PLoS ONE: Udpræget Gene Expression Underskrifter i Lynch syndrom og familiær Kolorektal Cancer Type X

Abstrakt

Introduktion

Arvelighed anslås at forårsage mindst 20% af kolorektal cancer. Den HNPCC delmængde er opdelt i Lynch-syndrom og familiær kolorektal cancer type X (FCCTX) baseret på tilstedeværelsen af ​​mismatch reparation (MFR) gen defekter.

Formål

Vi talte til genekspression signaturer i kolorektal cancer knyttet til Lynch-syndrom og FCCTX med det formål at identificere kandidatgener og kortlægge signalveje relevante i arvelig kolorektal carcinogenese.

Eksperimentel design

18 k hel-genom c- DNA-medieret udglødning, udvælgelse, udvidelse, og ligation (WG-DASL) assay blev anvendt til 123 kolorektal kræft, herunder 39 Lynch syndrom tumorer og 37 FCCTX tumorer. Målgener blev teknisk valideret ved hjælp af real-time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og udtrykket signaturen blev valideret i uafhængige datasæt.

Resultater

tarmkræft knyttet til Lynch-syndrom og FCCTX viste distinkte genekspressionsprofiler, som ved signifikans analyse af microarrays (SAM) afveg 2188 gener. Funktionelle involverede veje var relateret til G-protein-koblet receptor signalering, oxidativ phosphorylering, og cellecyklus funktion og mitose. QRT-PCR verificerede ændret ekspression af de udvalgte gener

NDUFA9, AXIN2, MYC, DNA2

og

H2AFZ

. Anvendelse af 2188-genet signatur til uafhængige datasæt viste stærk korrelation til MFR-status.

Konklusion

Forskellige genetiske profiler og deregulering af forskellige kanoniske veje gælder for Lynch-syndrom og FCCTX og centrale mål heri kan være relevant at forfølge efter raffinerede diagnostiske og terapeutiske strategier i arvelig kolorektal cancer

Henvisning:. Dominguez-Valentin M, Therkildsen C, Veerla S, Jönsson M, Bernstein i, Borg Å, et al. (2013) Særskilte genekspression Signaturer i Lynch syndrom og familiær Kolorektal Cancer Type X. PLoS ONE 8 (8): e71755. doi: 10,1371 /journal.pone.0071755

Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Faculty of Medicine, University of Porto, Portugal

Modtaget: April 29, 2013; Accepteret: 2 Jul 2013; Udgivet: 12. august 2013 |

Copyright: © 2013 Dominguez-Valentin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den danske og den svenske Cancer Midler, fra det svenske Forskningsråd, Lundbeckfonden, den Nilsson Cancer fonden, Kamprad Cancer Fund og Hvidovre Hospital, Danmark. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Arvelighed er en stor risikofaktor for tyktarmskræft. Identificering af enkeltpersoner og familier med øget risiko giver mulighed for målrettet overvågning, som har vist sig at reducere sygelighed og dødelighed af kolorektal cancer [1], [2]. HNPCC (HNPCC) tegner sig for 3-6% af kolorektal cancer. Syndromet er klinisk klassificeres efter de Amsterdam kriterier, som kræver mindst tre HNPCC-associerede cancere, to berørte førstegradsslægtninge og mindst en individuel diagnosticeret før alder 50 [3], [4]. Mellem en tredjedel og halvdelen af ​​de familier, der opfylder kriterierne Amsterdam bære kønscellelinie misforhold reparation (MFR) genmutationer i

MLH1, MSH2, MSH6

eller

PMS2

og betegnes som havende Lynch syndrom [5] – [7]. De resterende familier med en endnu uidentificeret genetisk baggrund viser en overvægt af kolorektal cancer, hyppige synkrone og metachronous adenomatøs polypper og få extracolonic tumorer og betegnes som familiær kolorektal cancer type X (FCCTX) [8], [9]. Sammenlignet med Lynch syndrom, colorektale cancere forbundet med FCCTX udvikle senere, overvejende forekommer i den distale colon og mindre viser ofte karakteristiske morfologiske træk tumorinfiltrerende lymfocytter, dårlig differentiering og mucinproduktion karakteristisk for Lynch syndrom tumorer [8], [10], [11].

data om de genetiske egenskaber og tumorigene veje for FCCTX er knappe, selvom genomiske studier har vist gennemsnitlige 6-8 kopital ændringer med tilbagevendende gevinster 7 p, 7q, 8Q, 13q, 20p og 20Q og tab af 17p, 18p og 18q [9], [12], [13]. To studier har adresseret genekspression profiler og mutation mønstre i FCCTX tumorer og har beskrevet ligheder mellem FCCTX og sporadiske MMR stabile tumorer [14], [15]. Sporadisk kolorektal cancer, MMR defekte tumorer viser distinkte genekspressionsprofiler med opregulering af immunomodulatoriske gener, såsom chaperoner, cytokiner og cytotoksiske mediatorer, varmechok-generne, større histokompatibilitetskompleks gener og apoptose-relaterede gener [16] – [18] . Vi anvendte global genekspression profilering for at afgrænse kandidatgener og differentieret inddragelse af veje inden for HNPCC delmængde af arvelig kolorektal cancer med sammenligning mellem tyktarmskræft knyttet til Lynch-syndrom og FCCTX.

Materialer og Metoder

Etik Statement

projektet blev etisk revideret i København, hvor en dispensation for samling af væv og kliniske data blev ydet. Alle patienter gav informeret samtykke til optagelse i det danske HNPCC registeret i genetiske rådgivning sessioner. Etisk godkendelse til undersøgelsen blev givet fra den videnskabelige og etiske komité på The Region Hovedstaden, Danmark (HD-2007-0032).

Sample Valg og RNA Extraction

Den nationale danske HNPCC register blev anvendt til at identificere tarmkræft fra individer med Lynch-syndrom og FCCTX. Lynch-syndrom blev defineret som familier /personer med sygdomsfremkaldende disponerende germline MMR genmutationer (n = 16 i

MLH1

, n = 13 i

MSH2

og n = 10 i

MSH6

). Immunohistokemisk MMR proteinfarvning og mikrosatellit instabilitet (MSI) analyse blev udført som tidligere beskrevet [11], [13]. FCCTX tumorer blev defineret som tumorer, der er udviklet i familier opfylder Amsterdam kriterier, men viste ingen sygdomsfremkaldende disponerende MFR genmutationer og havde bevaret MMR-funktion. Sporadiske kolorektal kræft blev udvalgt til at repræsentere MFR mangelfulde og MMR dygtige tumorer fra enkeltpersoner uden familie historie af kræft. Kliniske data er opsummeret i tabel 1. I forhold til Lynch-syndrom tumorer, FCCTX tumorer var mere ofte placeret i venstre side af tyktarmen (p 0,00001, Fishers eksakte test) og viste høj eller moderat differentiering (p 0,00001, Fishers eksakte test ). Lynch-syndrom og FCCTX adskilte sig ikke med hensyn til alder ved debut (gennemsnit 53 år versus 58 år) eller tumor stadie.

Ikke-nekrotiske tumor områder blev udvinding makro-dissekeret og RNA blev udført fra tre 5 –

μ

m sektioner af paraffinindlejret tumorvæv [11], [13] med High Pure RNA paraffin Kit (Roche, Castle Hill, Australien) i overensstemmelse med producentens anvisninger. RNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) og prøver gav tilstrækkelig RNA (200 ng) med 260/280 nøgletal . 1.8 blev udvalgt

genekspressionsprofilering

genekspression blev udført på SCIBLU Genomics Center, Lunds Universitet, Sverige. Illumina Bead-array (HumanWG-6 v4 Expression Beadchip, Illumina) blev anvendt ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev totalt RNA omdannes til cDNA under anvendelse af biotinyleret oligo-dT

18 og tilfældig nonamere primere. To assay-specifikke oligonukleotider blev designet til at forespørge en enkelt sammenhængende 50 nt sekvens på hver cDNA. Hver af disse oligonukleotider bestod af to dele: en opstrøms-specifik oligonukleotid (USO) indeholdende en 3′-gen-specifik sekvens og en 5 ‘universal PCR-primer sekvens (P1), mens den nedstrøms-specifikke oligonukleotid (DSO) indeholdt en 5′ genspecifikke sekvens og en anden 3’-universal-PCR-primer-sekvens (P2). Under anvendelse af denne fremgangsmåde, i alt 24,526 oligonukleotidpar (prober) blev udformet og samlet, som tilsammen udgør hele genomet (WG) DASL assay pool (DAP), som svarer til 18,626 unikke gener, baseret på godt kommenteret afledt af National center for Biotechnology Information (NCBI) reference Sequence Database (Build 36,2, version 22). DAP blev derefter annealet til de målrettede cDNA’er, efterfulgt af enzymatiske forlængelse og ligering trin som tidligere beskrevet [19]. Ligerede produkter blev PCR-amplificeret og mærket med en universel Cy3-koblet primer hvorefter enkeltstrengede mærkede produkter blev udfældet og hybridiseret til WG genekspression BeadChips som tidligere beskrevet [20]. BeadChips blev derefter scannet på en BeadArray ™ Reader hjælp BeadScan software (V4.2), under hvilken fluorescensintensiteter blev læst og billeder udvindes.

Dataanalyse

Expression data blev uploadet og behandlet i GenomeStudio software (Illumina, San Diego, CA). Data blev normaliseret ved hjælp baggrund korrektion, kubisk spline metode [21] og plade skalering. RefSeq funktioner med en afsløring

P Drømmeholdet værdi af ≤0.01 i mindst 80% af prøverne blev anvendt, hvilket efterlader 9.218 funktioner til yderligere analyse. Dataene blev uploadet til MeV v4 [22], hvor de blev log2 transformeret og median-centreret tværs analyser. Unsupervised klyngedannelse blev udført på den samlede sæt af CRC prøver ved hjælp af gennemsnitlig sammenkædning clustering med en Pearson korrelation som lighed metrisk. Betydning analyse af microarrays (SAM) [23] blev anvendt til at identificere markant differentielt udtrykte gener med en falsk opdagelse sats (FDR)

≤

5% [24]. Genekspression data er tilgængelige i NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (Tiltrædelse nummer GSE36335). Biologiske veje blev identificeret ved hjælp af web-baserede DAVID software med en FDR

≤

5% [25].

kvantitativ realtids Reverse Transcription PCR (QRT-PCR)

QRT-PCR blev anvendt til teknisk validere øges /formindskes ekspression af 5 cancerrelaterede gener med differentiel ekspression mellem de 4 kolorektal cancer delmængder. Generne blev udtaget til større deregulerede veje og ekspressionsniveauer blev undersøgt i 3 prøver fra hver undertype.

rRNA18S

blev anvendt som intern reference gen og normal colon prøve som en kalibrator. Genspecifikke primere og TaqMan probe sæt til hvert gen blev opnået fra Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reverse transskription og PCR blev udført ved hjælp Quantitect revers transkription kit og sonde PCR kit, henholdsvis (Qiagen, Heidelberg, Tyskland).

Validering i eksterne data

Den arvelige genekspression signaturen blev valideret ved hjælp af GSE4554 datasæt, og de fire største partier af The Cancer Genome Atlas Network (TCGA) RNAseqv2 [26], [27]. For at ligne microarray data, de RPKM værdier TCGA var fraktil-normaliseret, en forskydning på 32 blev tilsat, begrænset til 65.000, og gener blev centreret. Efterfølgende data blev korrigeret for batch variabel. Alle data blev importeret til MeV v4, log2 forvandlet, gener var median-centreret tværs analyser og 50% mindst varierende gener blev fjernet. Uovervåget hierarkisk klyngedannelse blev udført som beskrevet ovenfor. En genekspression geometriske tyngdepunkt blev konstrueret ved midling af udtrykket værdierne for prøverne i Lynch syndrom og FCCTX for hvert gen med henblik på at etablere en signatur klassifikator til nærmeste geometriske tyngdepunkt klassificering. En prøve fra de eksterne datasæt blev tildelt en af ​​de to arvelige delmængder baseret på den maksimale Pearson korrelation sin tyngdepunkt udtryk for de arvelige geometriske tyngdepunkt værdier.

Statistisk analyse

Klinisk forening (tumor placering , differentiering, alder ved debut og fase) i Lynch-syndrom og FCCTX blev bestemt ved hjælp af Fishers eksakte test (med signifikans sat til

P

0,05). De statistiske analyser blev udført ved hjælp af den statistiske software-pakke IBM SPSS Statistics 20 (SPSS, Chicago, IL, USA).

Resultater

Unsupervised hierarkisk clustering analyse i hele serien (herunder 39 Lynch-syndrom tumorer, 37 FCCTX tumorer, 21 sporadiske MMR dygtige tumorer og 26 sporadiske MMR mangelfulde tumorer) identificeret to store undergrupper relateret til MMR status (Figur S1). Den iboende MMR signatur var stærk med 3873 differentielt udtrykte gener, hvoraf 2159 (56%) var opreguleret i MFR defekte tumorer og var relateret til 5 signalveje (tabel S1).

I den arvelige tumor delmængde, SAM identificerede 2188 differentielt udtrykte gener mellem FCCTX og Lynch syndrom tumorer (figur 1). I FCCTX tumorer, G-proteinkoblede signalvejen var opreguleret (FDR = 0,6%), mens Lynch syndrom tumorer viste opregulering af 2 veje relateret til cellecyklus og mitose (FDR = 1,4%) og oxidativ phosphorylering (FDR = 3,5%) (tabel 2).

figuren viser den top-360 differentielt udtrykte gener. Prøver er arrangeret langs X-aksen og vise FCCTX tumorer (grøn) og Lynch syndrom tumorer (blå).

De genekspression profiler af FCCTX tumorer blev tæt knyttet til dem i sporadisk MMR dygtige kolorektal kræft med gener involveret i peptidyl-aminosyre modifikation, enzymforbundet receptor protein signalering og vækstregulering. Ligeledes Lynch syndrom og sporadiske MMR defekte tumorer delte gener involveret i cellecyklusprogression og immunrespons. Sammenligning mellem FCCTX og sporadiske MMR dygtige tumorer afsløret 4 differentielt udtrykte gener, hvorimod sammenligning mellem FCCTX og sporadiske MMR mangelfulde tumorer identificeret 3906 differentielt udtrykte gener. Lynch syndrom tumorer adskilte sig fra sporadiske MMR stabile tumorer med 415 differentielt udtrykte gener og fra sporadiske MMR deficiente tumorer med 91 gener. Blandt sporadiske tumorer, 1384 gener afveg MFR dygtige og mangelfulde tumorer.

De genetiske profiler blev valideret i uafhængige datasæt, dvs. GSE4554 (Affymetrix microarray) og TCGA (RNA-sekventering) [26], [27]. Begge datasæt omfatter primært sporadiske kolorektal sager, herunder 51 MFR stabile tumorer og 33 MMR defekte tumorer i GSE4554 datasættet og 91 MMR stabil, 19 MFR defekte og 28 MMR-lave stabile tumorer i TCGA datasæt. Unsupervised hierarkisk clustering baseret på vores 2188-gen signatur identificeret ved os, resulterede i to store grupper relateret til MFR-status. Den arvelige signatur korrekt klassificeret 82% og 80% af MFR stabile tumorer som FCCTX og 100% og 94% af MMR defekte tumorer som Lynch-syndrom, henholdsvis (figur 2).

a) Clustering baseret på GSE4554 og b) Gruppering baseret på de fire største partier af de TCGA RNAseqv2 datasæt. MMR dygtige tumorer (grøn), mikrosatellitmarkørerne-low tumorer (blå) og MMR mangelfulde tumorer (rød) langs x-aksen.

QRT-PCR-baseret teknisk validering blev udført ved hjælp af 5 kræft-relaterede gener der repræsenterer deregulerede veje observeret i MFR stabile og deficiente tumorer henholdsvis (figur 3). Resultaterne bekræftede forøget ekspression af

MYC

og

AXIN2

i FCCTX tumorer, nedsat udtryk for

NDUFA9

i FCCTX tumorer og i sporadiske MFR dygtige tumorer og øget ekspression af

H2AFZ

i MMR mangelfulde tumorer. blev ikke observeret nogen større forskelle for

DNA2

.

Differentiel udtryk for

MYC, NDUFA9

,

H2AFZ

,

AXIN2

, og

DNA2

blev gjort i 12 repræsentative prøver (3 fra hver gruppe) og QRT-PCR-forhold blev normaliseret til rRNA18S og median centreret.

diskussion

Inden for HNPCC delmængde af arvelig kolorektal cancer, demonstrerede vi markant forskellige genekspression signaturer i FCCTX og Lynch syndrom tumorer, som adskiller sig fra 2188 gener. Baseret på disse genekspression forskelle, vores data tyder på, at MMR status stærk indflydelse genetiske signaturer, også inden fænotypisk lignende familier, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af sporadisk kolorektal cancer [16] – [18], [27], [36] . De FCCTX og Lynch syndrom profiler afveg i 3 store cancer-relaterede veje, primært relateret til cellecyklus andmitosis, oxidativ phosphorylering og G protein-koblet receptor signalering, som er blevet korreleret med kolorektal carcinogenese [18], [28], [29] , [36].

FCCTX tumorer viste opregulering af 1059 gener, flere (n = 16) af som var forbundet med G-protein-koblet receptor pathway (tabel 2). En kandidat mål heri indbefatter

Gnas

gen, der koder for G

α-underenhed, og er beliggende i den 20q13.32 region, der har vist sig at blive opnået i FCCTX tumorer [9], [12], [13]. Aktiverende mutationer i

Gnas

er beskrevet CRC og foreslås, for at fremme tumorgenese gennem aktivering af Wnt og ERK1 /2 MAPK signalveje [28], [29]. Den potentielle tumorigen mekanisme er ukendt, og hot-spot mutation

Gnas

c.601G t er ikke blevet observeret i FCCTX tumorer [12]. Også andre kandidatgener involveret i proliferation og migration, f.eks

CDH26, SRC

Asip

er placeret i 20Q [30], [31]. De FCCTX tumorer viste også opregulering af

PTGER1,

som koder for EP1-receptoren, der kan fremme spredning og kolorektal tumor udvikling gennem ændret funktion af prostaglandin E2 (PGE

2) [32] – [34 ].

Lynch syndrom tumorer viste opregulering af 1129 gener, fx gener involveret i G

1 /S overgang (

CCNE

,

CCNH

,

E2F2

CDK2

), DNA-replikation (

CDC45

,

RPA1

,

RFC5

,

MCM4

POLD3

) og kromosomal organisation og mitose (

CCNB2

,

MLF1IP

,

CASC5

,

KIF2C

og

PLK4

), hvilket er i overensstemmelse med tidligere resultater (tabel 2) [16], [18], [35], [36]. Opregulering af f.eks

WEE1

,

CDKN1A

FANCD2

blev også observeret i vores undersøgelse og er også blevet rapporteret af andre forskere, som kan foreslå inddragelse af cellecyklus checkpoint maskiner [37 ], [38]. Overekspression af checkpoint proteiner er tidligere blevet forbundet med Lynch syndrom og ophævelse af checkpoint maskiner har vist sig at sensibilisere MMR deficiente tumorceller i retning kemoterapi [39], [40]. Også gener involveret i den oxidative phosphorylering pathway, f.eks ATP syntase subunit gener og kompleks I og III subunit gener var blandt dem opreguleret i Lynch syndrom tumorer. Nedregulering af ATP syntase subnit gener og komplekse jeg har III og V-gener blevet korreleret til metastatisk kolorektal cancer og kan forklare den mere aggressive tumor udvikling og dårlig prognose observeret i MMR dygtige tumorer [11], [18], [41] .

i kolorektal cancer, MMR-status er en vigtig diskriminator relateret til markant forskellige genekspressionsprofiler, hvilket understøttes af de 3873 differentielt udtrykte gener i vores serie af MFR mangelfulde og dygtige tumorer [15], [16] , [27]. Betydningen af ​​MMR status blev også observeret, når vi anvendt 2188-genet signatur, diskriminerede mellem Lynch-syndrom og FCCTX til to uafhængige datasæt hovedsageligt indeholder sporadiske tumorer. Signaturen defineret korrekt 80-82% af MFR dygtige og 94-100% af MMR mangelfulde tumorer (figur 2). Adskillige varmechokproteiner og immunrespons-gener (tabel S1) blev opreguleret i MMR defekte tumorer, hvilket understøtter inddragelse af immun-reaktionsmekanismer, uanset om tumoren var forårsaget af kimcellelinje eller somatisk MMR-gen inaktivering [16] – [ ,,,0],18], [42], [43]. I sporadiske samt arvelige MMR dygtige tumorer flere gener i

Wnt

signalering blev opreguleret, der passer godt sammen med sin centrale rolle i kolorektal tumorigenese (tabel S1) [44], [45].

det kan konkluderes, arvelige tarmkræft inden for HNPCC delmængde show distict genetiske profiler med 2188 differentielt udtrykte gener mellem Lynch-syndrom og FCCTX. Disse data lokalisere gener og pathways relevante til at fortsætte efter raffinerede diagnostik og terapi i arvelig kolorektal cancer.

Støtte oplysninger

figur S1.

Uovervåget hierarkisk klyngedannelse af hele datasættet. Den dendogram viser den spontane gruppering af 123 tarmkræft i to store grupper relateret til MFR-status. MMR dygtige tumorer (grøn), herunder FCCTX tumorer og sporadiske MMR dygtige tumorer og MMR mangelfulde tumorer (blå), herunder Lynch syndrom tumorer og sporadiske MMR mangelfuld tumorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0071755.s001

(TIF)

tabel S1.

signalveje opreguleret i MFR dygtige og MMR mangelfulde tumorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0071755.s002

(XLS)

Tak

Vi tak Eva Rambech og Martin Lauss, Onkologisk afdeling, Klinisk Institut Fakultet, Lunds Universitet og Anja Nissen, Klinisk Forskningscenter, Rigshospitalet, Hvidovre for teknisk hjælp og bistand og Sabrina Da Silva, Institut for Medicin og onkologi, Sir Mortimer B Davis-jødisk General Hospital, McGill University, Montreal, Canada for statistisk støtte.