PLoS ONE: Bestråling Mindsker Neuroendokrine Biomarkør Pro-opiomelanocortin i Small Cell Lung Cancer celler in vitro og in vivo

Abstrakt

Baggrund

Lille celle lungekræft (SCLC) er en yderst aggressiv sygdom, der almindeligvis viser terapi-resistent tilbagefald. Vi har tidligere identificeret neuroendokrine og epiteliale fænotyper i SCLC tumorer og den neuroendokrine markør, pro-opiomelanocortin (POMC), korreleret med dårligere samlet overlevelse hos patienter. Imidlertid er virkningen af ​​behandling på disse fænotyper ikke forstået. Den aktuelle undersøgelse havde til formål at bestemme effekten af ​​gentagen strålebehandling på SCLC celle fænotype, fokus på neuroendokrine markør, POMC.

Resultater

Menneskelig SCLC celler (DMS 79) blev etableret som subkutane xenograft tumorer i CBA nøgne mus og derefter udsat for gentagne 2Gy bestråling. I ubehandlede dyr, POMC i blodet nøje spejlet tumorvækst; en ideel karakteristisk for en cirkulerende biomarkører. Efter gentagne lokaliseret bestråling

in vivo

, cirkulerende POMC faldt (p 0,01), parallelt med et fald i tumorstørrelse, men forblev lav, selv når tumorerne genetableret. Det udskårne tumorer viste reduceret og tydeligt heterogen ekspression af POMC sammenlignet med ubehandlede tumorer. Der var ingen forskel i epitel markør, cytokeratin. Der var imidlertid signifikant mere N-cadherin positive celler i de bestrålede tumorer. For at undersøge tumor respons på bestråling blev DMS79 celler gentagne gange bestrålet

in vitro

de overlevende celler valgt. POMC ekspression blev reduceret, mens mesenchymale markører N-cadherin, β1-integrin, fibroblast-specifikt protein 1, β-catenin og Zeb1 ekspression blev amplificeret i de mere bestråling primet celler. Der var ingen konsistente ændringer i epitelial markør udtryk. Cell morfologi ændret sig dramatisk med gentagne bestrålede celler vise en mere aflang form, hvilket tyder på et skifte til en mere mesenchymal fænotype.

Konklusioner

Sammenfattende POMC biomarkør udtryk og sekretion blev reduceret i SCLC tumorer, som voksede igen efter bestråling og i gentagne bestråling (bestråling primet) celler. Derfor POMC ikke længere var prædiktive for tumorbyrde. Dette understreger betydningen af ​​fuldt ud at evaluere biomarkører under og efter behandling for at vurdere kliniske anvendelighed. Endvidere kunne gevinsten i mesenkymale egenskaber i bestrålede celler være tegn på en mere invasiv fænotype

Henvisning:. Meredith SL, Bryant JL, Babur M, Riddell PW, Behrouzi R, Williams KJ, et al. (2016) Bestråling Mindsker Neuroendokrine Biomarkør Pro-opiomelanocortin i Small Cell Lung Cancer Cells

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 11 (2): e0148404. doi: 10,1371 /journal.pone.0148404

Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, UNITED STATES

Modtaget: 28 oktober, 2015; Accepteret: 18 januar 2016; Publiceret: 5 februar, 2016

Copyright: © 2016 Meredith et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Finansiering af SLM, JLB, PWR og RB blev leveret af The Barbara Mawer Endowment fond, BBSRC, Society for endokrinologi. Finansieringen blev også leveret af aftalen mellem EU FP7 Metoxia Grant nr. 222.741 (til KJ Williams, støtte M. Babur)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag af kræft død i den vestlige verden og småcellet lungecancer (SCLC) er den mest aggressive form tegner sig for omkring 15% af alle tilfælde [1]. Denne dårlig prognose skyldes hurtig vækst, tidlig udvikling af fjernmetastaser og næsten uundgåelige tilbagefald med terapi-resistent sygdom [2]. Den nuværende standardbehandling for SCLC er en kombination af kemoterapi og strålebehandling. Når de primære tumorer og metastaser bliver ikke reagerer på behandling, overlevelse for patienter er meget kort. Den manglende effekt af kemoterapi og strålebehandling efter SCLC tilbagefald understreger vigtigheden af ​​at få en mere dybdegående forståelse af de cellulære og molekylære ændringer i tumorer anses terapi resistent.

I øjeblikket strålebehandling gives til SCLC patienter, der med begrænset sygdom og ofte også i udbredt sygdom. Strålebehandling gives i første eller anden runde af kemoterapi i enten en eller to gange daglige doser i 3-5 uger [3]. Radio- og kemo-modstand kan efterlignes

in vitro

og undersøgelser har vist, at bestråling-resistente SCLC celler også udvikler resistens over for andre midler [4,5]. Imidlertid har de fænotypiske karakteristika af bestråling-resistente SCLC celler ikke dokumenteret. Neuroendokrine markører har vist sig nyttige, men er ofte begrænset i deres afsløring og iscenesættelse af SCLC patienter; derfor er mere følsomme og pålidelige biomarkører forsøgt at styrke diagnose og prognose.

Overskydende cirkulerende POMC, forløberen for stress hormon, adrenocorticotropt hormon (ACTH), er mest almindeligt dokumenteret hos patienter med hypofysetumorer men også i patienter med ikke-hypofyse tumorer, især SCLC [6-9]. Disse patienter kan optræde med milde til moderate symptomer på Cushings syndrom. Vi har vist, at cirkulerende niveauer af det neuroendokrine markering, POMC, korrelerer med en lavere overlevelsesrate hos patienter med SCLC tumorer [10]. Men om denne biomarkør ville være så nyttig til at forudsige tumor tilbagefald efter behandlingen ikke er kendt.

Ikke-SCLC (NSCLC) celler behandlet med strålebehandling eller kemoterapi har kapacitet til at gennemgå epitelial til mesenkymale overgang (EMT) i reaktion på behandlingen [11-17], og det er ved at blive et mere almindeligt anerkendt karakteristisk for metastaser i mange cancertyper [18,19]. Mindre om, hvorvidt der er et tilsvarende progression i SCLC eller om EMT er forbundet med terapi-resistens i denne kræft. Men undersøgelser har vist, at der er subpopulationer af vedhængende SCLC celler

in vitro Hoteller, som er mere mesenkymale og udviser øget kemoresistens [20]. Desuden er der tegn på EMT i SCLC tumorer, som er blevet forbundet med øget invasionsevne og kemoresistens [21].

Arten af ​​fænotypiske overgange og den rolle, det neuroendokrine fænotype i SCLC tumorer er dårligt forstået. Desuden er effekten af ​​strålebehandling på tumor fænotype ikke beskrevet i SCLC. Vores mål var at bestemme, om POMC kunne fungere som en biomarkør for tumorbyrde efter bestråling behandling, eller hvis den er ændret som følge af bestråling modstand under anvendelse af samme musemodel som tidligere fastslået [10]. Vi fandt, at POMC blev signifikant reduceret i resistente celler

in vitro

in vivo

og var ikke en god indikator for tumor genvækst efter bestråling. Der var også en tydelig mesenkymale switch

in vitro

in vivo

efter bestråling, som kunne være tegn på mere aggressive eller bevægelige tumorceller.

Metoder

Cell kultur

DMS 79 er en SCLC cellelinje oprindeligt fra en pleural effusion taget fra en 65-årig mand kaukasiske og etablerede

in vitro

af Dr. Pettengill, (Dartmouth Medical School, Hannover, NH, USA). Cellen linje blev doneret af hende i 1990 [22]. Cellerne blev bekræftet af DNA Sequencing Facility (University of Manchester) på tidspunktet for undersøgelsen og har både

p53

og

RB1 ​​

mutationer. DMS 79 celler vokser som løst ophængt aggregater og blev dyrket i RTISS medier (RPMI 1640 + L-glutamin suppleret med 2,5% FBS, 5 ug /ml insulin, 10 pg /ml transferrin, 30 nM natriumselenit og 1% HEPES buffer) [23].

DMS 79 celler blev bestrålet under anvendelse af en fraktioneret røntgenbestråling maskine (Faxitron X-ray Corporation, Schweiz) ved 2Gy og efterladt til at komme sig 14-21 dage. Denne procedure blev gentaget for 10 cykler med vurderinger levedygtighed foretaget før og 72 timer efter hver behandling. Samlet tid i kultur var 32 uger og det samlede antal passager af celler var mellem 30 og 40. Cell levedygtighed og fordobling gange blev vurderet af CellTiterGlo Selvlysende Cell Levedygtighed Assay (Promega, WI, USA). Celler blev udsat for 5Gy IR udfordringer at bestemme, om cellerne havde opnået resistens mod de højere doser af bestråling. Bestråling cyklusser blev gennemført på 3 individuelle kulturer for hvert forsøg.

xenografundersøgelser

Etik erklæring.

Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med det britiske indenrigsministerium Animal ( Videnskabelige Procedurer) Act, 1986, og godkendt af det lokale University of Manchester etisk komité.

DMS 79 celler blev injiceret subkutant i CBA nøgne hunmus ved 5×10

6 celler /mus i 0,1 ml af serum frit RPMI-1640-medium med tilsætning af 50% matrigel. Mus blev indkøbt fra University of Manchester Biologisk Services Facility og huse i de interne ventilation bure i grupper på fem, ved 22 ° C, under sterile forhold med autoklaveret savsmuld sengetøj og miljøberigelse. Den gennemsnitlige vægt var 24,5 g +/- 0,37 g og mus var 12 uger gamle ved starten af ​​undersøgelsen. Dyrene blev udsat for 12:12 lys mørke cyklus og

ad libitum

adgang til sterilt standard chow kost (SDS) og sterilt vand. Mus blev tildelt behandlingsgrupper af 5 dyr /gruppe baseret på tid, det tager for tumoren at nå 250 mm

3. Tumorer blev lokalt bestrålet eller ubehandlet på 250mm

3 ved 2Gy /dag i 3, 5 eller 10 på hinanden følgende dage, hvilket giver samlede doser på 6, 10 og 20Gy. Alle dyr blev nøje overvåget for generelle sundhed og vægt dagligt. Alle dyr forblev i god sundhed i hele eksperimentet medmindre andet er angivet. Under

in vivo

studere en mus blev aflivet mid-eksperiment på grund af en opsvulmet mave og signifikant vægttab (fra gruppe 4 [10 på hinanden følgende IR dage]) og blev derfor udelukket fra analysen.

Mus blev aflivet kl 10:00 af stigende CO

2 og cervikal dislokation, når tumorer nåede 1000mm

3. Tumorer og andre organer af interesse blev derefter halvdelen snap frosne og halvt formalin fikseret og paraffin indlejret. Blodprøver af maksimal 80 pi blev taget af halen nick på dag 0, 13 og hver 7

th dag derefter. Museplasma blev analyseret for POMC ved ELISA (se nedenfor).

POMC ELISA

Cirkulerende POMC niveauer blev målt i museplasma anvendelse af et specifikt to-ELISA. Dette assay fulgte den samme protokol som tidligere [10] beskrevne. Den nedre grænse for analysesensitivitet løbet af undersøgelsen var 15 pmol/L.

Immunhistokemi /Immuncytokemi

5 um sektioner af formalinfikseret voks indlejret DMS 79 tumorer blev farvet for POMC (N1C11, antistof produceret i vores lab) (se [10] for yderligere oplysninger om antistof), neuron-specifik enolase (NSE) (monoklonalt muse, klon BBS /NC /VI-H14, Dako kat nummer M0873, fortynding 1: 100) cytokeratin (mus monoklonalt, klon AE1 /AE3, Dako, kat nummer M3515, fortynding 1: 100) og N-cadherin (CDH2 muse monoklonale, klon 6G11, Dako, kat nummer M3613, fortynding 1:50) under anvendelse diaminobenzen (DAB) chromagen Envision systemet (Dako). Sekundært antistof blev anvendt, var et polyklonalt gede-anti-muse-IgG konjugeret til HRP (Dako, Cat nummer P0447, fortynding 1: 200). Antigen genfinding blev udført på alle sektioner ved hjælp citratbuffer (pH 6) ved 95˚C i 30 minutter

Billedanalyse

Tumor sektioner blev scannet ved 20x forstørrelse ved hjælp af en Aperio CT-scanner (Aperio Systems, Vista, CA) og cytoplasmatisk DAB farvning blev kvantificeret ved hjælp af Aperio Positive Pixel Count program v9.1 (Aperio Systems , Vista, CA). Kun levedygtigt væv fra hver sektion blev analyseret, og områder med foldede /beskadiget væv og nekrose /pre-nekrose blev udelukket for at reducere bias. Negative kontroller blev udført for alle behandlingsgrupper for at bestemme baggrundsfarvning niveauer, som derefter kunne udelukkes ved hjælp af Aperio software. De levedygtige celler områder fra hele tumorsnit blev analyseret, tumorer fra alle mus blev inkluderet i analysen og 3 sektioner fra hver tumor blev analyseret.

Data genereret blev udtrykt som en procentdel af antallet af positive pixels i forhold til samlede antal pixels analyserede (positivt tal fraktion), der kan sidestilles med det positive område fraktionen [24].

Kvantitativ PCR

DMS 79 celler udsat for alt 21Gy IR

in vitro

(8x2Gy cykler og 1x5Gy cyklus), der viser tydelige morfologiske ændringer fra ubehandlede celler dyrket i samme periode blev høstet. RNA blev ekstraheret under anvendelse af et QIAGEN RNeasy Mini Kit (hjælp Qiashredder rør). cDNA-syntese blev udført under anvendelse af QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Primere blev opnået fra Eurofins MWG, (London, UK) og blev designet tværs exon grænser. Gener af interesse omfatter;

POMC

,

ENO2

(neuron specifik enolase [NSE]),

NCAM1

(neural celle-adhæsionsmolekyle [N-CAM]),

CHGA

(Chromogranin A [CgA]),

KRT18

(cytokeratin 18 [CK18]),

KRT19

(cytokeratin 19 [CK19])

CDH1

(epitelial cadherin [E -Cad]),

EPCAM

(Epithelial celleadhæsionsmolekyle),

CDH2

(neural cadherin [N-Cad]),

ITGB1

(Integrin β1),

CTNNB1 Hotel (β-Catenin),

ZEB1

,

FSP1

(fibroblast-specifikt protein 1) og

ACTA1

(α-glatmuskelactin). Kvantitativ PCR blev udført ved hjælp FastStart Universal SYBR Green (Roche) og køre /analyseret med StepOnePlus Real Time PCR maskine og software (Applied Biosystems)

Statistisk Dataanalyse

Alle statistisk dataanalyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism softwareversion 5. Data præsenteret er middelværdi og standardafvigelse af gennemsnittet af mindst tre individuelle eksperimenter. Korrelationskoefficienter blev vurderet ved anvendelse Spearmans korrelation test. Kvantitativ realtids-PCR-data blev analyseret under anvendelse StepOne software og Microsoft Excel. Genekspression statistisk signifikans evaluering blev målt ved anvendelse uparrede t-tests. One-way ANOVA statistiske test blev brugt til at sammenligne flere grupper af data, herunder Bonferroni s multiple sammenligninger.

Resultater

POMC er en mindre effektiv biomarkør for tumorvækst efter bestråling

Cirkulerende POMC præcist efterlignede tumor progression i ubehandlede xenotransplanterede mus (fig 1A), og der var en stærk korrelation (r = 0,82, figur 1B). Når tumorer blev lokalt bestrålet i 3 og 5 dage var der også en stærk positiv sammenhæng mellem tumorstørrelse og cirkulerende POMC (Fig 1C-1F). Men terminale POMC koncentrationer var lavere end i ubehandlede dyr, selv om alle dyr var blevet opretholdt, indtil tumorerne nåede samme størrelse. Endnu mere slående, når subkutane DMS 79 tumorer blev bestrålet i 10 på hinanden følgende dage ved 2Gy /dag, POMC ikke afspejle tumorgenvækst (r = 0,35, Fig 1G og 1H). Cirkulerende POMC fra terminal plasmaprøver, når tumorer var alle på 1000mm

3, var 4 gange lavere i 20Gy bestråling gruppen i forhold til dem i den ubehandlede gruppe (p = 0,0165 Fig 1I). POMC tumor protein var også lavere i 20Gy bestrålet gruppe (p = 0,0092 Fig 1J). Data fra alle individuelle mus er vist i S1 Fig.

DMS 79 celler blev etableret som subkutane xenotransplantater og når de var 200-250mm

3 enten lov til at vokse ubehandlede (A) eller udsættes for 2Gy IR /dag i 3 på hinanden følgende dage (C), 5 dage i træk (E) eller 10 på hinanden følgende dage (G). Cirkulerende POMC blev overvåget af blodprøveudtagning på dag 0, 13, 20 og hver 7 dage derefter. Skraverede søjler angiver den periode, hvor tumorer blev lokalt udsat for IR. Cirkulerende POMC og tumorstørrelse blev analyseret ved korrelationsanalyse, der blev udført på alle tidspunkter fra hver gruppe (B, D, F, H). Resultater præsenteres (A, C, E, G) er individuelle mus, men repræsenterer 3-5 mus /gruppe. Alle individuelle data dyr er vist i S1 Fig Cirkulerende POMC blev analyseret i terminale prøver (I). Helt protein fra tumorprøver blev analyseret ved ELISA for POMC (J). Følgende antal dyr nåede 1000mm

3 tumor volumen inden 120 dage fra tumor implantat; Ubehandlet gruppe 5/5, 3x2Gy 4/5, 5x2Gy 5/5, 10x2Gy 3/4 * p = 0,05 ** p = 0,01. Kontroller i figur 1A er oprindeligt blevet beskrevet i Stovold et al. British Journal of Cancer [10].

POMC reduceres og tydeligt heterogene efter gentagen bestråling

in vivo

Ubehandlet tumorer farvet ensartet positiv for POMC (Fig 2A 2C). Men tumorer udsættes for 2Gy /dag i ti dage viste mindre og tydeligt heterogen POMC-farvning inden levedygtige regioner celle (Fig 2D-2G). Snit fra alle tumorer er vist i S2 Fig Positive pixel analyse inden for alle tumorer bekræftede, at der var 23% stærkere positive POMC celler i de ubehandlede tumorer end i 20Gy bestrålede tumorer (fig 2H). POMC-genekspression blev ligeledes reduceret i 20Gy IR tumorer (Fig 2i). Ved behandlingen af ​​en alternativ neuroendokrine markør, neuron specifik enolase (NSE), var der ingen forskel i farvning mellem de ubehandlede og bestrålede tumorer (S3 Fig).

DMS 79 celler blev etableret som subkutane tumorer i nøgne mus og enten venstre ubehandlet (AC) eller udsættes for IR i 10 på hinanden følgende dage på 2Gy /dag (GD). En central del af tumor blev farvet for POMC hjælp af vores egen N1C11 antistof. (A 0,001, høj farvning 18 gange stigning p = 0,0268) sammenlignet med ubehandlede tumor sektioner (fig 3C). Cytokeratin-farvning, i modsætning hertil udviste ensartet positiv farvning i ubehandlet og bestrålet xenograft sektioner (fig 3D og 3E) bekræftet af positiv pixel analyse (fig 3F).

mesenchymale markør N-cadherin (N-Cad) (A B) og epithelial markør cytokeratin (CK) (D 0,001 * p =. 0,05

Ingen ændringer i POMC i DMS79 celler efter en enkelt dosis bestråling

Resultater fra

i vivo Salg undersøgelser antydet, at tumorer post-stråling har erhvervet fænotypiske egenskaber, der adskiller sig fra ubehandlede tumorer, og at disse ændringer blev koblet med et fald i POMC biomarkør sekretion og ekspression og en stigning i N-cadherin. For at undersøge dette yderligere, DMS79 celler

in vitro

blev udsat for stråling og ændringer i fænotype blev overvåget. Oprindeligt DMS 79 celler fik en dosis af 2Gy eller 5Gy bestråling for at afgøre, om en enkelt dosis var nok til at fremme eventuelle fænotypiske ændringer (figur 4).

DMS 79 celler blev talt på dag 0 og derefter bestrålet ved 2Gy og 5Gy. Levedygtige tællinger blev gennemført op til 7 dage efter bestråling før cellerne blev farvet for POMC, cytokeratin (CK) og N-cadherin. Alle bestråling cyklusser blev udført på 3 uafhængige kulturer. * P = 0,05 ** p = 0,01 *** p = 0,001

Cell levedygtighed blev signifikant reduceret i celler, der blev bestrålet på både 2Gy og 5Gy. Men de overlevende levedygtige celler udviste ingen tydelige forskelle i morfologi eller i ekspression af POMC, cytokeratin og N-cadherin, 7 dage efter bestråling, hvilket tyder på, at gentagen bestråling kobles med den fænotypiske forandringer

in vivo

.

Ændring stråling fænotype

in vitro

DMS 79 celler dyrket

in vitro

blev derefter udsat for gentagen bestråling over 8 måneder, indtil de blev mere tolerante over for behandlingen (fig 5A skematisk). Med flere cykler af bestråling antallet af celler der overlever en 2Gy IR udfordring steg (Fig 5B). Efter 9 cyklusser af bestråling var der et fald i fordoblingstiden for celler udsat for bestråling (fig 5D) og et fald i POMC sekretion (figur 5E).

DMS 79 celler blev bestrålet ved 2Gy i 10 progressive cyklusser (skematisk [A]). Procentdelen af ​​celler, der overlever i de bestrålede kulturer blev sammenlignet med “kontrol” dvs. celler ikke er behandlet på det pågældende cyklus (B) (Spearman korrelation p = 0,0001). Forsøget blev udført med disse kontroller for at muliggøre en øget spredning, som bestrålede celler vises over tid i forhold til helt ubehandlede celler. DMS 79 celler blev også udfordret med højere doser IR (5Gy) på forskellige punkter for at evaluere radiosensitivitet (C). Celler resterende blev udtrykt som en procentdel af kontroller (B C). Celle fordoblingstider for ubehandlet vs 21Gy IR-celler (9 samlede antal cyklusser, 8 af 2Gy og 1 af 5Gy) blev beregnet over 5 dage (D). POMC sekretion blev vurderet over 8 dage ved POMC ELISA og resultaterne blev normaliseret til celleantal (E). Cell morfologi ubehandlede DMS 79 celler (F). Cell morfologi af celler bestrålet til 21Gy, viser vedhængende kolonier og individuelle vedhængende aflange celler (G) og meget stramt suspenderede klynger (H) i forhold til de løs suspenderede klumper vist i (F).

Efter hver cyklus af 2Gy bestråling, blev nogle af cellerne tages for udfordringen med 5Gy at afgøre, om der var nogen ændring i tolerance over for større doser af stråling (figur 5C). Procentdelen af ​​overlevende celler efter behandling (2Gy og 5Gy) steg som antallet af IR cyklusser forøget (fig 5B og 5C). Celler, der var blevet bestrålet i alt 21Gy (IR-primede celler) viste resistens mod yderligere behandling.

Interessant de viste IR-primede celler dramatisk ændret morfologi. Ubehandlede DMS 79 celler danner uregelmæssige suspenderede aggregater af afrundede celler (Fig 5F), hvorimod IR-primede kulturer præsenteret som en kombination af adhærente klynger, enkelt adhærerende aflange celler (Fig 5g og 5h) og meget stram suspenderede kugler (fig 5h). Denne ændring i morfologi antyder, at cellerne kan have været underkastet en fænotypisk switch, tænkes til en mere mesenchymal tilstand.

IR-primede celler er faldet POMC udtryk

DMS 79 IR-primede celler, der havde været underkastet fraktioneret strålebehandling til en total dosis på 21Gy viste et signifikant fald i POMC-mRNA (p = 0,033). Der var imidlertid ingen ændring i de andre neuroendokrine markører, neural-celleadhæsionsmolekyle (N-CAM), chromogranin A (CgA) og neuron-specifik enolase (NSE) (figur 6).

mRNA-ekspression var analyseret i DMS 79-IR-celler (grå søjler) og ubehandlede celler, som blev dyrket i parallelle forhold til de behandlede celler (sorte søjler). mRNA niveauer blev normaliseret til GAPDH-ekspression. * P 0,05 *** p =. 0,001

Strålebehandling er kombineret med et skifte til en mere mesenkymale fænotype

Parallelt med

in vivo

data viste IR-primede SCLC celler ingen konsistent samlede ændring i de epiteliale markører, cytokeratin 18, cytokeratin 19, E-cadherin og epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) (figur 6). Men mere interessant, fem af de seks mesenchymal markører analyseret, blev opreguleret; N-cadherin p = 0,001, Integrin β1 p = 0,044, fibroblast-specifikt protein 1 p = 0,03, Zeb1 p = 0,001, β-catenin p = 0,001. Disse data er i overensstemmelse med de morfologiske observationer

in vitro

og kvantificering af

in vivo

farvning.

Diskussion

Vurdering SCLC tumorceller

in vivo

in vitro

har identificeret en ændring i fænotype efter udsættelse for gentagen bestråling. POMC udtryk faldt i tumorer

in vivo

efter gentagen bestråling og faldt POMC blev også fundet i bestrålede tumorceller

in vitro

. Ud over dette ændrede neuroendokrine fænotype, blev der observeret en stigning i mesenkymale egenskaber efter gentagen bestråling.

Talrige undersøgelser har identificeret kandidat biomarkører for forskellige cancertyper, der betyder deres betydning i diagnose, prognose og tidlig påvisning af tilbagefald hos patienter. Men der er betydelig kompleksitet i nytten af ​​biomarkører. I den aktuelle undersøgelse, bestråling af DMS 79 celler

in vivo

resulterede i nedsat POMC i blodet, og faldt POMC protein og mRNA ekspressionsniveauer i tumorer, selvom tumorerne havde regrown. Dette indikerer, at biomarkør ekspression er ændret som følge af behandlingen og er ikke længere i stand til præcist at forudsige tumor genvækst. Vi har tidligere beskrevet POMC som en ny biomarkør hos patienter med SCLC og viste det korreleret med levermetastaser [10]. Det kunne være, at i de patienter, der bestråling reducere POMC ekspression /produktion i den primære tumor, (som set i xenotransplantater), men metastaser i patienter (især dem i leveren) fortsat kan secernere høje niveauer af POMC ind i cirkulation.

POMC kunne være en meget specifik og følsom biomarkør for en undergruppe af SCLC patienter, som ikke er blevet behandlet. Imidlertid er det vigtigt at overveje, at POMC måling kan vise vildledende for de fleste patienter, der har haft bestråling og fik tilbagefald fordi de cirkulerende koncentrationer af POMC produceres af den primære tumor forbliver undertrykt. Derfor POMC viser en markant forskellig forhold med tumorvolumen i ubehandlet versus bestrålede tumorer. Selv om det er korrekt, at en stigning i POMC ville indikere tilbagefald efter strålebehandling, vil den tumorbelastning med hvilke dette er forbundet være meget større end observeret uden strålebehandling. I fig 1 en ubehandlet tumor på 200 mm3 frembringer 300pmol /l POMC men en tumor behandlet med 20Gy ville være 1000cm3 før det producerede den samme mængde POMC. Hvis dette oversat til patienter, vil det påvirke hvor godt POMC kunne anvendes, fordi på det tidspunkt en recidiverende tumor givet strålebehandling er stor nok til at blive detekteret af POMC, kunne det være over den størrelse, for hvilken en alternativ indgriben kan være nyttigt. Lignende scenarier sandsynligvis findes for andre biomarkører, hvor undersøgelser ikke har overvejet typen og omfanget af behandlingen.

På trods af at der var et betydeligt fald i POMC

in vitro

in vivo

efter bestråling, var der ingen ændring i N-CAM, NSE eller chromogranin En genekspression

in vitro

. Dette indikerer, at aspekter af neuroendokrine fænotype fortsætter efter bestråling. Dette tyder på, at den gentagne bestråling kan resulterer i ændringer i POMC genet eller POMC vej der føre til nedsat POMC sekretion, men ikke ændre neuroendokrine fænotype generelt. Disse resultater viser, at når man analyserer en roman biomarkør, er det ekstremt vigtigt at være opmærksom på plasticitet biomarkør udtryk efterbehandling.

Sideløbende med ændringerne i POMC udtryk var der en opregulering af de mesenkymale markører N- cadherin, β1-integrin, Zeb1, fibroblast-specifikt protein 1 og β-Catenin på mRNA-niveauet. Dette giver indsigt i de involverede i responset af tumorcellerne til behandling mekanismer. Epitelial til mesenkymale overgang vides at være associeret med resistens over for behandling. I denne undersøgelse den erhvervede resistens er ledsaget af et fald i POMC og en opregulering af mesenchymale markører. Modstand mod bestråling af SCLC celler har tidligere været identificeret med N-acetylglucoaminyltransferase V (GnT-V) over-ekspression og opregulering af GnT-V

in vivo

forårsager en stigning i N-cadherin, vimentin og ZEB2, igen hvilket tyder på en forbindelse mellem radiosensitivitet og EMT-lignende forandringer [25]. N-cadherin niveauer er kendt for at stige efter bestråling i NSCLC-celler [16,17], og i follikulære thyreoidea xenotransplantattumorer [26]. EMT aktiveres også i brystkræftceller modtager lavdosisstråling [27]. Desuden har vi observeret, at SCLC celler, når de udsættes for gentagne runder af bestråling

in vitro

blev mere løsrevet fra andre celler og vises en aflang morfologi, som er i overensstemmelse med en mesenkymale fænotype.

selvom bestråling markant reduktion af tumorbelastning i patienter, kunne det være drivende celler mod en mere aggressiv, mesenchymale fænotype. Mekanismen for dette er ikke kendt, selvom reaktive oxygenarter (ROS) dannes som følge af strålebehandling eller fortsat rygning kan ændre celleadhæsion og stimulere celleinvasion [28]. ROS kan også inducere EMT gennem opregulering af E-cadherin repressoren, snail [29]. Denne mekanisme er imidlertid mindre sandsynligt, da E-cadherin niveauer var uændret i de bestrålede celler i vores

in vitro

model. Den uændrede E-cadherin-genekspression tyder på, at snarere end en klassisk EMT mekanisme, der ofte observeres i NSCLC [11,12,14,15] afholder SCLC celler kun opregulering mesenchymal egenskaber. Det er den mesenkymale fænotype, der anses ansvarlig for invasionen og sekundære kolonisering af tumorceller [30]. I denne særlige model imidlertid bestråling behandling ikke producerede metastaser i lunger, hjerne eller lever fra disse mus (data ikke vist). Manglen på metastaser i

in vivo

model kunne tilskrives værten miljø, vanskeligheder i indbyrdes arter signalering (humane SCLC celler i mus), manglende immunstoffer, eller utilstrækkelig tid for celler at kolonisere sekundær organer.