PLoS ONE: sædvæske som en kilde til prostatakræft peptid biomarkør Kandidater til detektion af Indolent og Advanced Disease

Abstrakt

Baggrund

Omfattende prostata specifikt antigen screening for prostatakræft genererer et højt antal unødvendige biopsier og over-behandling på grund af utilstrækkelig differentiering mellem indolent og aggressive tumorer. Vi antager, at sædvæske er en robust kilde til nye prostatakræft (PCA) biomarkører med potentiale til at forbedre primær diagnose af og til at skelne fremskreden fra indolent sygdom.

Metode /vigtigste resultater

I et åbent sag /kontrol studie 125 patienter (70 PCa, 21 godartet prostatahyperplasi, 25 kronisk prostatitis, 9 raske kontrolpersoner) blev inkluderet i 3 centre. Biomarkør paneler a) til PCA diagnose (sammenligning af PCA patienter versus godartede kontroller) og b) for fremskreden sygdom (sammenligning af patienter med postoperativt Gleason score 7 versus Gleason score blev søgt 7). Uafhængige kohorter blev brugt til proteomisk biomarkør opdagelse og teste effektiviteten af ​​de identificerede biomarkør profiler. Sædplasma blev profileret under anvendelse kapillarelektroforese-massespektrometri. Pre-analytiske stabilitet og analytisk præcision proteomanalyse blev bestemt. Support vektor machine learning blev brugt til klassificering. Trinvis anvendelse af to biomarkør signaturer med 21 og 5 biomarkører forudsat 83% sensitivitet og 67% specificitet for PCa detektion i en test sæt prøver. Et panel af 11 biomarkører for fremskreden sygdom diskrimineres mellem patienter med Gleason score 7 og orgel-begrænset ( pT3a) eller avanceret (≥pT3a) sygdom med 80% sensitivitet og 82% specificitet i en foreløbig validering indstilling. Skelsættende profiler viste fremragende præ-analytiske stabilitet. Otte biomarkører blev identificeret som fragmenter af N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase, prostatasyrephosphatase, stabilin-2, GTPase IMAP familiemedlem 6, semenogelin-1 og -2. Begrænset prøve størrelse var den største begrænsning af undersøgelsen.

Konklusioner /Signifikans

sædplasma repræsenterer en robust kilde potentielle peptider beslutningstagere til primær PCa diagnose. Vores resultater berettiger yderligere fremadrettet validering for at bekræfte den diagnostiske potentiale identificerede skelsættende biomarkør kandidater

Henvisning:. Neuhaus J, Schiffer E, von Wilcke P, Bauer HW, Leung H, Siwy J, et al. (2013) sædvæske som en kilde til prostatakræft peptid biomarkør Kandidater til påvisning af Indolent og fremskreden sygdom. PLoS ONE 8 (6): e67514. doi: 10,1371 /journal.pone.0067514

Redaktør: Antonia Vlahou, Biomedical Research Foundation, Academy of Athens, Grækenland

Modtaget: September 24, 2012; Accepteret: 23. maj 2013; Udgivet: 24 juni 2013

Copyright: © 2013 Neuhaus et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret delvist af det tyske økonomi- og Technology BMWi med tilskud nr KF0362802MD8 til JUS, JN, PW, ES, JS og give No. EP110141 til ES og JS. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. ES og JS er medarbejdere i Mosaiques Diagnostics GmbH. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigst diagnosticeret kræft og den sjette hyppigste årsag til kræft død hos mænd over hele verden [1]. Indførelsen af ​​serum prostata specifikt antigen (PSA) screening ført til en betydelig stigning i antallet af diagnosticerede tilfælde [2], men ikke kunnet påvise en statistisk signifikant prostatakræft dødelighed fordel [3]. Ninety-fem procent af mænd med PSA-opdages kræft, der er fulgt i 12 år ikke dør af PCa, selv i mangel af konkret behandling, såsom radikal prostatektomi, strålebehandling eller hormonbehandling [3].

Dette har i høj grad overdrevet vores nuværende manglende evne til at gøre evidensbaserede anbefalinger om behandlingsmuligheder efter tumor adfærd, nemlig klinisk ubetydelig, eller indolent sygdom og klinisk signifikant, eller fremskreden sygdom [4]. Derfor er der et akut behov for nye metoder screening for at reducere antallet af mænd, der kræver biopsi og forbedre den diskriminerende nøjagtighed mellem indolent tumor, der har en gunstig klinisk prognose selv uden indgriben, og sygdom, der sandsynligvis har allerede klinisk avancerede, med henblik på at reducere over-diagnose og over-behandling.

proteomiske biomarkør screening er blevet populær i løbet af det seneste årti. Blod, urin, prostata væsker, og prostatavæv er blevet vurderet som biomarkør kilde. Adskillige kandidat biomarkører fundet i disse undersøgelser blev indført som biomarkører i et forsøg på at løse de kliniske behov for diskrimination af indolent og fremskreden sygdom [5] – [7]. Men alle de enkelte biomarkører øjeblikket er til rådighed, mangler diagnostisk nøjagtighed for rutinemæssig klinisk anvendelse. Den høje biologiske variabilitet af prostatacancer antyder, at et særskilt sæt klart definerede biomarkører, snarere end en enkelt biomarkør, kan være mere effektivt at præcist at vurdere sygdommen. Nylige tekniske fremskridt, især i massespektrometri og beregning, tillade anvendelse af proteomisk profilering til opdagelsen af ​​flere protein biomarkør.

For nylig har vi identificeret og valideret en proteomisk mønster af 12 naturligt forekommende, urin peptid biomarkører ved kapillarelektroforese masse spektrometri (CE-MS), i stand til at detektere PCa hjælp første strøm urin med 90% sensitivitet og 61% specificitet [8], [9]. Disse forsøg antydede, at prostata væsker kan tjene som kilde til biomarkører [10]. På grundlag af disse resultater, vi hypotese, at sædplasma kunne tilbyde en robust kilde til at identificere hidtil ukendte PCA protein maker profiler. Denne undersøgelse tager sigte på en systematisk vurdering af præ-analytisk sædvæske stabilitet og dens egnethed til udviklingen af ​​PCA biomarkør paneler.

Resultater

Patienternes kliniske resultat

I total 70 patienter med PCa blev 21 patienter med benign prostatahyperplasi (BPH), 25 patienter med kronisk prostatitis (CP) og 9 sunde kontrol (HC) inkluderet i undersøgelsen (tabel 1 og figur 1). CP og HC grupperne var signifikant yngre end patienterne i PCA og godartet prostatahyperplasi (BPH) grupper (tabel 1). Som forventet PSA niveauer var signifikant lavere i CP og HC i forhold til BPH (0,98-6,70 ng /ml) eller PCa (2,0 – 20 ng /ml) i både, træning og test sæt (p 0,05, Mann Whitney test, to- tailed; tabel 1). Den TNM klassifikation afslørede 60 organ begrænset (≤pT2c) og 10 avancerede (≥pT3a) PSA. Tildelingen af ​​patienter til lave og høje grupper risiko varierede betydeligt mellem klassifikationssystemer (tabel 1).

For biomarkør opdagelse i alt 125 skelsættende plasmaprøver blev brugt fra 70 patienter med PCa, 21 patienter med benign prostatahyperplasi ( BPH), 25 patienter med kronisk prostatitis (CP) og 9 raske kontrol (HC). Denne pulje af tilgængelige prøver blev anvendt i varierende sammensætning i tre arme. I studie A “Diagnostiske Markers” 50/125 patienter med og uden prostatacancer (22 PCa, 14 CP, 9 BPH og 5 HC) blev anvendt til biomarkør opdagelse og de resterende 75/125 patienter (48 PCA, 12 BPH, 11 CP , og 4HC) blev anvendt til diagnostiske præstationstest. I studie B “Advanced Disease Markers” tilgængelige PCA prøver (n = 70) blev stratificeret efter Gleason score. For biomarkør opdagelse patienter med Gleason score 7 (n = 21) og Gleason score 7 (n = 16) blev sammenlignet. De resterende 33/70 patienter med Gleason score 7 (28 indolent sygdom pT3a og 5 ≥pT3a fremskreden sygdom efter EUA retningslinjer) blev anvendt til at teste klinisk ydeevne. Desuden i studie C foreløbig vurdering af stabilitet og præcision fremgangsmåde blev udført.

proteomiske profiler

CE-MS-analyse afkaster, høje profiler opløsning (figur 2, tabel S1). For foreløbig profil kalibrering brugte vi syntetiske isotop mærkede peptider som reference. Denne præ-kalibrering tilladt definition af 287 “hus-holde peptider” som reference masse og migration tid datapunkter. Som ion signalintensitet (amplitude) viste signifikant variabilitet blev signalerne fra 46 med høj hyppighed peptider anvendt som intern standard peptider til signal normalisering (tabel S2). Disse peptider var til stede i 97% af analyserede prøver og viste laveste signal variation. Proceduren til at bruge “intern standard” for amplitude normalisering, blev vist at være en let og pålidelig metode til at løse både analytiske og fortyndingsforhold varianser i et enkelt kalibreringstrin [11]. Tandem massespektrometri [12] – [14] identificerede 141 indfødte skelsættende peptider, der repræsenterer 47 forskellige forældrenes proteiner (Tabel S3). Firs-otte identificerede peptider (83/141, 59%) var fragmenter af semenogelin-1 eller -2, langt de mest udbredte peptider i den lavmolekylære skelsættende proteom.

Kapillærelektroforese koblet til massespektrometri profilering af human sædvæske afslørede i alt 1784 peptider. De syntetiske peptider spiket til prøverne for pre-kalibreringsformål er markeret med hvide pile. Normaliseret molekylvægt (700 til 25,000 Da) i logaritmisk skala er plottet mod normaliseret migration tid (15-45 min). Den gennemsnitlige signalintensitet af top polypeptidet er givet i 3D-afbildning. Indsamlede data sæt PCa (sag) kombineret alle kontroller og også hver for CP (kontrol), BPH (kontrol) og HC (kontrol) fra træningssæt vises.

Biomarkør opdagelse

Undersøgelse a:. diagnostiske markører

For diagnostisk biomarkør opdagelse vi delte de tilgængelige 125 prøver i en opdagelse sæt med 22 PCa, 14 CP; 9 BPH og 5 HC prøver og de resterende 48 PCa, 12 BPH, 11 CP, og 4HC prøver i en uafhængig test sæt (figur 1). Flere statistik test resulterede i 21 diskriminerende polypeptider markant ændret mellem patienter med og uden prostatacancer (Tabel 2 og figur 3). Seks ud af de 21-polypeptider blev identificeret som fragmenter af N-acetyllactosaminide beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase, prostatasyrephosphatase, semenogelin-1 og -2 (tabel 3). . For at definere biomarkør kandidater pålideligt differentiere PCa og BPH, vi sammenlignet BPH

vs

PCA, BPH

vs

CP . HC, og BPH

vs

PCa CP HC hjælp af passende flere test statistik. Fem polypeptider var betydeligt i alle tre prøver tyder egnethed disse kandidater til specifikt at identificere BPH og derfor at udelukke tilstedeværelse af PCa (tabel 2, figur 3). En af dem var et fragment af GTPase IMAP familiemedlem 6 (tabel 3).

Normaliseret molekylvægt (700 til 25,000 Da) i logaritmisk skala er plottet mod normaliseret migration tid (15-45 min). Den gennemsnitlige signalintensitet af top polypeptidet er givet i 3D-afbildning. Gennemsnit datasæt af træningssættet vises Vejviser

Vi anvendte en fremgangsmåde i to trin:. (I) en første panel (21 polypeptider, 21PP) at skelne PCa og BPH blandt inflammatorisk og sund prostata; (Ii) et andet panel (5-polypeptider, 5PP) at differentiere PCa og BPH. Begge underskrifter blev trænet i opdagelsen kohorte (figur 1) ved hjælp af støtte vektor maskine algoritmer (SVM) og nåede AUC-værdier på 100% (95% CI 93% -100%) for 21PP og 99% (95% CI 90% -99 %) for 5PP.

til bekræftelse af klassificeringen udførelsen af ​​biomarkør underskrifter vi anvendt kombinationen af ​​21PP og 5PP til en uafhængig test sæt af 48 PCa, 12 BPH, 11 CP, og 4HC (figur 1). Prøver positive for 21PP (over klassificeringen afskåret) blev re-klassificeres ved anvendelse 5PP til specifikt at identificere BPH eksklusive PSA. Derfor prøver positive for 21PP og negative for 5PP blev betragtet som PCa blev prøver positive i enten paneler betragtes som BPH og prøver negative for 21PP (under klassifikationen afbrød) blev betragtet som CP eller HC kontrolprøver. Denne tilgang korrekt identificeret 40 ud af 48 PCA prøver [83% følsomhed (95% CI 70% -93%)], 6 af 12 BPH og 12 af 15 kontroller [67% specificitet (95% CI 46% -83%)] . AUC-værdi var 75% (95% CI 64% -83%,

P

= 0,0001). Den observerede diagnostiske præstation var så høj som udførelsen af ​​PSA som reference, som viste 87% sensitivitet (95% CI 75% -97%), og 59% specificitet (95% CI 40% -80%).

Undersøgelse B: fremskreden sygdom biomarkører

For fremskreden sygdom biomarkør opdagelse vi delte de tilgængelige 70 PCA prøver til et uddannelse sæt med 37 PCA prøver (21 post-kirurgi Gleason score 7, 16 post-kirurgi Gleason score 7). De resterende 33 prøver med post-kirurgi Gleason score 7 blev anvendt som en test sæt. Sammenligning af 21 GS 7 patienter ( pT3a) til 16 GS 7 patienter (11 pT3a, 5 pT3a) ved hjælp af statistik korrigeret for multiple test resulterede i 11 biomarkører kandidater med et fragment af stabilin-2 blandt dem (tabel 2 og 3). Disse som mønster (11pp) viste sig at klassificere kohorte med en AUC på 99% (95% CI 87% -100%, figur 1).

For at teste effektiviteten af ​​de biomarkører, der er forbundet med fremskreden sygdom, 11pp blev påført testsættet af patienter med post-kirurgi Gleason score 7, som ikke blev anvendt til biomarkør opdagelse. Af de 33 prøver, 9 scoret som avanceret (over klassificeringen afskåret) og 24 som indolent tumor (under klassifikationen afskåret).

I forskellige klassifikationssystemer klinisk praksis anvendes til at estimere risikoen for prostatakræft progression . Derfor sammenlignede vi effektiviteten af ​​vores biomarkører til fem almindeligt anvendte systemer (Tabel S4): 11pp resultater blev signifikant korreleret til TNM stadier [rho 0,423 (95% CI 0,093-0,669), P = 0,0142], EAU score [rho 0,408 ( 95% CI 0,076-0,659), P = 0,0183], og NCCN score [rho 0,365 (95% CI 0,024-0,629), P = 0,0370] (figur 4A-C), mens CAPRA, RTOG og D’Amico score ikke var korreleret (data ikke vist). Brug EAU klassificering som referencestandard, 11pp identificeret korrekt 4/5 avanceret (≥pT3a) og 23/28 orgel-begrænset ( pT3a) tumorer, hvilket resulterer i en AUC på 83% (95% CI 66% -94%,

P

= 0,0055, tosidet magt β = 0,84, figur 5D). Følsomhed var 80% (95% CI 29% -97%) og specificitet var 82% (95% CI 63% -94%)].

(A) .Box og knurhår plots af opnåede 11pp resultater i test kohorte af PCA patienter med GS 7 stratificeret efter TNM, (B) EAU, og (C) NCCN klassifikationssystemer. Sorte firkanter indikerer medianer og whiskers 1,5-gange de interkvartile intervaller. Nummer korrelationskoefficienter rho, den respektive 95% CI og P-værdier er givet ovenfor. (D) ROC-kurve (sorte linjer) til 11pp klassificering af uafhængig validering kohorte af PCA patienter med GS 7 med enten indolent (N = 28) eller avanceret (N = 5) sygdom i henhold til EAU klassificering som referencestandard. 95% konfidensintervaller er plottet som stiplede linjer. Diagonal linje repræsenterer gætte sandsynlighed med et areal under kurven på 0,5. 95% konfidensintervaller (CI) vises som stiplede linjer.

(A) Et gennemsnit på 1887 ± 202 polypeptider blev påvist i hver af de 14 målinger er gemt til forskellige tidspunkter ved RT. Den gennemsnitlige er markeret med en fed linje; standardafvigelse er fremhævet med gråt. (B) ud over denne kvalitative vurdering biomarkør underskrifter blev anvendt til 14 stabilitet replikerer at opnå kvantitative data for tidsafhængig stabilitet sædvæske. For 21PP rangeret korrelationsanalyse viste et signifikant fald i SVM scores over tid med Spearmans rho af -0,576 (95% CI -0,854 til -0,07, P = 0,0379). Regressionsanalyse afslørede et fald på -0,05 A.U. ( 2%) i timen. 5PP og 11pp viste ingen signifikant tid afhængighed. (C) Analytisk præcision af de etablerede SVM klassificører blev vurderet ved at anvende den til 15 CE-MS datasæt opnået fra uafhængige gentagelser af en prøve af en 57 år patient med betydelig BPH. Mean klassificering scoringer var 0,619 ± 0,07, 2,290 ± 0,81, og -1,239 ± 0,18 for 21PP, 5PP, og 11pp hhv. Variationskoefficienter blev beregnet ved at dividere standardafvigelser af den observerede samlede vifte af SVM scores [fremhævet i gråt, 21PP fra -1,50 til 1,50 (3,0 AU), 5PP 4,50-3,0 (7,5 AU), og 11pp fra -1,50 til 1,50 (3,0 AU)]. Variationskoefficienter var 2,2%, 10,8%, og 6,1%, henholdsvis. Klassifikation cut offs er repræsenteret ved vandrette linier. Kasserne skildrer midler og standardafvigelse whiskers

Undersøgelse C:.. Vurdering af biomarkør stabilitet og reproducerbarhed

sædvæske demonstrerede robust præ-analytiske stabilitet ved stuetemperatur. De opnåede profiler var meget ens uden massiv forsvinden eller dannelse af nedbrudte fragmenter. Et gennemsnit på 1887 ± 202 peptider (figur 5A) blev påvist i 14 gentagelser. Undersøgelse af 21PP i disse 14 gentagelser at kvantificere tidsafhængighed af stabilitet afslørede et signifikant fald i SVM scores over tid med Spearmans rho af -0,576 (95% CI -0,854 til -0,07, P = 0,0379, figur 5B). Regressionsanalyse afslørede et fald på -0,05 A.U. ( 2%) i timen. 5PP og 11pp viste ingen signifikant tid afhængighed. Analytisk præcision af de etablerede SVM klassifikatorer blev vurderet i 15 uafhængige gentagelser. Mean klassificering scoringer var 0,619 ± 0,07, 2,290 ± 0,81, og -1,239 ± 0,18 resulterer i koefficienterne for variationer af 2,2%, 10,8% og 6,1% for 21PP, 5PP, og 11pp henholdsvis (figur 5C).

diskussion

Vi antager, at sædvæske er en robust kilde til nye PCA peptid maker profiler med potentiale til at forbedre folkeskolen diagnosticering af prostatakræft og at skelne fremskreden fra indolent sygdom.

i modsætning til tidligere rapporter om proteomisk profilering af sædvæske hjælp tryptisk fordøjelse [15], brugte vi indfødte sædvæske for biomarkør proteomisk analyse. De vigtigste fordele ved denne top-down-tilgang på naturligt forekommende peptider omfatter evnen til direkte at detektere kombinationer af post-translationelle modifikationer, sekvensvarianter, og nedbrydningsprodukter. Vi har detekteret næsten 2.000 forskellige skelsættende peptider ≤ 20 kDa. Det var fragmenter af større forældrenes proteiner, som blev delvist også opdaget tidligere bruger tryptiske nedbrydningsprodukter. Men vores tilgang også identificere endnu ukendte skelsættende bestanddele (tabel S3).

generation af disse naturligt forekommende peptider afhænger af proteolytiske fortætning af ejakulere og resulterer i flere proteolytiske fragmenter af skelsættende proteiner. Sygdom forbundet ændringer i denne proteolytiske fortætning proces kan redegøre for vores observation, at nogle naturligt forekommende fragmenter viser signifikant ændret skelsættende niveauer og andre af samme forældrenes protein ikke. Derfor præ-analytiske stabilitet og analytisk reproducerbarhed er af allerstørste betydning for en vellykket biomarkør opdagelse og klinisk validering. En første milepæl i den aktuelle undersøgelse var udviklingen af ​​en enkel og reproducerbar sampling procedure i overensstemmelse med en klinisk rutine indstilling. Vi lod likvefaktion at nå en endelig stabil tilstand, dokumenteret ved et konstant antal af påviselige polypeptider over tid (figur 5A), men kontrolleret tid til at prøve opbevaring ved -80 ° C til at være under 60 min for at undgå interferens med tidsafhængig biomarkør ustabilitet ved stuetemperatur (figur 5B).

prøver af prostata væv, blod, sædplasma, og urin med og uden prostata massage øjeblikket intensivt analyseret for potentielle PCA biomarkører [5], [6]. Mens væv forventes at være nærmest oprindelsen af ​​sygdommen og at korrelere med højeste biomarkør koncentrationer, prøvetagning af væv er relateret til invasive indgreb med alle risici og begrænsninger. I modsætning hertil især sædplasma og urin er let tilgængelige. Men proteolytisk behandlingen er af stigende betydning for udnyttelsen af ​​markører fra legemsvæsker. Vores foreløbige data om sædvæske stabilitet (figur 5A /B) gav ikke evidens for massiv nedbrydning efter prøveudtagning i kontrast blev observeret for blodserum [16] eller plasma [17]. Derfor sædvæske kan kombinere høj nærhed til prostata som stedet for tumoren kun overgået af direkte prostata væv sampling med fremragende stabilitet og tilgængelighed af urin [18] – [21], hvilket gør det til en meget lovende kilde til potentielle PCA biomarkører.

Vi var i stand til at definere og validere robuste biomarkør signaturer til diagnosticering af PSA. Følsomheden af ​​83% (95% CI 70% -93%) til at diagnosticere PCa var meget sammenlignelige med de tidligere rapporteret for CE-MS baserede urin biomarkør signaturer (sensitivitet 86% til 90%). Specificiteten af ​​67% (95% CI 46% -83%) var lidt bedre end deres urin modstykker af 59% og 61%, henholdsvis [8], [9].

Desuden opdagede vi en skelsættende biomarkør signatur, der adskiller (

P

= 0,0055) patienter med post-kirurgi Gleason score 7 med indolent ( pT3a) eller avanceret (≥pT3a) sygdom med høj følsomhed og specificitet på 80% og 82% , henholdsvis. Aktuel klinisk rutine ved hjælp serum PSA-niveau og præ-kirurgi Gleason sum score til at identificere fremskreden sygdom er fortsat utilstrækkelig, da de fleste af screeningen opdaget PCa har PSA niveauer mellem 4-10 ng /ml og moderate Gleason sum score på 6 og 7. Derfor disse biomarkører, som er baseret på post-kirurgi resultatdata som referencestandard, kunne udgøre en fremtidig mulighed for en ikke-invasiv præoperativ differentiering af organer begrænset og avancerede tumor stadier. Desuden tumor evaluering af præ-kirurgi Gleason score sortering kræver invasive procedurer til at opnå vævsprøver, og hæmmes af betydelig inter-operatør variation og uoverensstemmelser mellem før og efter kirurgi scores i så mange som 35% af tilfældene [22] . Desuden blandt patienter med klinisk lokaliseret sygdom (tumor stadier T1 og T2), er ca. 30% sig at have lokalt fremskredne tumorer efter radikal kirurgi. Derfor er der en reel risiko for under-behandling i denne gruppe af patienter, hvis forvaltes af overvågning. I fremtiden biomarkør profil kan bidrage til at undgå under-behandling hos disse patienter med uklare klinisk præsentation.

En af de differentielt udtrykte skelsættende proteiner var prostata sure phosphatase (ACPP), hvilket er en negativ regulator af cellevækst i LNCaP-celler [23]. Nedregulering af cellulær ACPP er associeret med androgen-uafhængig tumorvækst og høj tumorgenicitet af avancerede PCA kvaliteter [23].

Vi observerede semenogelin-1 fragment 316-344 (ID18990) som et af de 21 differentielt regulerede polypeptider (tabel 2 og tabel 3). Mens dette fragment direkte kan henføres til KLK3 (= PSA) spaltning ved stedet 315 (SSIY-SQTE), dette gælder ikke sandt for den anden observeret semenogelin fragmenter. Disse kan ikke forklares ved KLK3 spaltning alene implicerer tilstedeværelsen af ​​en mere kompleks protease aktivitet netværk med flere nedstrøms spaltningsprodukter begivenheder efter første KLK3 spaltning Det er velkendt, at der er gensidige aktiverings- og hæmning mekanismer inden for fortætning kaskade [24], hvilket kunne føre til forskellige “efterfølgende” spaltningsmønstre. Rollen af ​​de potentielle peptidaser er involveret i dannelsen af ​​de specifikke peptidfragmenter kan ikke bedømmes på nuværende tidspunkt. I yderligere eksperimentelle undersøgelser bør behandles den mulige inddragelse af exopeptidaser, som kunne viderebehandle de indledende fragmenter. Men nuværende litteratur er utilstrækkelig til at tildele særlige spaltningssteder inden semenogelin til distinkte exopeptidaser [25].

Vores undersøgelse står over for flere begrænsninger. Donation af sædvæske til diagnostiske formål er relateret til flere praktiske spørgsmål. Fra nærværende undersøgelse vi lært, at mellem 30-50% af patienterne er villige og i stand til at donere ejakulere før radikal prostata kirurgi. Men vi mener, at accept vil forbedre ved at kommunikere de lovende resultater af vores forundersøgelse.

Vi kunne delvis at kompensere manglende overholdelse ved inddragelse af raske frivillige og patienter med kronisk prostatitis. Selv om disse kohorter muligt for os at bekræfte vores indledende hypoteser, sædvæske tilbyder en robust kilde af biomarkører, kunne de også har indført en vis grad af fordomme relateret til deres alder uoverensstemmelse i forhold til PCA og BPH grupper. Derudover vores tværsnitsbilleder test kohorter er relativt små og skæv. Derfor bør fremtidige bekræftende undersøgelser tankerne godt drevne, afbalancerede og alders-matchede kontrol kohorter med kliniske outcome data om PCA undertyper i opfølgning. Baseret på de små testdata præsenteret her, prøve størrelse beregninger for en sådan form for undersøgelse estimatet alt stikprøve på 200 patienter med fremskreden eller aggressiv PCa og 302 patienter med lokaliseret indolent sygdom at demonstrere en minimal følsomhed og specificitet på 70% og 80% for avancerede PCa henholdsvis.

Selvom brug state-of-the-art tandem massespektrometri, vi var ude af stand til at sekventere alle biomarkør kandidater. I modsætning til identifikation af forældre proteiner ved tryptisk peptid masse fingeraftryk, er native peptid sekventering begrænset af post-translationelle modifikationer, komplicerer ikke kun peptidfragmentering, men også efterfølgende databasesøgninger.

Konklusioner

Vi var i stand til at bekræfte vores indledende hypotese, at sædvæske er en robust kilde til identifikation af PCA-protein maker profiler til primær diagnose af prostatacancer. Vores undersøgelse indebærer en to-trins eksperimenterende tilgang med uafhængige opdagelse og test sæt prøver i forhold til post-kirurgi klinisk referencestandard. Dette design er i overensstemmelse med gældende retningslinier for klinisk proteomanalyse [26]. Selvom vores årgange er relativt små og valgt, var de passende at vurdere mulighederne for skelsættende profilering og at estimere potentialet i skelsættende peptider som diagnostiske biomarkører. Derfor bør nærværende undersøgelse forstås som en meget første skridt ind i området for skelsættende biomarkører. Vores resultater berettiger yderligere bekræftende studier med forstørrede-valgte potentielle validering kohorter at bekræfte og præcis den diagnostiske potentiale seminal biomarkør kandidater og deres (pato) fysiologiske relevans.

Materialer, Patienter og metoder

Etik Statement

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité ved universitetet i Leipzig (Reg.nr. 084-2009-20042009) og blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Study design og sædplasma prøveudtagning

Realiserbare sædvæske prøver blev opnået fra 70 patienter med PCA 21 patienter med benign prostatahyperplasi (BPH), 25 patienter med kronisk prostatitis (CP) og 9 raske kontroller (HC). Som klinisk referencestandard vi brugte en kombination af histologisk oparbejdning af radikal prostatektomi prøver til post-kirurgi tumor grading og iscenesættelse i PCA patienter og negative 10-12 nål prostata biopsi kerner og /eller negative prostata resektion prøver i BPH-patienter. Alle patienter blev bedt om at donere sædvæske før radikal kirurgisk resektion af prostata, under infertilitet eller urologiske diagnostik. For biomarkør opdagelse de tilgængelige 125 prøver blev adskilt i tre arme, en for diagnostiske biomarkører (studie A), en anden for avanceret sygdom biomarkører med forskellig uddannelse og test sæt (studie B), og biomarkør stabilitet og reproducerbarhed (undersøgelse C, figur 1). I studier A og B blev prøver enten brugt til opdagelse eller for præstationstest, men ikke begge dele. Halvtreds prøver (22 PCA, 9 BPH, 14 CP, 5 HC) blev brugt som træningssæt til diagnostisk biomarkør opdagelse (tabel 1A), blev 75 prøver inkluderet i testen for test diagnostisk ydeevne (48 PCa, 12 BPH, 11 CP , 4 HC, tabel 1B). For fremskreden sygdom biomarkør opdagelse vi delte de tilgængelige 70 PCA prøver til et uddannelse sæt med 37 PCA prøver (21 GS 7, 16 GS 7). De resterende 33 prøver med GS = 7 blev brugt som en test sæt (28 pT3a “indolent”, 5 ≥pT3a “avanceret”)

Vi sammenlignede fem forskellige metoder til vurdering af risikoen for klinisk PCa progression. : baseret på retningslinjerne fra AUA [27], som er vedtaget i D’Amico kriterier [28], National Comprehensive Cancer Network (NCCN) kriterier [29], den strålebehandling Oncology Group (RTOG) kriterier [30], den europæiske Association of Urology (EAU) retningslinjer [31], og kræft i prostata Risikovurdering score (Capra) score [32] (tabel S4). Sædvæske prøver blev internt kodet og analyseret i et blindet måde (test sæt) efter oprettelse biomarkør profil (træningssæt).

For at analysere præ-analytiske stabilitet sædvæske opnået ved denne prøvetagningsprotokol, en enkelt prøve af en patient, der huser PCa blev optøet og forberedt i to uafhængige gentagelser (undersøgelse C). Resten af ​​prøven blev inkuberet ved stuetemperatur. I seks timer, hver time to replikater var forberedt. Alle 14 præparerede replikater blev frysetørret kort efter forberedelse og re-suspenderet umiddelbart før CE-MS-analyse.

Analytisk præcision af de etablerede SVM klassificører blev vurderet ved at anvende den til 15 CE-MS datasæt opnået fra uafhængige gentagelser af en prøve af en 57 år gammel patient med signifikant BPH. Prostata volumen var 120 cc og total serum PSA 4,3 ng /mL. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi og standardafvigelse. Variationskoefficienter blev beregnet ved at dividere standardafvigelser af den observerede samlede vifte af SVM scores [21PP fra -1,50 til 1,50 (3,0 AU), 5PP fra -4,50 til 3,0 (7,5 AU), og 11pp fra -1,50 til 1,50 (3,0 AU)].

Sample indkøb og proteomisk analyse

ejakulere indsamlet og tilladt naturlig fortætning at forekomme ved proteolyse ved stuetemperatur i 15 til 30 min. Efterfølgende prøver blev centrifugeret ved 4000 rpm i 10 min for at adskille spermatozoer fra sædplasma. Supernatanten blev derefter opdelt i alikvoter i 50 pi alikvoter og dybfryses ved -80 ° C indtil yderligere forarbejdning.

Prøveforberedelse

Umiddelbart før fremstilling blev sædplasma prøver optøet og proteinkoncentrationen blev justeret til 2 mg /ml. 10 pi-replikater blev lyofiliseret, opbevaret ved 4 ° C.