PLoS ONE: En Sp1 moduleret Regulatory Region Unikt for højere primater Regulerer human Androgen receptor Promotor Aktivitet i Prostata Cancer Cells

abstrakt

Androgen receptor (AR) medieret signalering er nødvendig for normal udvikling af prostata og også driver prostatacancer (PSA) cellevækst og overlevelse, med mange undersøgelser, der viser en korrelation mellem den forøgede receptor-niveauer og terapi modstand med progression til fatal kastreringsområdet tilbagevendende PCa (CRPC). Selv om det har været holdt i nogen tid, at transskription faktor Sp1 er den vigtigste stimulator af AR gentranskription, omfattende viden om reguleringen af ​​AR genet stadig ufuldstændig. Her beskriver vi og karakterisere i detaljer to hidtil ukendte aktive regulatoriske elementer i 5’UTR af det humane AR-genet. Begge disse elementer indeholder overlappende bindingssteder for den positive transkriptionsfaktor Sp1 og repressorproteinet pur-α. Aberrerende celle signalering er karakteristisk for PCa og den transkriptionelle aktivitet af AR-promotoren i PCA-celler er afhængig af de relative mængder af de to transkriptionsfaktorer. Sammen med vores bekræftelse af den dominerende rolle Sp1, resultaterne understøtter rationalet for at målrette denne transskription faktor til at hæmme tumor progression. Dette bør være af særlig terapeutisk relevans i CRPC hvor niveauerne af repressor PUR-α reduceres

Henvisning:. Hay CW, Hunter I, MacKenzie A, McEwan IJ (2015) En Sp1 moduleret Regulatory Region Unikt for Højere Primater Regulerer human Androgen receptor Promotor Aktivitet i prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (10): e0139990. doi: 10,1371 /journal.pone.0139990

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Juni 16, 2015; Accepteret: September 20, 2015; Udgivet: 8 oktober 2015

Copyright: © 2015 Hay et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Chief Scientist kontor (CSO) af den skotske regering (https://www.cso.scot.nhs.uk/) : CWH (CZB-4-477) og IH (ETM /382)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostata cancer (PCA) er den anden mest udbredte kræft hos mænd og udgør den næststørste årsag til mandlige kræftdødsfald i vestlige nationer og den sjette henholdsvis verdensplan [1]. Desuden er forekomsten af ​​PCa stigende i stort set alle lande med en sats på nye tilfælde forventes at være fordoblet i 2030 til 1.700.000 resulterede i 500.000 ekstra dødsfald [2].

vækst og differentiering af normal prostata epitelial celler, samt udvikling og progression af PCa, drives af androgen signalering som medieres af androgen receptor (AR) [3]. Derfor hæmning af AR funktion ved androgen deprivation terapi (ADT) ved hjælp af antagonister eller bekæmpelse af testikelkræft eller intratumoral androgen syntese udgør den vigtigste procedure til håndtering af avanceret og metastatisk PCa [4-6]. I første omgang, de fleste patienter oplever en betydelig forbedring og remission, men kræften uvægerligt udvikler sig til at blive uafhængig af cirkulerende androgener og omtales som kastrationsniveau resistente PCa (CRPC) [7]. Denne sene, metastatisk stadie er sædvanligvis fatal og repræsenterer den største udfordring for udviklingen af ​​nye, effektive behandlinger [8]; nødvendiggør flere AR-målrettede regimer (anmeldt i [9]). Afgørende, CRPC tumorer forblive afhængig af AR signalering; eksemplificeret i begge androgen følsomme (AS) og CRPC celler, hvor nedsat AR ekspression inducerer et ledsagende tab af cellelevedygtighed [10].

androgenreceptoren fungerer som en androgen-aktiveret transkriptionsfaktor som binder til androgen responselementer ( Ares) [4] i initiativtagere og distale forstærkere (86% til 95% for Ares [11]). Transaktiveringen evne af receptoren moduleres ved interaktioner med en stadigt voksende liste af coregulators og transkriptionsfaktorer (gennemgået i [12]), der virker på selve receptoren eller ændre chromatinmiljø. For eksempel pioneer transkriptionsfaktorer FOXA1 og GATA2 fremme en åben chromatinstruktur der letter AR binding, og genom undersøgelser viser co-lokalisering af bindingssteder for disse tre faktorer [13,14]. GATA2 spiller en særlig vigtig rolle, fordi samt øge AR binding til forstærkere, det deltager i kromatin looping og direkte opregulerer AR genekspression [13,14]. Forhøjede niveauer af GATA2 i PCa korrelerer med højt Gleeson scoringer, og nedsat aktivitet gennem fugtet udtryk [13,14] eller hæmning af GATA2 belægningsprocent på Eiffel tårnet med isoflavon curcumin [15] resultere i lavere PCa celleproliferation.

størstedelen af ​​CRPC tumorer overudtrykker receptoren [16-19] med klonselektion forværrer problemet [20]. De forhøjede niveauer af AR tillader binding til kromatin i 100 gange lavere koncentration af ligand end normalt [21] og den afvigende AR-drevet transkriptionel program i CRPC tumorer tillader celler at vokse i lave koncentrationer af androgen [22] eller den tilsyneladende mangel på hormon [23-25], og dermed ophævelse ADT [26] og behandling med abiraterone [20].

Hos mennesker, AR genet spænder ca. 180 kbp af X-kromosomet (Xq11.2-Q12) og giver anledning til en transkript på 4,3 kb, der omfatter en ualmindelig lang 5′-utranslaterede region (5’UTR) på 1,1 kb. Promotoren mangler TATA og CCAAT bokse og, i lighed med mange TATA-less gener, drives transkriptionen primært ved binding af ubikvitært zinkfinger transskriptionsfaktor, specificitet Protein 1 (SP1) til GC box regulatoriske elementer. Kernepromotoren ligger mellem -74 og +87 bp [27] og aktive GC bokse er blevet bekræftet ved -46 til -41 bp samt i 5’UTR på 429 og 442 bp [27-29]. Sp1-drevet ekspression af AR-genet lettes af et ca. 90 bp strækning af homopurin /homopyrimidin umiddelbart opstrøms for promotoren (-150 til -60 bp), der tilvejebringer en rigelig forsyning af transkriptionsfaktoren til at binde til kernepromotoren [30 ]. Når bundet til promotoren, at Sp1 associerede direkte med TATA-bindende protein og TBP-associeret faktor 4 (TAF4) [31] fastslå initieringskomplekset. Desuden kan Sp1 danne multimerer og flere stablede tetramerer leverer mange docking sites for en række andre proteiner til at regulere transkription både direkte og gennem histonacetylering og kromatin remodeling (gennemgået i [32]). Ud over de upregulatory GC kasser, 5’UTR region koder for adskillige inhibitoriske regulatoriske elementer, herunder en sammensat NF-KB, B-myb bindingssted [33], en negativ ER [34] og et androgen receptor Suppressor (ARS) [35 ], der binder pur-α og hnRNP-K på modsatte strenge af DNA [36].

AR repræsenterer klart akilleshæl prostatakræft endnu den løbende primære behandling med androgen antagonister har begrænsninger og også leads til udtryk for et alternativt AR-drevet transkriptom med variable resultater PCA [37]. En langt mere effektiv tilgang ville være at reducere AR aktivitet gennem reduceret ekspression eller interferens med essentielle transskription cofaktorer f.eks et lille molekyle inhibitor for GATA2 har vist sig at være effektiv [13]. Begge metoder afhænger detaljeret viden om samspillet mellem de mange transkriptionsfaktorer og regulatoriske elementer, der indgår i AR udtryk. Derfor, som transkriptionsfaktoren Sp1 generelt anses for at være en vigtig stimulator af AR genekspression, har vi studeret Sp1 funktion på den umiddelbare promotor og 5’UTR af det humane AR-genet. I denne rapport beskriver vi to nye aktive regulatoriske elementer i den menneskelige AR 5’UTR at begge indeholder overlappende bindingssteder for positive og negative transkriptionsfaktorer. Den transkriptionelle resultat i PCA-celler er afhængig af de relative mængder af stimulerende Sp1 og inhiberende pur-α. Resultaterne underbygger også den dominerende rolle Sp1 i kørsel AR udtryk og dermed styrke grundlaget for at målrette denne transskription faktor, da denne handling vil fremme binding af konkurrerende pur-α og hæmme tumor progression. Endelig de regulatoriske elementer udviser meget dårlig evolutionær bevaring illustrerer den særprægede natur menneskelig AR genregulering.

Materialer og metoder

Cell kultur

menneskelige prostata karcinom cellelinjer LNCaP og DU145 blev opnået fra The European Collection of Cell Cultures og American Type Culture Collection hhv. DU145 blev dyrket i DMEM mens LNCaP blev opretholdt i RPMI indeholdende 1 mM Na-pyruvat og 10 mM HEPES. Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (PAA) og holdt ved 37 ° C uden antibiotika i en fugtig atmosfære indeholdende 95% luft og 5% CO

2.

Western blotting

Celleekstrakter blev fremstillet ud fra LNCaP og DU145 celler, og western blots udført som beskrevet tidligere [38]. Human Sp1, PUR-α, hnRNP-K, og GAPDH blev påvist under anvendelse af antistoffer ab13370, ab79936, ab52600 og ab36840 (alle fra Abcam) ved fortyndinger på 1: 6000, 1: 60.000, 1: 17.000 og 1: 12.500 henholdsvis. Anti-AR fra Santa Cruz Biotechnology (sc-7305) blev anvendt ved 1: 100 fortynding. Antigen-antistof-komplekser blev påvist under anvendelse peberrodsperoxidasekonjugeret anti-kanin IgG sekundært antistof (Sigma) som tidligere beskrevet. Integrationsanalyse af western blots blev udført ved anvendelse Billede J software.

RT-PCR

LNCaP-celler blev behandlet med DMSO eller 50 nM mithramycin A (Sigma) i 24 timer. Ekstraktion af RNA og RT-PCR for AR og GAPDH mRNA blev udført som tidligere beskrevet [34].

plasmider og mutagenese

Mutationer af potentielle regulatoriske elementer blev indført i plasmid phAR1. 6Luc, hvori luciferase ekspression drives af 1,6 kbp af promotoren og 5’UTR af det humane androgenreceptor genet (mellem -741 og 842 bp) [34], under anvendelse af to metoder. Base udskiftninger blev skabt ved hjælp af QuikChange II Mutagenese kit (Agilent Technologies) ved brug af oligonukleotider, der er anført i tabel A i S1-fil, sammen med deres omvendte komplementer. Deletionsmutationer blev fremstillet under anvendelse af In-Fusion Advantage PCR-kloning system fra Clontech anvendelse af oligonukleotiderne nævnt i tabel B i S1 Fil. Begge protokoller blev udført i overensstemmelse med producentens protokol og integriteten af ​​alle konstrukter blev bekræftet ved DNA-sekventering.

Transfektion og luciferasereportergenet assays

Fireogtyve-brønds plader blev podet med LNCaP eller DU145 celler ved en densitet på 5 x 10

4 celler /cm

2 og 1,2 x 10

4 celler /cm

2. Cellerne blev dyrket i komplet medium i 24 timer, derefter transficeret med 440 ng /brønd af ildflue-luciferase-reporterplasmid under anvendelse JetPEI polyethylenimin (POLYPLUS Transfektion) ifølge fabrikantens protokol. Efter 24 timer blev mediet udskiftet, og cellerne blev dyrket i yderligere 24 eller 48 timer.

Plasmid transfektion blev udført i mindst tre eksemplarer og luciferaseaktivitet blev målt i to eller tre gange ved anvendelse af en GloMax 96 Microplate luminometer (Promega) og normaliseret for proteinkoncentration som tidligere beskrevet [38].

Fremstilling af kerneekstrakter

nukleare ekstrakter blev fremstillet ud fra DU145 celler i nærvær af proteaseinhibitorer (komplet proteaseinhibitorcocktail fra Roche plus 1,0 mM PMSF) og proteinphosphatase inhibitorer (5 mM β-glycerophosphat og 100 uM aktiveret Na

3VO

4) ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Dignam

et al

[39].

elektroforetisk mobilitet shift assays (EMSAs)

Enten 10 ug LNCaP-kerneekstrakt eller 120 nM oprenset rekombinant humant Sp1 protein (Active Motif) blev inkuberet med 20 fmol biotin 3′-ende-mærket dobbeltstrenget DNA oligonukleotider under anvendelse af tidligere beskrevne betingelser [34]. De fremadrettede sekvenser af oligonukleotiderne var: Sp1-1, 5′-CGGCCCGGTGGGGGCGGGACCCGACTCGCA-3 ‘; ARS, 5’-TCTCCACCCCGCCTCCCCCCACCCTGCCTT-3 ‘; og Sp1-3, 5’-TTCTCCCCACCCGCCCCCCCGCCCCCGTCG-3 ‘. En umærket oligonukleotid med en konsensus Sp1 regulatorisk element, Sp1 ulemper, 5’-ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 ‘blev tilsat 15 min før den mærkede probe. For supershift assays antistofferne ab13370 og ab52600 (ABCAM) mod human Sp1 og hnRNP-K henholdsvis tilsat 15 min før tilsætning af mærket probe

De resulterende DNA:. Proteinprodukter blev løst i afkølet 6% denaturerende polyacrylamidgeler kørt i 0,5 x TBE-buffer, pH 8,3 (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA) og påvises under anvendelse af Pierce LightShift Kemiluminescerende reagenser (Thermo Scientific) ifølge fabrikantens protokol. Tal blev kompileret med autorads af EMSA geler med rækkefølgen af ​​baner inden nogle geler blive ændret for overskuelighedens skyld og lette sammenligninger. Digital integration af DNA:. Proteinkomplekser blev udført ved hjælp af en Vilber Loumat Fusion SL kølet CCD-sensor med omhu der træffes for at sikre, at ingen pixel mætning forekom

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

En detaljeret redegørelse af chip metoden har tidligere [34] blevet præsenteret. Kort fortalt blev LNCaP-celler transficeret med den relevante phAR1.6Luc-baserede plasmid og dyrket på sædvanlig måde. Celler blev fikseret i 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C og kerner blev fremstillet. Chromatin og plasmid blev fordøjet med 200 enheder HphI (NEB) i 20 min ved 37 ° C; efterfulgt af lyse og fjernelse af uopløselige rester ved centrifugering. Supernatanten blev fortyndet i chip-buffer og klaret ved hjælp af protein-G og protein-A Dynabeads (Life Technologies). Prøver af klarede lysater blev bibeholdt som input (IP), og resten blev inkuberet med antistoffer mod enten Sp1 (07-645, Millipore) eller IgG. Immunkomplekser blev opsamlet ved magnetisering, vasket to gange hver med: lavt saltindhold; højt saltindhold; LiCI og TE buffere, efterfulgt af eluering. DNA-protein-tværbindinger blev tilbageført med NaCI ved 65 ° C og DNA oprenset. Isolerede DNA blev kvantificeret ved semikvantitativ log-fase PCR og løses ved agarosegelelektroforese i TAE-buffer. reverse (R) primere den forreste (F) og var: ARS-F, 5′-GCTGCTAAAGACTCGGAGGA-3 ‘; ARS-R, 5’-CTGAGAGTAGCCGACTGAGG-3 ‘; Sp1-3-F, 5’-CCCGAGTTTGCAGAGAGGTA-3 ‘og vect-R, 5′-TCTTCCATGGTGGCTTTACC-3’.

Statistisk analyse

Den statistiske signifikans af forskelle i datasæt DNA :. protein kompleksdannelse i EMSA eksperimenter blev bestemt ved anvendelse af tovejs ANOVA og parret t-test variansanalyse blev ansat for alle andre sammenligninger mellem supplerende data

Resultater

Den menneskelige AR gen 5 ‘ UTR indeholder to regioner med overlappende regulatoriske elementer

Undersøgelse af det humane AR gen, der koder 5’UTR region af udskrift (fig 1A) afslørede en potentiel Sp1-bindende GC kasse (328-332 bp), der viste sig at ligge inden for tidligere beskrevne Androgen receptor Suppressor (ARS) sekvens [35] (fig 1B). Det første eksempel på et ARS regulatorisk element, som kan binde den ubikvitært udtrykte protein pur-α blev beskrevet i musen AR-genet 5’UTR over 400 bp nedstrøms fra den tilsvarende humane sekvens [40]. Som både GC-bokse og ARS sites har højt GC-indhold, overlappende muligheden for andre eksempler på disse to regulatoriske elementer blev undersøgt yderligere. Selvom binding af PUR-α er sekvensspecifikke med en præference for gentagelser af (GGN), er der ingen klar konsensus genkendelsessekvens, derfor blev regionen af ​​muse ARS beskyttet mod DNase I-fordøjelse anvendt til at søge efter andre mulige steder i human 5’UTR. En region af den humane 5’UTR, distalt i forhold til ARS-sekvens, der besidder 85% identitet blev påvist (Fig 1C), som er større end identiteten 70% ses med det samme probe og de etablerede humane ARS (S1A Fig). Anvendelse af den definerede musen ARS sekvens [41] produceret en lignende konklusion med 75% identitet, som igen var større end værdien af ​​67% for de menneskelige ARS (S1B og S1c Fig) hhv. Den potentielle hidtil ukendte suppressor region overlappede Sp1-3 regulatorisk element, vides at have to aktive GC kasser [29]. Dette rejste interessante mulighed at disse to regioner kan fungere enten stimulere eller reducere AR ekspression.

(A) Skematisk fremstilling af det humane AR gen 5’UTR og umiddelbar proksimal promotor, der viser de vigtigste regulatoriske elementer og regionerne under undersøgelse. Bøjet pil angiver det transkriptionelle startsted (+1) og ATG med udfyldt pil viser starten af ​​translation. (B) Potentiel GC boks (grøn stiplet boks) inden for den bekræftede menneskelige ARS regulatorisk element (blå understreget). (C) Justering af den humane AR 5’UTR og muse AR 5’UTR suppressor element beskyttet mod DNase I-fordøjelse [40] (blå understreget) med de bekræftede humane GC bokse (grønt faststof boks). Homologe sekvenser er angivet med lodrette linjer.

Multiple opstillinger af de ækvivalente regioner af det humane AR gen 5’UTR i 11 andre art efter offentligt tilgængelige DNA-sekvenser (Fig 2) viste, at begge sekvenser er dårligt konserveret. ARS region er kun til stede i primater og sekvensen i chimpanse, som afveg fra mennesker 6,6 millioner år siden [42], har perfekt homologi med human. Endvidere og over span af 42.2 millioner år fra divergerende mennesker og silkeabe, den mest afveg primat undersøgte, de fleste sekvenser viser kun et par nucleotidsubstitutioner. Den Sp1-3 regionen viste endnu mindre homologi med kun chimpanse deler både GC kasser med mennesker. For begge områder af interesse, ikke-primater besad meget lave niveauer af homologi med human, og ingen ækvivalente sekvenser blev fundet i fugle eller piscine arter (data ikke vist). Desuden har musen ARS regionen er ekstremt dårligt konserveret og ingen pur-α bindingssekvens fundet i den ækvivalente genomiske region af andre dyr, herunder den nært beslægtede gnaver; rotten (S2 Fig).

De regioner i HAr genet 5’UTR under undersøgelse blev sammenlignet med dem af de angivne placentale arter. (A) ARS (blå boks), og (B) den Sp1-3 regulatoriske element (grøn boks). Forskelle fra den humane sekvens, er angivet med fed, understreget skrift.

GC boks er den vigtigste Sp1-bindingssted i den humane AR promotor-

Indledende forsøg undersøgte effekten af ​​Sp1 antagonist, mithramycin A, på det endogene AR-genet i LNCaP-celler. En mithramycin En dosisafhængig reduktion i AR protein niveauer blev observeret (Fig 3A) med en koncentration på 50 nM mithramycin Et bruges i efterfølgende eksperimenter. RT-PCR undersøgelser bekræftede, at faldet i AR proteinniveauer korreleret med reduceret transkription (figur 3B).

LNCaP-celler blev inkuberet med mithramycin A i 24 timer og derefter analyseret. (A) Western blot-analyse med de relative værdier af AR /GAPDH vist nedenfor. (B) RT-PCR af AR og GAPDH mRNA. LNCaP-celler blev transficeret med phAR1.6Luc (WT) eller phAR1.6Luc-ΔCG og behandlet med DMSO eller 50 nM mithramycin A i 24 timer og luciferaseaktivitet blev målt. Data repræsenterer middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige forsøg og den statistiske signifikans af de angivne sammenligninger er: * p 0,05; ** P 0,01 og *** p. 0,001

Mens det længe har været fastslået, at transskription faktor Sp1 er den vigtigste drivkraft for ekspressionen af ​​TATA box-mangler menneskelig AR genet, relative betydning af GC boks (Sp1-1, -45 til -40 bp) i kernen promotor fortsat uklart med sletning undersøgelser tyder på, at det er enten vigtigt [27] eller ikke spiller en væsentlig rolle [43]. Mutation af GC-boksen i phAR1.6Luc luciferasereporterplasmid [34], der indeholder en 1,6 kbp sektion af Har-promotoren og 5’UTR mellem positionerne -741 bp til 842 bp førte til en reduktion i luciferaseekspression 80% i transficerede androgen responsive LNCaP-celler (figur 3C). Tilsvarende blev en reduktion på 46% observeret med androgen non-responsive PCa cellelinie DU145 (data ikke vist). Sammen demonstrerede disse assays, at kernepromotoren GC boksen og Sp1-binding, spiller en fremtrædende rolle i ekspressionen af ​​AR mRNA og protein. Vigtigt er det, den muterede reporterplasmidet forblev modtagelige for hæmning ved mithramycin A (fig 3C), hvilket bekræfter, at Sp1-medieret opregulering af AR genet sker på andre steder end GC kassen.

5’UTR overlappende regulering elementer kan op- eller nedregulerer promotoraktivitet

for at belyse den funktionelle aktivitet af andre potentielle regulatoriske elementer, der undersøges, blev yderligere mutationer indført i phAR1.6Luc luciferasereporterplasmid. Transfektionsforsøg blev udført under anvendelse af både androgen responsive, LNCaP og ikke-responsiv, DU145 PCA cellelinier, der blev dyrket i komplet medium til at sikre, at alle celle signalveje der er afhængige af medier komponenter (vækstfaktorer og hormoner), var funktionelle.

for at fastlægge rollen som Sp1-binding til den potentielle GC boksen i ARS (322 til +345 i 5’UTR), basesubstitutioner blev indført for at skabe reporter phAR1.6Luc-UTRm1 der resulterede i reduktioner udtryksformer på 29% og 13% i DU145 og LNCaP celler (fig 4A og 4B) bekræfter en aktiv rolle for denne roman GC boks i opregulering AR udtryk. Omvendt har denne region af 5’UTR blevet vist at virke som en negativ regulatorisk element gennem binding af transkriptionsfaktoren pur-α der er blevet rapporteret at blive forstyrret under EMSA betingelser ved inkludering af et par to-basesubstitutioner [35], og disse blev anvendt til fremstilling af reporter phAR1.6Luc-UTRm2. Imidlertid blev anvendelse af denne reporter transkriptionel aktivitet reduceret med 36% og 20% ​​i DU145 og LNCaP henholdsvis snarere end forøget (fig 4B) som det kunne forudsiges ved frigivelse af en inhibitor. Inspektion af de sekvensændringer produceret af mutationen afslører, at guanin og cyctosine i centrum af det formodede GC boksen blev erstattet af adenin på en måde analog med Sp1-specifik mutation i phAR1.6Luc-UTRm1. Derfor, tab af Sp1 bindende i denne regulerende element er den dominerende resultat, hvilket giver yderligere beviser for, at den formodede GC boksen aktivt kan opregulere AR udtryk. I sandsynligheden for, at substitution mutation af ARS regionen var utilstrækkelige til at forhindre pur-α og hnRNP-K binding under fysiologiske betingelser, blev hele regulatoriske element slettet for at skabe phAR1.6Luc-UTRΔm1. I dette tilfælde blev promotor-aktivitet opreguleres med 1,27 og 1,67 gange i DU145 og LNCaP (fig 4B) med forskellen mellem de to cellelinjer være signifikant (p 0,01).

(A) Skematisk diagram af luciferase-reporterkonstruktion phAR1.6Luc drevet af 1,6 kbp af Har-promotoren og 5’UTR med potentiel transkriptionsfaktor binding til områder af interesse. Sp1-3 indeholder to Sp1 bindingssteder. (B og C) De angivne PCA cellelinier, dyrket i komplet medium, blev transficeret med enten phAR1.6Luc indeholdende WT sekvensen (sorte søjler) eller den muterede version (grå søjler) vist ovenfor hvert diagram. Luciferase data repræsenterer middelværdier ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg og den statistiske signifikans af de angivne sammenligninger er: * p 0,05; ** P 0,01 og *** p. 0,001

Analoge mutationer blev også indført i den tredje regulatoriske sekvens af interesse (423-446). For det første blev de to GC bokse i Sp1-3 muteret enten individuelt (phAR1.6Luc-UTRm3 og phAR1.6Luc-UTRm4) eller sammen (phAR1.6Luc-UTRm5). Luciferaseaktivitet afslørede, at afbrydelse af GC kasser medførte signifikante fald i promoter stimulation. De to enkelte mutationer faldt transkriptionsaktivitet med 42% og 29% i DU145-celler og med 29% og 17% i LNCaP-celler, og de dobbelte mutation viste reduktioner på 34% og 16% i de to cellelinier (fig 4C). Igen, fald i promotor-aktivitet var større i DU145 end LNCaP. Virkningerne af mutationerne ikke kumulative som man kunne forvente fra to overlappende bindingssteder. På en måde svarende til den, der ses med det +322 til +345 region, basesubstitutionsmutation af den potentielle overlappende negativ regulatorisk element i phAR1.6Luc-UTRm6 producerede tab af transkriptionsaktivitet på 9% og 4% i DU145 og LNCaP (fig 4C). Disse værdier var mindre dem, der ses med 322-345 region beskrevet ovenfor, men de var i overensstemmelse med sekvensen ændres som kun har ringe indflydelse på SP1 bindingssteder. Sletning af hele potentielle negative regulatoriske element i phAR1.6Luc-UTRΔm2 førte til 1,18 og 1,50 gange opregulering af transkriptionsaktivitet i DU145 og LNCaP (fig 4C). Som med phAR1.6Luc-UTRΔm1 deletionsmutation, stigningen i promotoraktivitet var signifikant større i LNCaP end DU145.

Bindingskarakteristikaene af 5’UTR overlappende regulatoriske elementer

Muligheden for, at SP1 binder til alle tre regioner under undersøgelse blev undersøgt ved elektroforetiske mobilitet shift assays (EMSAs). I indledende eksperimenter blev oprenset rekombinant humant Sp1 protein inkuberet med mærkede oligonukleotidprober indeholdende enten den primære GC boks (Sp1-1), den potentielle hidtil ukendte Sp1 bindingssted i ARS region eller Sp1-3. Elektroforetisk opløsning af de resulterende produkter med alle tre mærkede prober viste et enkelt DNA med høj molekylvægt:. Proteinkompleks nær toppen af ​​gelen (fig 5A, bane 2-4) i overensstemmelse med SP1 med en molekylvægt på 95 kDa

Oprenset Sp1 protein (panel A) eller kerneekstrakt fra DU145 celler (paneler (B) til (D)) blev inkuberet med mærkede oligonukleotidprober nedenstående hver gel, og de varer løses ved elektroforetisk mobility shift-analyse. Tilgang er vist over gelerne og var: Ab, antistof; PI, præimmun serum; Mith, mithramycin; Sp1 cons, konsensus Sp1 oligonukleotid. Konkurrerende umærkede oligonukleotider (100 fold molært overskud) eller immunsera blev tilsat før tilsætning af proben. EMSAs er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. (A) De angivne mærkede prober blev inkuberet med oprenset Sp1 protein undtagen i bane 1 som havde ingen tilsætning. Sort pil angiver Sp1-DNA-kompleks. (B) Anti-Sp1-antistof blev tilsat som indikeret, og komplekset fraværende efter inkubering med antistof er angivet med pilen. (C) Mithramycin (120 nM) blev tilsat til angivne baner og komplekset depleteret efter inkubation med lægemidlet indikeres af udfyldt pil. (D) Umærket konkurrerende oligonucleotid kodende Sp1 konsensus bindingssted blev tilsat som vist.

Inkubation af kerneekstrakt fremstillet ud fra prostatacancer-cellelinie DU145 med enten Sp1-1, ARS eller Sp1-3 oligonukleotider fremstillet flere bands med næsten identiske elektroforetiske motilities (fig 5B, bane 1, 4 og 6 henholdsvis). Bindingen af ​​Sp1 blev bekræftet i alle tilfælde ved tilsætning af anti-Sp1 antistof, der produceres et supershift med Sp1-1 oligonukleotid og stærkt formindsket samling af et DNA med høj molekylvægt: proteinkompleks med både ARS og Sp1-3 (Fig 5B , banerne 2, 5 og 7), medens præimmunt serum ikke havde nogen virkning (fig 5B, bane 3). Forskellige resultater af inkubering med anti-transkriptionsfaktor antistof kan forekomme i EMSA-analyser f.eks CREB-1 til CRE sites i de humane insulin og somatostatin-promotorer [44], på grund af flere faktorer, herunder: styrken af ​​binding til DNA’et; den rumlige /konformationelle organisering af proteinet på regulatoriske elementer, orienteringen af ​​DNA tilstødende til konsensus og tilstedeværelsen af ​​bundne cofaktorer.

Tilsætning af mithramycin A, som interfererer med binding af Sp1 til dets regulatoriske element [45 ], stærkt reduceret dannelse af højmolekylære komplekser med alle tre oligonukleotider (figur 5C, sammenlign bane 1 og 2, 3 og 4, og 5 og 6). Tilsvarende præinkubation med overskud af umærket oligonukleotid indeholdende konsensussekvensen Sp1 bindende sekvens stort set elimineret alle DNA: protein-kompleks-dannelse (fig 5D, sammenlign bane 1 og 2, 3 og 4, og 5 og 6). Tilsammen udgør disse resultater bekræfter binding af Sp1 til alle tre GC box-holdige sekvenser, støtter konklusionerne fra reporter gen eksperimenter (Fig 4). Endvidere var forskellen i resultater ses med oligonukleotiderne for Sp1-1 stedet i kernepromotoren i sammenligning med de ARS og Sp1-3 sites, som udviste tydelig lavere affinitet for naturlige Sp1, forskellige resultater ved inkubering med anti-Sp1 antistof og lavere mutation-induceret reduktion i luciferaseassays (fig 4), antydede, at binding af Sp1 til kernepromotoren GC kassen var stærkere end til 5’UTR.

transskriptionsfaktoren pur-α binder fortrinsvis til guanine- rige enkeltstrenget DNA eller tilsvarende sekvenser i dobbeltstrenget DNA. Inkubation af kerneekstrakt med enten dobbeltstrenget eller G-rige enkelt revers streng af ARS og Sp1-3 prober gav ganske uens resultater. Begge de enkeltstrengede prober frembragte en DNA: protein-kompleks (angivet med åben pil), der migrerede lidt foran Sp1: DNA og andre højmolekylære komplekser typisk ses med den dobbeltstrengede probe (Fig 6A). Overensstemmelse med evnen hos PUR-α til også binde dsDNA, både ARS og Sp1-3 dobbeltstrengede oligonukleotider fremstilles en svag DNA: protein-kompleks, der migrerede i en meget lignende position til produktet set med de enkeltstrengede prober. Vigtigt er det, DNA: protein-kompleks dannet med G-rige streng i Sp1-3 opførte sig på samme måde som i den tilsvarende ARS oligonukleotid, som vides at binde pur-α [36]. Interessant pur-α binder DNA som dimerer og multimerer [46], som kan overleve de ikke-denaturerende betingelser for EMSA resulterer i de tilsyneladende høj molekylvægt migration karakteristika af DNA: protein-komplekser. Den kommercielle anti-PUR-α-antistof mislykkedes at fremkalde en virkning og det oprensede protein ikke er tilgængelig. Alligevel de komplementære cytosin-rige forward strenge af ARS og Sp1-3 oligonukleotider helt undladt at producere DNA: protein-kompleks, der bekræfter specificiteten af ​​binding til G-rige streng (figur 6B; sammenlign bane 1 og 7, og 4, og 8).

kerneekstrakt fra DU145-celler blev inkuberet med mærkede oligonukleotidprober nedenstående hver gel, og de varer løses ved elektroforetisk mobility shift-analyse. Tilgang er vist over gelerne og var: Ab, antistof; PI, præimmun serum. EMSAs er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. (B). (C).