PLoS ONE: SHARP1 Undertrykker Angiogenese for endometriecancer ved at formindske Hypoxi-Inducerbar Factor-1α Level

Abstrakt

De seneste data støtter en rolle for SHARP1, en grundlæggende helix-loop-helix transskription repressor, i reguleringen af ​​maligne celle adfærd i flere humane kræftformer. Men udtryk og rolle SHARP1 under udviklingen af ​​endometriecancer (EF) fortsat uklare. Her viser vi, at opregulering af SHARP1 undertrykt tumorangiogenese ved at reducere hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α), inhiberede cellelevedygtighed og tumorvækst i EF. Immunohistokemisk farvning viste, at ekspressionen af ​​SHARP1 var negativt korreleret med tumor stadium, histologisk bedømmelse, myometrisk invasion, lymfeknudemetastase, blodkar gennemsivning i myometrium og HIF-1α ekspression. Mekanistiske undersøgelser viste, at SHARP1 interagerede med HIF-1a fysisk, og det protein niveauet af HIF-1α og mRNA niveauet af sit mål gener (

VEGFA, ANGPTL4

og

CA9

) blev reduceret med SHARP1 under hypoxi. Opregulering af SHARP1 i EF hæmmet hypoxi-induceret angiogenese ved reduktion VEGF-sekretion. Immunhistokemisk analyse bekræftet en sammenhæng mellem nedsat SHARP1 udtryk og øget mikrokar tæthed i EF-væv. Derudover SHARP1 inhiberede cellelevedygtighed i EF-cellelinier. Overekspression af SHARP1 in vivo inhiberede tumorvækst og angiogenese, og nedsat HIF-1α ekspression. I denne undersøgelse, etablerede vi SHARP1 som en ny tumor suppressor af EF og belyse de mekanismer, hvordan SHARP1 hæmmede EF progression. Derfor kan SHARP1 være et værdifuldt prognostisk biomarkør for EF progression og shows lover som en ny potentielt mål for antiangiogeniske lægemidler i human EF

Henvisning:. Liao Y, Lu W, Che Q, Yang T, Qiu H, Zhang H, et al. (2014) SHARP1 Undertrykker Angiogenese for endometriecancer ved Faldende Hypoxi-Inducerbar Factor-1α Level. PLoS ONE 9 (6): e99907. doi: 10,1371 /journal.pone.0099907

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Februar 17, 2014 Accepteret: 19 maj 2014; Udgivet: 11 juni 2014

Copyright: © 2014 Liao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81272885, 81172476, 81072139, 81072140), Fonden projekt af Shanghai Municipal Videnskab og Teknologi Kommissionen (nr 13JC1404500) og ph.D. Programmer Foundation of Undervisningsministeriet Kina (nr 20120073110090). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer (EF) er en væsentlig årsag til kræft-relaterede sygelighed og dødelighed blandt kvinder. Det er den fjerde mest almindelige malignitet blandt kvinder i USA, med en anslået 49.500 nye tilfælde og 8200 dødsfald i 2013 [1]. Selvom tidlige fase EF ofte med held behandles med kirurgisk indgreb, kan behandling af fremskreden EF være vanskeligt og dens prognose er dårlig [2], [3], navnlig i forbindelse med metastatisk eller recidiverende sygdom, med en median overlevelse på kun 7 -12 måneder [4]. Aktuelle behandlingsmuligheder, såsom hysterektomi, hormonbehandling, og kombinationer af stråling og kemoterapi, er effektive til tidlige fase EF dog effektive mål behandlinger for patienter med metastatisk eller recidiverende EF er ikke tilgængelige [5], fordi ætiologien og biologiske mekanismer af denne heterogene sygdom ikke er fuldt forstået. Derfor yderligere belysning af de molekylære mekanismer bag EF progression haster.

angiogenese, dannelsen af ​​nye blodkar fra allerede eksisterende dem, har en stor rolle i tumorvækst, progression, og metastase [6], [7 ]. Indledningsvis angiogene aktivitet er fraværende i tidlige neoplasmer. Men som tumorer vokse ud over det eksisterende udbud sats, bliver ilt opbrugt i kernen. Den resulterende hypoxiske tilstand (PO

2 10 mmHg [~1.5% O

2]) forhindrer nedbrydning af hypoxi-inducerbare faktor-1α (HIF-1α) gennem VHL tumor suppressor, så trans-aktivering af pro- angiogene faktorer, hvoraf den mest bemærkelsesværdige er vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [8] – [11]. Nyere forskning har vist, at HIF-1α /VEGF signalvejen er involveret i endotelcelleproliferation, differentiering, migration og vaskulær permeabilitet [12]. Endvidere kan inhibering af neovaskularisering ved suppression af HIF-1α /VEGF signalvej forsinke tumorprogression og måske endda sulte tumorceller ihjel [13] – [15]. Ligesom andre faste tumorer, vækst og metastase af EC-celler er afhængige af angiogenese [16]. Mekanismen bag angiogenese regulering er blevet grundigt beskrevet i andre typer af kræft, men kun næppe undersøgt i EF [15].

SHARP1 (også kendt som bHLHE41 eller Dec2), et medlem af transkriptionsrepressor underfamilien af ​​grundlæggende helix løkke-helix (bHLH) transkriptionsfaktorer [17], [18], er udtrykt i forskellige embryonale og voksne væv [19], [20]. Omfattende tyder det er en vigtig regulator af tumor progression i mundtlig og brystkræft, hvor dens virkninger på kræft celle apoptose, proliferation og metastase er ofte blevet undersøgt [21] – [24]. Desuden SHARP1 regulerer negativt VEGF udtryk [25], og en nylig undersøgelse viser, at SHARP1 undertrykker brystkræft metastaser [23]. Men det er stadig uvist, om og i givet fald, hvordan SHARP1 bidrager til udviklingen og progressionen af ​​EF, navnlig med hensyn til angiogenese, hvor HIF-1α /VEGF vej er involveret.

I den foreliggende undersøgelse viste vi, at nedsat ekspression af SHARP1 var signifikant korreleret med dårlig klinisk resultat i EF. Desuden er det for første gang, vi viste, at SHARP1 har en suppressiv rolle under EF progression; især SHARP1 hæmmede angiogenese i en HIF-1α-afhængig måde og kan være en værdifuld markør for antiangiogenisk terapi udvælgelse.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af human Investigation Etisk Komité International Peace Maternity Child Sygehus tilknyttet Shanghai Jiao Tong University. Prøverne af EF og normale endometrie væv blev indsamlet efter skriftligt informeret samtykke fra patienterne. Dyret forskning blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i retningslinje for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i Kina. Procedurerne blev godkendt af Institut for Laboratory Animal Science Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser.

Patienter og prøver

Paraffin-indlejrede væv prøver blev indhentet fra 110 patienter med endometriecancer og 52 patienter med normal endometrium, som gennemgik kirurgisk resektion for at behandle andre sygdomme som myom eller adenomyose på International Peace Maternity Child Health Hospital tilknyttet Shanghai Jiao Tong University fra 2009 til 2013. Den gennemsnitlige alder af patienterne med EF var 56,9 ± 8,8 år (gennemsnit ± SD, median, 57 år, interval, 33-78 år). Gennemsnitsalderen for de patienter med normal endometrium var 53,9 ± 8,6 år (gennemsnit ± SD, median, 53 år, interval, 34-70 år). Der var ingen signifikant forskel med hensyn til patientens alder, hvor EF og kontrolprøver blev sammenlignet (

P

= 0,054). I kontrolgruppen, alle prøver var hysterektomi eksemplar, hvoraf 16 tilfælde var fra postmenopausale kvinder, 17 tilfælde var fra perimenopausale kvinder og de andre var fra præmenopausale kvinder. Etaperne (I-IV) og histologiske kvaliteter (G1-G3) af disse tumorer blev oprettet i henhold til kriterierne i den internationale sammenslutning af Gynækologi og obstetrik (FIGO) kirurgisk staging-system (2009) [26]. Ingen af ​​patienterne havde gennemgået hormonbehandling, strålebehandling eller kemoterapi før operation.

Immunhistokemi (IHC) og vurderinger

Vævssnit (4 um tyk) blev fremstillet af paraffinindlejrede vævsprøver. Snittene blev afvokset med xylen, efterfulgt af rehydrering i gradueret alkohol. Antigen genfinding blev udført i ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA; pH 9,0) i 20 minutter ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Derefter endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering af sektionerne med 3% hydrogenperoxid i 10 minutter, og ikke-specifik farvning blev blokeret ved inkubering med 10% normalt gedeserum i 30 min. Snit blev inkuberet med kanin polyklonalt antistof mod SHARP1 (et fortyndingsforhold på 1:100 til 10 ug /ml; Novus, Littleton, CO), muse monoklonalt antistof mod HIF-1α (et fortyndingsforhold på 1:50 til 5 ug /ml , BD Biosciences, Bedford, MA), kanin monoklonalt antistof mod CD34 (et fortyndingsforhold på 1:100 til 5 ug /ml; Abcam, Cambridge, UK), og kanin-polyklonalt antistof mod Ki67 (et fortyndingsforhold på 1:100 til 5 ug /ml; Epitomics, Burlingame, CA) i et fugtigt kammer ved 4 ° C natten over og blev derefter inkuberet med biotinyleret sekundært antistof (et fortyndingsforhold på 1:1000 til 1 ug /ml; Beyotime, Nanjing, Kina) i 30 min, efterfulgt af streptavidin-peroxidase i 15 min. Phosphatpufret opløsning (PBS) blev anvendt til at fortynde antistoffer. Peroxidase aktivitet blev detekteret ved anvendelse af 3,3′-diaminobenzidin-tetrachlorid. Hver inkubation blev udført ved 37 ° C og blev efterfulgt af tre sekventielle vaske med PBS i 5 minutter hver. Endelig sektioner var dehydreret i alkohol og ryddet i xylen.

Scoring blev udført af to uafhængige patologer, der var blindet for de kliniske og patologiske data. SHARP1 farvning blev evalueret ved at vurdere antallet af celler med positiv nuklear og cytoplasmatisk farvning og intensiteten af ​​farvningen i hver positiv kerne og cytoplasma. Antallet af positive celler blev gradueret som følger: 0 ( 5%); 1 (5-25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 ( 75%). Intensiteten blev gradueret som følger: 0 (negativ); 1 (svag); 2 (moderat); 3 (stærk). En endelig score blev beregnet ved at multiplicere de to scorer ovenfor. Snesevis af 0-2 blev defineret som ” negative udtryk ”; snesevis af 3-8 som ” svagt positivt udtryk ”, og snesevis af 9-12 som ” stærkt positivt udtryk ” [27]. For HIF-1α-farvning, kun den procentdel af mørke, homogent farvede kerner blev vurderet, og cytoplasmatisk farvning blev ignoreret. Det blev anset for positiv, når 1% af kerner blev farvet [28]. Den mikrokar densitet (MVD) blev vurderet ved IHC farvning for CD34, som fremhæver tumor /væv vaskularisering. De mikrokar blev talt i tre forskellige felter pr afsnit som følger: slides blev først scannet under lav effekt (× 100) til at bestemme tre ” hotspots ” eller områder med det maksimale antal mikrokar, så de positive-farvede blodkar i udvalgte områder blev analyseret ved × 400 forstørrelse [29].

Cell Culture, hypoxiske betingelser, og reagenser

Menneskelig EF-cellelinjer (Ishikawa og RL95-2) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Humane umbilical vaskulære endotelceller (HUVEC’er) blev opnået fra Key-GEN Biotech (Nanjing, Kina). Ishikawa og RL95-2 celler blev dyrket i DMEM /F12 (Gibco, Auckland, NZ) suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, Carlsbad, CA). HUVEC’er blev dyrket i RPMI1640 (Gibco) suppleret med 10% føtalt bovint serum. Celler blev dyrket i en CO 5%

2 befugtet inkubator ved 37 ° C. For hypoksi eksperimenter blev celler dyrket i et in vitro hypoxisk ( 0,1% O

2) beholdersystem (BD Diagnostics, Sparks, MD). Konditioneret medium (CM), protein og RNA blev indsamlet straks, når celler blev fjernet fra hypoxisk beholder.

Forbigående og Stabile Transfektioner for SHARP1-overekspression

SHARP1 udtryk plasmid Pez-M02-SHARP1 og tomme plasmid preceiver-M02-NEG blev købt fra GeneCopoeia (Guangzhou, Kina). Transient transfektion blev udført i 70% konfluente Ishikawa-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. For stabil ekspression i Ishikawa-celler, blev det humane SHARP1 gen klonet ind lentivirusvektorer med Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP hjælp Gateway teknologi (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til betjeningsvejledningen (http: //products.invitrogen. dk /ivgn /produkt /12.538.120).

lille interfererende RNA (siRNA)

siRNA’erne blev syntetiseret ved GenePharma Biotech (Shanghai, Kina). Sekvenserne er vist i tabel 1. siRNA blev transficeret ind i celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens som beskrevet ovenfor.

RNA-isolering og kvantitativ real-time PCR (qPCR)

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Første-streng cDNA blev revers-transkriberet fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af Prime Script RT reagenskit (Takara, Dalian, Kina), og cDNA’et blev analyseret ved qPCR hjælp SYBR Premix Ex Taq (Takara). For qPCR forsøg værdier på

y Salg akse repræsenterer 2

(- ΔΔCt), hvor ACt er forskellen mellem Ct for genet af interesse, og at af genet, der koder β-actin og ΔΔCt er forskellen mellem ACt af forsøgsgruppen og kontrolgruppen eller første bane [30]. Primer sæt er vist i tabel 2. Data blev opnået i tre eksemplarer fra tre uafhængige forsøg.

Western blotting

Celler blev lyseret i RIPA-lysepuffer (Beyotime, Nanjing, Kina) med proteaseinhibitor phenylmethansulfonylfluorid (PMSF; Beyotime). Proteinkoncentration blev bestemt ved en BCA Protein Assay kit (Beyotime). Lige store mængder protein blev fyldt i hver bane af en SDS-PAGE-gel for protein separation og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA). Membraner blev blokeret og derefter inkuberet med kanin polyklonalt antistof mod SHARP1 (et fortyndingsforhold på 1:500 til 2 pg /ml; Novus), muse monoklonalt antistof mod HIF-1α (et fortyndingsforhold på 1:200 til 5 ug /ml; Abcam), og kanin-polyklonalt antistof mod β-actin (et fortyndingsforhold på 1:5000 til 0,2 ug /ml; Epitomics) individuelt ved 4 ° C natten over. Derefter peroxidase-koblede sekundære anti-kanin- og anti-mus-antistoffer (et fortyndingsforhold på 1:5000 til 0,2 ug /ml; Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Der blev anvendt til at påvise de bundne primære antistoffer

Co-Immunpræcipitation (Co-IP) Indhold

at studere endogene SHARP1 /HIF-1α binding blev Ishikawa celler inkuberet under hypoxi i 24 timer før høst. Derefter to sammenflydende 10 cm skåle af celler blev lyseret som beskrevet ovenfor. Før immunopræcipitation blev totale cellelysater inkuberet med 1 ug muse-IgG og 20 pi af en protein A + G-agaroseperle opslæmning (Beyotime) ved 4 ° C i 2 timer for at fjerne ikke-specifik binding. Centrifugering blev derefter udført, og supernatanten blev opsamlet og inkuberet med muse-anti-humant HIF-1α (slutkoncentration: 10 ug /ml; Abcam) eller kontrol muse IgG (slutkoncentration: 10 ug /ml; Beyotime) natten over. Den næste dag, 40 pi af en protein A + G-agaroseperle opslæmning sattes til reaktionsblandingerne og inkuberes i 4 timer ved 4 ° C med rotation. Co-immunpræcipiteret proteiner blev analyseret ved western blotting som beskrevet ovenfor

enzymmaerket Assay (ELISA)

Quantikine human VEGF-kit blev købt fra R . D-systemer (Minneapolis, MN). Celler blev podet i 12-brønds plader. Ved 24 timer efter transfektion blev mediet erstattet af DMEM /F12, og cellerne blev dyrket under hypoxi eller normoxi i yderligere 24 timer. Derefter blev supernatanterne opsamlet, og ekstracellulære VEGF i mediet blev kvantificeret i overensstemmelse med producentens anvisninger.

endotelcelle Tube Formation Assay

En plade med 96 brønde blev overtrukket med 100 pi Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA) per brønd og holdt ved 37 ° C i 30 minutter. Derefter, 2 × 10

4 HUVEC’er blev suspenderet i 1 ml fortyndet konditioneret medium (CM; 1:10) og påført den præ-coatede 96-brønds plade med en tæthed på 2000 celler /brønd. CM blev opsamlet fra supernatanten fra Ishikawa-celler dyrket under hypoxi eller normoxi i 24 timer. Efter inkubation ved 37 ° C i 14 timer blev den samlede længde af de kapillære-lignende rør, der havde dannet talt, og gennemsnittet i tilfældigt udvalgt tre mikroskopiske felter. blev observeret morfologiske forandringer under et mikroskop, og cellerne blev fotograferet ved 100 ganges forstørrelse.

Nude Mouse Tumor xenograft Assay

Nitten 6 uger gamle kvindelige nøgne BALB /c-mus blev opnået fra Shanghai Life Science Institute (SLAC Laboratory Animal Co., Ltd, Kina). At etablere en nøgen musemodel bærende EF, Ishikawa-celler transficeret med lentiviral vektor, der bærer det humane SHARP1 gen (Lenti-SHARP1) eller med tom vektor alene (Lenti-Control) blev anvendt. Alle mus blev tilfældigt opdelt i to grupper af fem mus (de andre ni mus blev anvendt til Matrigel plug assay; se nedenfor). Cellerne blev injiceret subkutant i flanken på hver mus (1 x 10

7 celler pr injektion). Subkutan tumor-dannelse blev overvåget i alle nøgne mus hver 7 dage fra 14 dage efter injektionen. De korte og lange diametre tumorerne blev målt ved hjælp af en caliper og tumor volumen (cm

3) blev beregnet ved hjælp af følgende standard formel: tumor volumen (cm

3) = (den længste diameter) × ( korteste diameter)

2 × 0.5. Mus blev aflivet 6 uger efter injektion, hvorefter tumorer blev omhyggeligt fjernet, og deres vægt og volumen blev målt inden yderligere histologisk evaluering.

Mus Matrigel Plug Assay

Nine nude BALB /c mus blev tilfældigt opdelt i tre grupper med tre mus. Vækstfaktor-reduceret Matrigel (BD Biosciences) (300 pi) blev blandet med Ishikawa-celler transficeret med tom plasmid under normoxi eller hypoksi eller SHARP1 fuld-længde plasmid under hypoxi, eller blandet med tilsvarende CMS (100 pi) fra de selvsamme celler nævnte over. Celler eller tilsvarende CM blev opsamlet på samme tid efter dyrkes under angivne betingelser i 24 timer. Blandingerne blev injiceret subkutant i flanken på hver mus (højre side, blanding med celler, venstre side, blanding med tilsvarende CM). Musene blev aflivet, og propper blev fjernet 14 dage efter inokulering og fotograferet. Matrigel plugs blev farvet med hematoxylin og eosin (H 5 mg /ml) reagens (Sigma, St. Louis, MO) blev tilsat til dyrkningsmediet. Absorbans-værdierne blev målt ved 490 nm med en mikropladelæser (model 680; Bio-Rad, Hercules, CA). For HUVEC detektion levedygtighed, 2 × 10

4 HUVEC’er blev suspenderet med 1 ml fortyndet CM (fortynding 1:10) og podet i plader med 96 brønde ved 2000 celler /brønd. Efter 24 timers inkubation blev HUVEC levedygtighed detekteret ved MTT-assayet som beskrevet ovenfor. I hvert forsøg og under hver betingelse blev cellelevedygtighed vurderet i tre eksemplarer, og forsøg blev gentaget tre gange.

Statistical Analysis

Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS software-version 17,0 (Chicago, IL ). Værdier repræsenterer middel ± SD. Data blev analyseret ved uparret Students

t

-test eller ved envejs variansanalyse (ANOVA) for multiple sammenligninger. Den χ

2 test for tabeller blev brugt til at sammenligne de kategoriske data. Spearman korrelationskoefficient test blev anvendt til korrelation detektion. En

P

-værdi af. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

SHARP1 nedreguleres i EF, og er korreleret med klinisk-patologisk Karakteristik

Til bestemme virkningen af ​​SHARP1 udtryk på EF-udvikling og progression, valgte vi 52 tilfælde af normal endometrium væv, 97 tilfælde af endometrioide endometriecancer (EØF) væv og 13 tilfælde af papillær serøs EF eller klar celle EF væv som repræsentanter for type i og type II EF hhv. Type I EF, forekommer i omkring 85% af patienterne, ofte viser ER positiv. Tumorer med denne type tendens til at være godt differentieret, af lav kvalitet og god prognose. I modsætning hertil type II, består hovedsagelig af serøs og klar celle karcinom, opstår typisk i atrofisk endometrium via en mekanisme relateret til østrogen eksponering. Denne type er normalt ER negativ, og dårligt differentieret, af høj kvalitet og dårlig prognose. Selvom type II EC’er udgør ca. 15% af tilfældene, de er ansvarlige for omkring 50% af alle tilbagefald [31]. Immunohistokemisk farvning afslørede, at SHARP1 stærkt blev udtrykt i cytoplasmaet og kernen i de fleste celler i normal endometrium men viste signifikant reduceret ekspression i EF (

P

= 0,00046, tabel 3, figur 1A-C).

Repræsentative mikrofotografier af SHARP1 og HIF-1α farvning i endometrium væv (original forstørrelse: 400 × for skær, 200 × for alle andre; skala bar, 100 um). Paneler A-C viser immunhistokemisk farvning for SHARP1 i normal endometrium (A), endometrioide endometriecancer (EØF) (B), og papillær serøs EF (C). Paneler D-F viser immunhistokemisk farvning for SHARP1 i histologiske grad 2 (G2) EØF (D), G3 EØF (E), og klar celle EF (F). Paneler G-jeg viser immunhistokemisk farvning for HIF-1α i G2 EØF (G), G3 EØF (H), og klar celle EF (I) i de tilsvarende samme områder af samme tilfælde til SHARP1 farvning.

de klinisk-patologiske karakteristika af EF patienterne 110 blev sammenfattet i tabel 4. i forhold til EØF SHARP1 udtryk var signifikant nedsat eller tabt i papillær serøs EF eller klar celle EF (

P

= 0,017), som tegner sig for de mest aggressive former for EF. Desuden SHARP1 udtryk faldt markant i sen-fase (fase III eller IV) eller high-grade (G3), EF i forhold til den tidlige fase (fase I eller II) eller lav kvalitet (G1, G2) EF (

P

= 0,017 og

P

= 0,001, henholdsvis). Derudover fandt vi også stærke inverse korrelationer mellem SHARP1 udtryk og myometrisk invasion (

P

= 0,002), lymfeknude metastaser (

P

= 0,005), og blodkar gennemsivning i myometriet (

P

= 0,021). Vi imidlertid ikke, finde nogen signifikante korrelationer mellem SHARP1 og andre clinicopathologic variabler, herunder alder og udtryk for østrogen-receptor, progesteron receptor, og p53.

Angivelse af SHARP1 er omvendt korreleret med HIF-1α i EF

for at afgøre, om den reducerede SHARP1 udtryk korrelerer med HIF-1α udtryk i tumorvæv, immunhistokemisk farvning af HIF-1α blev udført i 104 af de 110 EF vævsprøver (resten seks prøver blev mangler eller er beskadiget ). Blandt dem, 31 var stærkt positiv for SHARP1 (29,8%), og 77 af 104 prøver var positive for HIF-1α (74,0%). Kun 16 tilfælde var stærkt positiv for SHARP1 og positive for HIF-1α (15,4%). Vores kliniske data giver det første bevis på, at der er en stærk omvendt korrelation mellem SHARP1 og HIF-1α udtryk i EF (

P

= 0,003, tabel 5, figur 1D-I).

SHARP1 dæmper Angivelse af HIF-1α Protein og dens Downstream gener i EF cellelinier

på baggrund af vores kliniske fund, foreslog vi en potentiel sammenhæng mellem SHARP1 og HIF-1α. Brug af qPCR og western blotting, fandt vi, at

SHARP1

niveau var forhøjet dobbelte i EF-cellelinien RL95-2 i forhold til Ishikawa cellelinie, som begge stammer fra adenocarcinom i endometriet (figur 2A) . For yderligere at undersøge SHARP1 funktion og dens korrelation med HIF-1α, vi opreguleret SHARP1 hjælp SHARP1 ekspressionsplasmider i Ishikawa-celler og bankede ned SHARP1 hjælp siRNA i RL95-2 celler. Transfektionseffektiviteten blev bekræftet på 48 h og 72 h efter transfektion til mRNA og protein niveauer, henholdsvis (figur S1).

(A) Ekspression af SHARP1 i Ishikawa og RL95-2 celler som bestemt ved qPCR (venstre ) og western blotting (højre). (B) Western blot-analyse af kontrol- og SHARP1-overudtrykkende Ishikawa-celler dyrket ved de angivne oxygenniveauer i 24 timer. (C) Western blot-analyse af virkningerne af SHARP1 udtømning i RL95-2 celler efter 24 timer ved de angivne oxygenniveauer. (D) qPCR analyse af

HIF-1α

mRNA i kontrol og SHARP1-overudtrykkende Ishikawa-celler (venstre), og i RL95-2 celler, som var blevet transficeret med kontrol eller SHARP1 siRNA’er (højre) inkuberet ved den angivne iltindholdet i 24 timer. (E) Co-immunopræcipitation (Co-IP) af endogen HIF-1α med endogen SHARP1 fra ekstrakter af Ishikawa celler. Stjernen angiver en baggrund band som følge af krydsreaktion af immunoglobuliner (IgG). (F) qPCR (til venstre) og western blotting (til højre) analyse af

SHARP1

i Ishikawa celler inkuberet i de angivne ilt niveauer for 24 timer. (G) qPCR-analyse af

VEGFA

,

ANGPTL4

, og

CA9

i kontrol og SHARP1-overekspression Ishikawa celler inkuberet i de angivne iltindholdet i 24 timer. (H) qPCR analyser af

VEGFA

,

ANGPTL4

, og

CA9

i RL95-2 celler, som var blevet transficeret med kontrol eller SHARP1 siRNAs og inkuberes ved den angivne ilt niveauer i 24 timer. For transiente transfektioner, blev plasmid (1,6 ug /ml) og siRNA (40 pmol /ml) anvendt. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD fra et repræsentativt eksperiment af tre uafhængige forsøg, hver udført i tre eksemplarer (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001; NS, ikke signifikant). For alle qPCR analyser, blev ekspressionsniveauerne i forhold til p-actin, og data blev normaliseret til udtrykket vist i den første kolonne.

SHARP1 overekspression faldt betydeligt HIF-1α protein niveau i Ishikawa celler under hypoxi (Figur 2B). Vi undersøgte derefter, om endogene SHARP1 var en relevant hæmmer af HIF-1α protein niveauer. SHARP1 udtømning ved hjælp siRNA øget HIF-1α proteinniveau i RL95-2 celler under hypoxi (figur 2C). Imidlertid blev HIF-1α-protein næppe påvist i begge cellelinier dyrket under normoxi. I mellemtiden var ingen signifikant ændring i

HIF-1α

mRNA niveau observeret i Ishikawa-celler overeksprimeres SHARP1 eller RL95-2 celler med udtømning af SHARP1 (figur 2D). Vi har registreret også en fysisk association mellem HIF-1α og SHARP1 på endogene niveauer i Ishikawa-celler under hypoxi bruger co-immunopræcipitering assay (figur 2E). Interessant nok

SHARP1

ekspression blev forhøjet i Ishikawa-celler efter at de blev dyrket under hypoxi i 24 timer (figur 2F). Desuden HIF-1α knockdown hjælp siRNA faldt SHARP1 udtryk under hypoxi (Figur S2A).

For at teste, om SHARP1 funktionelt påvirker HIF-1α aktivitet, blev qPCR anvendes til at påvise forskelle i niveauerne af udvalgte HIF-1α mål gentranskripter. Vi evaluerede de gener, der koder for vaskulær endotel vækstfaktor A (

VEGFA

, en isoform af VEGF, der er afgørende for tumorangiogenese og spiller en central rolle i endotelcelleproliferation, overlevelse, og permeabilitet [7], [10 ], [12], [16], [32]), angiopoietin-like 4 (

ANGPTL4

), og carbonanhydrase 9 (

CA9

). Især blev disse gener transkriptionelt opreguleret under hypoxi i Ishikawa-celler, mens SHARP1 udtryk fugtet disse induktioner (figur 2G). Omvendt SHARP1 knockdown stimulerede transkription af disse gener i RL95-2 celler under hypoxi (fig 2H). Udtrykket af disse gener var imidlertid ikke signifikant påvirket af SHARP1 opregulering eller nedregulering under normoxi. Derudover nedregulering af HIF-1α hjælp siRNA svækket mRNA ekspression af

VEGFA

,

ANGPTL4

CA9

i Ishikawa-celler under hypoxi (fig S2B).

SHARP1 hæmmer angiogenese

HIF-1α er en mester regulator af tumor angiogenese [33], og SHARP1 hæmmede

VEGFA

mRNA-ekspression i vores undersøgelse (figur 2G, venstre panel). Endvidere udførte vi ELISA til påvisning af VEGF-sekretion i konditioneret medium (CM) af Ishikawa-celler. SHARP1 overekspression delvist reducerede VEGF-sekretion induceret af hypoxia i Ishikawa-celler (figur 3A). Således har vi overvejet, om Indfald af SHARP1 om HIF-1α /VEGF udtryk påvirker hypoxi-udløst angiogenese i EF. Vi bruges flere tilgange til at undersøge, om og hvordan SHARP1 kunne regulere adfærden af ​​endotelceller. CM blev opsamlet fra Ishikawa-celler transficeret med tom plasmid eller SHARP1 fuld-længde plasmid under normoxi eller hypoksi i 24 timer. Især blev levedygtighed og migration evne HUVEC’er stimuleret af CM fra hypoxiske Ishikawa celler, mens CM fra hypoxiske Ishikawa celler, overeksprimeres SHARP1 hæmmede disse effekter (figur 3B og C). Da ingen tydelige effekter af SHARP1 på VEGF-sekretion, HUVEC levedygtighed og migration blev observeret under normoxi, vi brugte CM fra Ishikawa-celler transficeret med SHARP1 eller tomme plasmider under hypoxi for at følge eksperimenter, og CM fra Ishikawa-celler transficeret med tomme plasmider dyrket under normoxi som en negativ kontrol. For at bestemme om SHARP1 ændret funktionelle respons af endotelceller, blev HUVEC’er placeret på en basalmembran matrix til at inducere kapillær-lignende rør-dannelse i nærvær af CMS nævnt ovenfor. Tube-dannelse blev kvantificeret ved at tage gennemsnittet den samlede længde af rør i tre tilfældigt valgte felter. Tilsvarende CM fra SHARP1-overudtrykkende Ishikawa-celler markant inhiberede hypoxi-stimuleret kanaldannelse og forgrening (figur 3D).