, EGFR-signalvejen, og på EGFR inhibering i almindeligt anvendte kolorektal cancer (CRC) cellelinier. LrECM on-top (3D) kultur blev udført med CRC cellelinier SW-480, HT-29, DLD-1, LOVO, Caco-2, COLO-205- og COLO-206F. Morfologi af lrECM dyrkede CRC cellelinjer blev bestemt ved fasekontrast og konfokal laser scanning fluorescensmikroskopi. Proliferation af celler blev undersøgt ved MTT-assay, invasive kapacitet af cellelinierne blev analyseret under anvendelse Matrigelcoatede Boyden kamre, og vandrende aktivitet blev bestemt under anvendelse af den Hegn assay. Differentiel genekspression blev analyseret på det transskriptionelle niveau af Agilent arrayet platform. EGFR blev inhiberet ved anvendelse af den specifikke småmolekyle-inhibitor AG1478. En specifik sfæroid vækstmønster blev observeret for alle de undersøgte CRC cellelinier. DLD-1, HT-29 og SW-480 og Caco-2 udviste en klar fast tumor celle dannelse, mens LOVO, COLO-205- og COLO-206F blev karakteriseret ved dannelse drue-lignende strukturer. Selvom forekomsten af ​​en sfæroid morfologi ikke korrelerer med en ændret vandrende, invasiv eller proliferativ kapacitet af CRC cellelinier blev genekspression betydeligt forandrede i celler dyrket på lrECM sammenlignet med 2D kulturer. Interessant nok i KRAS-vildtypen cellelinjer, hæmning af EGFR var mindre effektivt i lrECM (3D) kulturer sammenlignet med 2D cellekulturer. Således sammenligner både 2D og 3D cellekulturmodeller, understøtter vore data indflydelsen af ​​ECM på cancervækst. Sammenlignet med konventionelle 2D cellekultur den lrECM (3D) cellekultur model giver mulighed for at undersøge permanente CRC cellelinier under mere fysiologiske betingelser, dvs. i forbindelse med molekylære terapeutiske mål og deres farmakologiske inhibering

Henvisning.: Luca AC, Mersch S, Deenen R, Schmidt S, Messner I, Schäfer KL, et al. (2013) Virkningerne af 3D mikromiljø på Fænotype, Gene Expression, og EGFR Hæmning af kolorektal kræftceller. PLoS ONE 8 (3): e59689. doi: 10,1371 /journal.pone.0059689

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: August 29, 2012; Accepteret: 17 Februar 2013; Udgivet 26. marts, 2013 |

Copyright: © 2013 Luca et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Forschungskommission af det medicinske fakultet, University Düsseldorf (41/09 til AK og 24/10 til KLS), Rudolf Bartling-Stiftung (II /98 til NHS) og ved tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB . 728) og NRW forskerskolen “BioStruct” (begge til RPP) de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. det forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Permanente kræftceller kan give en næsten ubegrænset forsyning af celler med ganske lignende genotyper og fænotyper [1], og er stort set de eneste mulighed for mekanistiske undersøgelser af humane cancerceller under kontrollerede forhold [2], [3]. Derfor har menneskelige kræftceller er ofte blevet brugt som

in vitro

modeller for human cancer. Et eksempel på en vellykket og godt bemærket anvendelsesområde har været opdagelsen, udvikling og afprøvning af kræftlægemidler [3]. Ikke desto mindre, afhængigt af det videnskabelige spørgsmål er der også tydelige begrænsninger i at studere ændringer på kræftceller, der er forbundet med kræft progression, da de fleste permanente kræftceller er blevet etableret fra fremskredne kræftformer med fremskredne genotyper [1]. Men en af ​​de væsentligste problemer, der begrænser værdien af ​​cancercellelinjer som en model for human cancer skyldes det mest almindelige metode til kultur cellelinier

in vitro

, dvs. som homotypisk monolag på plastsubstrater (2D ). Henviser primære cancere og metastaser er komplekse heterotypiske tredimensionale strukturer indlejret i distinkte organspecifikke mikromiljøer, er det velkendt, at celler, der dyrkes som klassiske 2D kulturer løs mange af kendetegnene ved deres

in vivo

modstykker [ ,,,0],4]. Desuden kan vigtige cellulære funktioner, såsom proliferation og differentiering kunstigt ændret [5].

Fælles for alle normale og maligne epitelceller er, at de er fysiologisk i tæt kontakt med den ekstracellulære matrix (ECM) . ECM, sammensat af fibrøse proteiner og glycosaminoglycaner, omgiver epitelceller i deres ekstracellulære rum og danner deres basale membran. ECM giver ikke kun fysisk styrke til organiserede epitelceller [6], [7], men også vigtige vigtige biokemiske strukturer og signaler for polaritet og vækst [7], [8]. Et simpelt system til

in vitro

ECM modellering er en oplukket præparat basalmembran ekstraheret fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muse sarkom, en tumor rig på ekstracellulære matrixproteiner omfatter laminin, collagen IV, heparinsulfat-proteoglycaner og entactin /nidogen [9] – [18]. På grund af sin molekylære sammensætning, især dens høje laminin indhold, anses det for at være en egnet erstatning for basalmembranen. Hvis epitelceller dyrkes inden for denne laminin-rige ekstracellulære matrix (lrECM), de vokser som tre-dimensionelle strukturer [15], [16], [19]. Banebrydende arbejde af Bissell gruppe og andre – primært gjort på primære bryst celler og brystkræft cellelinier – demonstreret dramatiske morfologiske og biokemiske forskelle, mellem normale og maligne celler dyrket 2D på plastik substrater og 3D i lrECM henholdsvis [6], [20 ], [21]. Fra et klinisk synspunkt er det vigtigt at bemærke, at lrECM (3D) kultur – som model tættere på

in vivo

situationen – kan føre til forskellige reaktioner på molekylære behandlinger, som for nylig vist for brystkræft celle linjer [22], [23], [24]. Overraskende er lrECM (3D) kulturer stadig sjældent brugt i forsøg med kræft cellelinjer og kun få undersøgelser har systematisk analyseret virkningerne af lrECM kulturer på permanente cellelinier giver grundlæggende oplysninger om disse modeller. Hidtil disse systematiske analyser af lrECM kulturer fokuserede primært på den fænotypiske karakterisering af brystkræft cellelinjer dyrket under lrECM 3D

vs.

2D betingelser.

Her udvidede vi den funktionelle forståelse af virkningerne af forskellen lrECM (3D)

vs.

2D vækstbetingelser til tyktarmskræft celler. Vi systematisk undersøgt virkningen af ​​lrECM på celle fænotype og genekspressionsmønstre i almindeligt anvendte kolorektal cancer (CRC) cellelinjer. Vores data indikerer, at CRC-cellelinjer udviser distinkte morfologisk sfæroide former, når de dyrkes i lrECM. Selv kugleformet morfologi CRC linjer ikke korrelerer med en ændret vandrende, invasiv eller proliferativ celle kapacitet, cellelinjer dyrket under lrECM (3D) betingelser udstillet

per se

en forringet spredning i forhold til at styre 2D kulturer. Desuden blev genekspression betydeligt forandrede i CRC cellelinjer ved dyrkning under lrECM /3D betingelser. Desuden blev effekten af ​​farmakologisk EGFR inhibition forringet i CRC celler dyrket på lrECM sammenlignet med 2D kulturer. Således 3D mikromiljø har en stor indvirkning på cellulær fænotype og farmakologisk følsomhed CRC cellelinjer.

Materialer og metoder

cellelinjer og Cell Culture

LOVO blev opnået fra European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK), COLO-205 fra American Type Culture Collection (ATCC, LGC Standards GmbH, Wesel, Tyskland), Caco-2, COLO-206F, DLD-1, HT-29 og SW-480 fra den tyske Resource Center for Biologisk materiale (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). Alle cellelinjer blev opretholdt under standard cellekultur betingelser i RPMI 1640+ GlutaMAX ™ -I (Gibco /Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Gibco /Invitrogen,). Celler blev dyrket enten på vævsdyrkningsplast (2D) (Greiner bio-one, Frickenhausen, Tyskland) eller 3D inden vækstfaktor reduceret laminin-rige ekstracellulære matrix (lrECM 3D) on-top kulturer ved podning celler på toppen af ​​en tynd gel af Engelbreth-Holm-Swarm tumorekstrakt (BioCoat Matrigel basalmembran, vækstfaktor reduceres, BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Celler blev udpladet i Matrigel on-top assay ved en densitet på 1,8 X 10

4 celler /brønd plader godt i 24. Spheres blev dyrket i 7 dage før den igen fra Matrigel. For morfologi undersøgelser blev sfærer dyrket op til 10 dage. Medium blev ændret hver anden dag i 3D kulturer. 3D sfærer blev udvundet fra Matrigel basalmembran ved at fjerne mediet fra Matrigel cellekultur og inkubation i 400 pl /brønd dispase (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland), forvarmet til 37 ° C, i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO

2. Aktiveringen af ​​dispase blev standset med 10 mM EDTA i 1 × PBS. Sfærer blev centrifugeret og vasket med 1 × PBS. 2D dyrkede celler blev også vasket med PBS og skrabet af dyrkningsskålen. For protein isolation 3D sfærer blev udvundet fra Matrigel ved inkubation med 5 mM EDTA i PBS i 30 minutter på is, efterfulgt af tre vasketrin med PBS.

KRAS og BRAF Mutation Analyse

Standard cyklus sekventering blev udført for at (gen) evaluere

KRAS

BRAF

mutation status coloncarcinom cellelinjer (tabel 1). Exon 2, 3 og 4 i

KRAS

blev analyseret under anvendelse af følgende oligonukleotidprimere: 5′- AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 ‘og 5’AAAGAATGGTCCTGCACCAG-3′ for exon 2, 5’-GGATTCCTACAGGAAGCAAGT-3 ‘og 5 ‘-GGCAAATACACAAAGAAAGC-3’ for exon 3 og 5’AGACACAAAACAGGCTCAGGA-3 ‘og 5’AAGAAGCAATGCCCTCTCAA-3’ for exon 4.

BRAF

amplifikation af Exon 15 blev udført ved anvendelse af fremadrettet primer 5 ‘ – TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG-3 ‘og revers primer 5’AGCCTCAATTCTTACCATCCA-3’. Henviser reverse primere blev anvendt til DNA-sekvensanalyse af

KRAS

Exon 2 og 4, fremadrettede primere blev anvendt til

KRAS

exon 3 og BRAF Exon 15, henholdsvis [25].

STR analyse

i STR fingeraftryk analyse DNA blev isoleret ved anvendelse af Qiagen Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktion. Genomisk DNA (1 ng) blev amplificeret under anvendelse af genRES® MPX-2 og genRES® MPX-3 multiplex PCR systemer (Serac GmbH, Bad Homburg, Tyskland) for at generere 9 og 12 forskellige STR markørsekvenser. PCR-produkter blev analyseret på en ABI 310 kapillær sequencer og allelotyped af “GENOTYPER V3.1” software (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [26].

cellelevedygtighed, celleproliferation og apoptose Assays

Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af MTT-assayet. Celler blev udpladet ved en densitet på 2 x 10

3 celler /brønd i 96 brønd plader. Hvorimod celler blev udpladet direkte på væv plastplader for 2D-kulturer blev 3D kulturer fremstillet ved udpladning af cellerne på et tyndt lag af Matrigel. Efter en inkubationsperiode i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO

2, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma-Aldrich, Hamburg, Tyskland) blev tilsat til medierne for 4 timer før fiksering natten over med MTT stopopløsning indeholdende 10% SDS, 5% 1-butanol og 0,01 M HCI. Reduktion af MTT til formazan blev målt ved 540 nm under anvendelse af et Tecan solopgang fjernlæser (Tecan Group Ltd., Maennedorf, Østrig).

Proliferation af celler dyrket i 2D eller 3D dyrkningsbetingelser blev kvantificeret ved 5-brom- 2-deoxyuracil (BrdU) inkorporering ved hjælp af 5-brom-20-deoxy-uridin Mærkning og Detection Kit i (Roche) efter producentens anvisninger. Efter en inkubationsperiode i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO

2 medium blev fjernet, og cellerne blev inkuberet i yderligere 1 time ved 37 ° C og 5% CO

2 med BrdU mærkning medier. 3D sfærer blev udvundet fra Matrigel ved inkubering med 5 mM EDTA i PBS i 30 min. Celler blev vasket to gange i 1 × PBS og centrifugeret i 5 minutter ved 400 rpm. Nyttiggjorte sfæroider blev coatet på objektglas og tørret natten over ved stuetemperatur. Kerner blev modfarvet med 40,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Op til 200 celler blev talt i fem forskellige felter pr præparat under anvendelse af en Axio Anvendelsesområde fluorescensmikroskop (Zeiss, Jena, Tyskland). Antallet af prolifererende celler blev beregnet som en procentdel af det samlede antal DAPI-positiv celler pr (tre tilfældigt udvalgte felter pr dækglas). Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev beregnet som forholdet mellem antallet af DAPI-positive celler med fragmenterede kerner, kendt som en morfologisk kendetegn for apoptose, og alle DAPI-positive celler.

Hegn Assay (Migration Assay)

For migration analyser 7.5 × 10

3 celler blev udsået i en 16 mm hegn (Aix Scientifics®, Aachen Tyskland). Celler blev dyrket i RPMI-medium suppleret med 10% FBS indtil sammenløb blev nået, og hegnet blev fjernet. Celler blev dyrket i fire dage, derefter fikseret i 10% formaldehyd og farvet med Mayers haemalaun farveopløsning. Diametre af farvede cellemonolag blev vurderet i mm ved hjælp af Versa Doc Imaging System (BioRad, München, Tyskland). At skelne mellem celleproliferation og cellemigrering, blev udført pre-eksperimenter i kulturmedie suppleret med 1% FBS eller 10% FBS.

Invasion Assay

Invasion assay blev udført under anvendelse af BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasion Chamber (BD Biosciences) følge anvisningerne fra producenten. Membraner blev fikseret på objektglas og farvet med krystalviolet. Celler inden for et afgrænset centralt område af membranen blev talt.

Drug Treatment og proliferationsassav

EGF-receptor blev inhiberet af tyrosinkinaseinhibitoren tyrphostin AG1478 (Sigma-Aldrich). Celler blev udpladet ved en densitet på 6 x 10

3 celler /brønde brønd i 96 og behandlet med AG1478 ved en slutkoncentration på 20 uM, 10 uM, 5 uM, 2,5 pM, 1 pM eller 0,1 uM i 48 timer og 96 timer i 2D og 3D cellekultursystemer. DMSO /methanol ved ækvimolære koncentrationer til AG1478 koncentrationer tjente som kontrol køretøj. Otteogfyrre timer efter lægemiddelbehandling celleproliferation blev målt ved at udføre MTT-assays som beskrevet ovenfor.

Total RNA Extraction og cDNA Synthesis

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. RNA blev fortyndet i 50-80 pi nuclease fri og sterilt vand. RNA-koncentrationen blev målt spectrophometrically ved 260 nm og RNA kvalitet blev vurderet ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer. Til cDNA-syntese, revers transkription (RT) blev udført i et slutvolumen på 20 pi ved anvendelse 01:10 fortyndet oligo (dT) primer (Invitrogen), 2 ug RNA, og 4 U transcriptor revers transkriptase i 5 × RT puffer (Roche , Mannheim, Tyskland).

Real Time PCR

Primere og efter sonder blev designet ved hjælp af Universal ProbeLibrary Assay design center (ProbeFinder udgave 2.45, Roche Applied Science). Primere blev alle syntetiseret ved MWG-Biotech, Ebersberg, Tyskland (tabel S1). cDNA blev fortyndet til en slutkoncentration på 1 ng /pl. Til PCR blev 2 pi cDNA skabelon (eller vand som negativ kontrol) blandet med 12,5 pi Fast Start Taq Man Probe Master mix (Roche), 0,25 pi af hver forward og reverse primer (20 pM hver) og 0,25 pi probe (Universal ProbeLibrary Set menneske, Roche). Alle prøver blev kørt tredobbelt. At normalisere ekspressionen af ​​målgener, anvendte vi glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) som den interne reference-genet. Kvantitativ real-time-PCR (qPCR) blev udført på den DyadDisciple Chromo 4 (BioRad) ved anvendelse af følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler hver omfatter denaturering i 15 sekunder ved 95 ° C, annealing og ekstension i 1 min ved 60 ° C. Genekspression blev kvantificeret ved hjælp af 2

-ΔΔCT metode [27].

immunblotting

Celler blev homogeniseret i protein lysepuffer Pb1 (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1% Nonident P40 (Sigma) suppleret med en tablet phosphataseinhibitor Cocktail Tabletter og PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail (Roche). Opløselige proteiner blev separeret ved centrifugering i 10 minutter ved 4 ° C og 12000 rpm. prøver indeholdende 40 ug klarede proteinlysater per bane blev adskilt elektroforetisk på SDS-PAGE-geler og overført til nitrocellulosemembraner membraner blev probet med monoklonalt kanin-anti-EGF-receptor-antistof. (Klon C74B9, Cell Signaling, Denver, MA, USA). natten over ved 4 ° C i påvisning af Akt1- monoklonalt kanin-anti-phospho Akt1 (Ser473) antistof (Klon 193H12; Cell Signaling) og monoklonalt kanin-anti-Akt1- antistof (Klon C73H10; Cell Signaling). blev anvendt MAPK p44 /42 blev påvist under anvendelse monoklonalt kanin-anti-phospho p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) antistof (Klon 20G11; Cellesignalering) og monoklonalt kanin-anti-p44 /42 MAPK-antistof (Klon 137F5; cellesignalering). Påvisning af MEK1 /2 blev udført ved anvendelse af polyklonalt kanin-anti-phospho MEK1 /2 (Ser217 /221) antistof (Cell Signaling) og monoklonalt kanin-anti-MEK1 /2-antistof (klon 47E6, Cell Signaling). For ikke-phospho (aktiv) β-Catenin (Ser33 /37 /Thr41) brugte vi monoklonalt kanin antistof klon D13A1 (Cell Signaling) og for total β-Catenin monoklonalt kanin antistof klon D10A8 (Cell Signaling). Beta-actin blev påvist under anvendelse monoklonalt muse-anti-β-actin-antistof (Klon AC-15; Sigma). Sekundært anti-kanin-antistof (Cell Signaling) eller anti-muse-antistof (Sigma) bundet til peberrodsperoxidase blev inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur og iagttages med det Immun-Star ™ Western C ™ Kit (BioRad) ved anvendelse af Versa Doc Imaging System (BioRad).

Konfokal immunfluorescensmikroskopi

Genvundne sfæroider blev coatet på objektglas, tørres natten over ved stuetemperatur og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Objektglas blev rehydreret i 1 × PBS og fikseret med iskold methanol /acetone (01:01) i 20 min ved -20 ° C efterfulgt af to vasketrin i 1 × PBS hver i 5 minutter. Blokering blev udført i immunofluorescens buffer indeholdende 4% bovint serumalbumin og 0,05% saponin i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur. Farvning blev udført i PBS indeholdende 1% BSA og 0,05% saponin natten over ved 4 ° C. Muse monoklonalt anti-EpCAM-antistof BerEp4 (Dako, Hamburg, Tyskland) blev anvendt ved en koncentration på 2 ug /ml. MOPC (Sigma) tjente som isotypekontrol og blev inkuberet ved en koncentration på 2 pg /ml. Derefter blev prøverne vasket tre gange med 1 × PBS. Sekundært antistof, Alexa Fluor® 488 gede-anti-muse-IgG (Invitrogen), blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i en koncentration på 10 ug /ml, efterfulgt af to vasketrin hver i 5 minutter. Celler blev modfarvet med 0,1 ug /ml DAPI (Sigma) i 1 × PBS i 4 min, vasket to gange med PBS, og monteret med Vectashield® opløsning (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Billeder blev opnået ved anvendelse af en LSM510-Meta konfokal mikroskop (Zeiss, Jena, Tyskland) udstyret med en 40 × /1,3 nedsænkning objektive og excitationsbølgelængder på 364 nm og 488 nm. Konfokale viste billeder er enkelte optiske lysbilleder af 0,5 um tykkelse.

Klassifikation af Spheroids

I et tidligere arbejde af Bissell gruppen [2] blev det vist, at permanente brystkræft cellelinier, der var dyrket i den standardiserede lrECM on-top assay udviklet af denne gruppe, dannet sfæroider, som udviste karakteristiske vækst-mønstre som afsløret ved fasekontrastmikroskopi eller konfokal laser scanning mikroskopi. Den klumpformet morfologi blev klassificeret i fire forskellige mærkbare grupper som beskrevet af Kenny

et al

[2]:. “Round ‘,’ masse ‘,’ drue-lignende” og “stjerneformet”. Den “runde” type danner kolonier på toppen af ​​geler karakteriseret ved kerner, der regelmæssigt organiseret omkring midten af ​​kolonien. De “masse” typen cellelinjer danner kolonier, også kan have runde koloni skitserer på fase kontrast mikroskopi, men har fyldt centre og uorganiseret kerner. De “drue-lignende ‘sphæroider vises løs celle-celle kontakter med en typisk drue-lignende morfologi. ‘Stjemeformige’ sfæroider blev karakteriseret ved en invasiv fænotype med stjerneformige fremspring invaderende gelen [2]. Vi brugte dette system til at klassificere CRC cellelinje sfæroider

genekspression Analyser:. Agilent Array Analyser

I alt RNA præparater blev analyseret for RNA integritet ved Agilent 2100 Bioanalyzer. Alle prøver i denne undersøgelse viste fælles høj kvalitet RNA Integrity Numbers (Rins) af 10. RNA blev kvantificeret ved fotometrisk NanoDrop måling. Syntese af cDNA og efterfølgende fluorescerende mærkning af cRNA blev udført ifølge producentens protokol (One-Color mikroarray-baseret genanalyse, lavt input Hurtig Amp Mærkning, Vers 6,5;. Agilent Technologies). Kort fortalt blev 100 ng af total RNA omdannes til cDNA efterfulgt af

in vitro

transkription og inkorporering af Cy3-mærket nukleotider i nysyntetiseret cRNA. Efter fragmentering, blev mærket cRNA hybridiseret til Agilent Menneskelig 8 × 60 K High Density Oligonucleotid Microarrays. Data analyser blev udført med GeneSpring GX software (Vers 10.5;. Agilent Technologies). Signalintensitet distributioner tværs prøver blev normaliseret ved fraktil normalisering. Input data forbehandling blev indgået af baseline transformation til medianen af ​​alle prøver. Efter gruppering af prøver i henhold til kultur tilstand (lrECM 3D

vs.

2D kultur, 24

vs.

25 prøver, henholdsvis) en given udskrift skulle udtrykkes i mindst 75% af prøverne helst af to eller begge grupper, der skal analyseres yderligere. Påviselig genekspression over baggrunden blev dermed præget af “Present” flag efter GeneSpring standardindstillinger for Agilent microarrays. Differentiel genekspression blev statistisk bestemt ved Mann-Whitney-U-test. Resulterende

P

-værdier blev korrigeret for flere test i henhold til Benjamini-Hochberg. Udskrifter, der viser et korrigeret

P

corr-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som værende forskelligt udtrykt. Hierarkiske klynge analyser blev enten udført på prøver eller på udskrifter, henholdsvis ved hjælp af Manhattan distance målinger og komplet kobling.

Statistik

Alle forsøg blev udført selvstændigt i tre eksemplarer med mindre andet er angivet. Data repræsenterer middelværdier ± SD med mindre andet er angivet. Korrelation mellem sfæroid morfologi og cellelinie kilde (primær tumor

vs.

Metastase) blev bestemt ved anvendelse af Fishers eksakte test (prisme 5, Graph pad Software, Inc. La Jolla, CA, USA). Forskelle i cellelevedygtighed målt ved farvestof absorbans ved 540 nm, celleproliferation, apoptose og i genekspression målt ved RT-PCR blev analyseret under anvendelse af enten en parret t-test eller parametrisk tosidede Mann-Whitney-U-test. En

P

-værdi mindre end 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans. IC

50 værdier blev beregnet med Prism 5 (Graph pad Software, Inc.).

Resultater

CRC cellelinier Exhibit to forskellige morfologiske kugleformede Typer når kulturperler i lrECM

først testede vi, om CRC cellelinjer vokser på lrECM vise en specifik morfologi, der kan klassificeres i henhold til de fire kategorier, der er beskrevet af Kenny

et al

[2]. Brug af on-top assay alle undersøgte CRC cellelinjer dannet tumor sfæroider inden for to dage. Inden for tre dage mere sfæroiderne udviklet en særlig morfologi, som var replikerbar i mindst ti uafhængige forsøg. Mens sfæroider blev langsomt vokser i størrelse, denne morfologi var stabil op til 10 dages dyrkning. Længere observation eksperimenter blev ikke gjort. Blandt disse cellelinjer blev tre forskellige vækstmønstre observeret af fase-kontrast mikroskopi (figur 1A): “Round”, “masse” og “drue-lignende”. Især blev Caco-2 kategoriseret som “runde”, HT-29, DLD-1, og SW-480 som “masse” og LOVO, COLO-206F og COLO-205 som “drue ligesom”.

A) vækst morfologi CRC cellelinjer dyrket under 2D (øverste panel) og lrECM 3D on-top assay betingelser (lavere panel). Celler dyrkes i 3D tilstand enten vise en runde (Caco-2), masse (DLD-1, HT-29, SW-480) eller en drue-lignende morfologi (COLO 205, COLO-206F, LOVO) i fasekontrast billeder. Scale barer: 100 um. B) Konfokal laser scanning fluorescens mikroskopi billeder af CRC sfæroider. Sfæroider blev dyrket i lrECM 3D mikromiljøer i syv dage. Efter isolation blev membranøs EpCAM-protein (grøn) farvet ved anvendelse Alexa Fluor® 488 gede-anti-muse-IgG. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Scale barer 10 um.

For at øge den rumlige opløsning og morfologiske udseende af forskellige 3D sfæroiderne, vi udførte konfokal mikroskopi af celler ved lokalisering af epitelial celleadhæsionsmolekyle EpCAM og nukleinsyre farvning med DAPI (figur 1B). Derfor Caco-2 sphæroider tydeligt angivet uorganiserede kerner og en samlet kompakt struktur med koloni centre optræder tæt fyldt, bliver derfor re-klassificeres som “masse”. I alle andre cellelinjer konfokal billedbehandling valideret deres oprindelige klassifikation ved fasekontrastmikroskopi. Interessant, bemærkede vi, at cellelinjer med helt andre 2D morfologier (dvs. COLO-205 og LoVo) udstillet lignende morfologier i lrECM og

omvendt

.

Sfæroide Morfologi ikke korrelerer med migrerende, Invasive eller proliferativ Kapacitet CRC cellelinier

Efter at vi definerede de to divergerende sfæroide morfologier af lrECM dyrkede CRC-cellelinjer, dvs. “masse” eller “drue-lignende”, vi var interesseret, hvis denne observation var relateret til forskellige cellulære egenskaber med hensyn til en ændret maligne potentiale. I denne sammenhæng er det bemærkelsesværdigt, at alle de undersøgte CRC cellelinjer med “drue-lignende” morfologi stammer fra metastatiske celler, hvorimod alle CRC cellelinjer med “masse” klumpformet morfologi blev etableret fra primær tumor væv (Fishers eksakte test, p = 0,028) (tabel 1).

først blev cellelevedygtighed bestemt ved anvendelse af MTT-assayet. Ingen signifikante forskelle i cellelevedygtighed mellem celler i “masse” fænotype sammenlignet med celler af den “drue-lignende” fænotype blev klart. Interessant, når man sammenligner levedygtighed, proliferation og apoptose af celler vokser todimensionalt på vævsdyrkningsplast (2D) med lrECM 3D on-top assay fandt vi et signifikant fald i cellelevedygtighed og proliferation under lrECM 3D betingelser (figur 2A og B ). I modsætning hertil blev klart ingen forskel, når kvantificere apoptotiske celler i 2D og lrECM 3D dyrkningssystemer (figur 2 C).

Celler blev dyrket under 2D eller 3D betingelser. A) Cellelevedygtighed blev målt 48 h senere anvendelse af MTT-assayet. Værdier repræsenterer middelværdien absorbans ved 540 nm ± SD af triplikater. Hvide søjler repræsenterer celler dyrket på plast (2D); sorte bjælker celler dyrket på lrECM (3D). To-tailed

P

-værdier blev beregnet af Mann-Whitney-U-test (** angiver en

P

-værdi 0,001; ns = ikke signifikant). B) Celleproliferation blev kvantificeret ved beregning af procentdelen af ​​celler med BrdU-inkorporering og det samlede antal DAPI-positive celler pr felt (mindst tre tilfældigt udvalgte felter pr dækglas). De viste data er gennemsnit ± SD fra tre gentagelser. Hvide søjler repræsenterer celler dyrket på plast (2D); sorte bjælker celler dyrket på lrECM (3D). To-tailed

P

-værdier blev beregnet ved den parrede t-test (* angiver en

P

-værdi 0,05; ns = ikke signifikant). C) Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev beregnet som forholdet mellem DAPI-positive celler med fragmenterede kerner og alle DAPI-positive celler. De viste data er gennemsnit ± SD fra tre replicates.White søjler repræsenterer celler dyrket på plast (2D); sorte bjælker celler dyrket på lrECM (3D). To-tailed

P

-værdier blev beregnet ved den parrede t-test (ns = ikke signifikant). D) Migration af CRC cellelinjer blev kvantificeret under anvendelse hegnet assay. Data repræsenterer middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. Hvide søjler repræsenterer cellelinjer klassificeret som massetype; sorte bjælker drue-lignende klasse.

Ifølge de morfologiske typer observeret i lrECM 3D kulturer, vi udforskede vandrende og invasive kapacitet CRC cellelinjer. Ved hjælp af et hegn assay at udforske migration og et Boyden kammer assay belagt med Matrigel at kvantificere invasion, har disse eksperimenter ikke afsløre nogen tydelige forskelle med hensyn til den vandrende eller invasive kapacitet, når man sammenligner den “masse” og “drue-lignende” CRC-cellelinjer (Figur 2D og tabel 2). Således er en sammenhæng mellem invasiv og morfologisk typen blev ikke indlysende.

genekspression Altered i lrECM 3D “On-top” Dyrket CRC Celler

Den iagttagelse, at CRC cellelinjer ikke blot danner typiske sphæroider i lrECM 3D, men også udviser en nedsat proliferation i lrECM, tyder på en generel forskel i genekspression niveauer mellem 2D og lrECM 3D kulturer. For at identificere differentielt udtrykte gener, når man sammenligner 2D og lrECM 3D dyrkede celler undersøgte vi transkriptomet af celler dyrkning under 2D- og 3D-lrECM betingelser ved hjælp af Agilent human 8 × 60 K High Density Oligonukleotid Microarray platform. Derfor blev udført fire uafhængige eksperimenter, hvor SW-480, HT-29, DLD-1, LOVO, Caco-2, Colo-205 og COLO-206F-celler blev dyrket under 2D eller 3D lrECM betingelser, henholdsvis. I alt blev 49 prøver fra 7 forskellige cellelinjer analyseret, 25 opnået fra 2D og 24 fra lrECM 3D kulturer. Først udførte vi en hierarkisk klyngeanalyse af celler dyrket under 2D eller lrECM 3D betingelser. Som vist i figur 3A, hver cellelinje udviste et karakteristisk transkriptom profil, uafhængig af cellekulturen metoden. Men bortset fra HT-29 og LOVO, inden for hver cellelinje klynge, 2D versus lrECM 3D dyrkningsbetingelser var klart adskilt, hvilket indikerer forskelligt regulerede gener mellem 2D og lrECM 3D kulturer. Efterfølgende analyse viste, at 225 gener blev udtrykt markant forskellige niveauer, når man sammenligner celler opretholdt i 2D og lrECM 3D kulturer (figur 3B). Pathway-analyse under anvendelse GeneSpring GX 10.5 software identificerede 14 differentielt regulerede gener, der vides at interagere med hinanden.