PLoS ONE: Alpha-Tocopheryl succinat inhiberer Autophagic Overlevelse af prostatakræft celler induceret af vitamin K3 og Ascorbat at Trigger Cell Death

Abstrakt

Baggrund

redox-silent E-vitamin analog α- tocopheryl succinat (α-TOS) viste sig at synergistisk samvirke med K3-vitamin (VK3) plus ascorbinsyre (AA) i induktionen af ​​cancercelle-selektiv apoptose via en caspase-uafhængig vej. Her undersøgte vi den molekylære mekanisme (r) underliggende celledød induceret i prostatacancerceller ved α-TOS, VK3 og AA, og den potentielle anvendelse af målrettet kombination lægemiddel i behandlingen af ​​prostatacancer.

Metode /Principal resultaterne

generation af ROS, cellulære reaktion på oxidativ stress, og autofagi blev undersøgt i PC3 prostatacancerceller ved hjælp af narkotika på sub-toksiske doser. Vi evaluerede om PARP1-medieret apoptose-inducerende faktor (AIF) frigivelse spiller en rolle i apoptose induceret af kombinationen af ​​midler. Dernæst blev virkningen af ​​kombinationen af ​​α-TOS, VK3 og AA på tumorvækst undersøgt i nøgne mus. VK3 plus AA induceret tidlig ROS-dannelse i forbindelse med induktion af autofagi som reaktion på oxidativ stress, som blev reduceret med α-TOS, at forhindre dannelsen af ​​autophagosomes. α-TOS inducerede mitokondrie destabilisering, der fører til frigivelse af AIF. Translokation af AIF fra mitokondrier mod kernen, et resultat af den kombinatoriske behandling blev medieret af PARP1 aktivering. Inhiberingen af ​​AIF samt PARP1 effektivt svækket apoptose udløst af lægemiddelkombinationen. Under anvendelse af en musemodel for prostatacancer, kombinationen af ​​α-TOS, VK3 og AA var mere effektiv i tumor suppression end når lægemidlerne blev givet separat, uden skadelige bivirkninger.

Konklusioner /Betydning

α-TOS, en mitokondrier målretning apoptotisk middel, skifter på sub-apoptotiske doser fra autofagi-afhængige overlevelse af kræftceller til deres død ved at fremme induktion af apoptose. I betragtning af den dystre prognose for kræftpatienter, dette fund er af potentiel klinisk relevans

Henvisning:. Tomasetti M, Nocchi L, Neuzil J, Goodwin J, Nguyen M, Dong L, et al. (2012) Alpha-Tocopheryl succinat Hæmmer Autophagic Overlevelse af prostatakræft celler induceret af vitamin K3 og Ascorbat at Trigger celledød. PLoS ONE 7 (12): e52263. doi: 10,1371 /journal.pone.0052263

Redaktør: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, England

Modtaget: Juni 26, 2012; Accepteret: November 12, 2012; Udgivet: 18. december 2012 |

Copyright: © 2012 Tomasetti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en bevilling fra prostatakræft Foundation of Australia til JN, og den supplerende del af Research finansiering af Polytechnic University of Marche. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mitokondrier har for nylig vist sig som spændende mål for anti-cancer medicin [1] – [3]. Vitamin K3 (VK3), en syntetisk version af vitamin K, udviser cytotoksisk aktivitet i cancerceller ved at forårsage mitokondrier-afhængig beskadigelse ved hjælp af redox cykling samt selektiv inhibering DNA-polymerase-γ, nøgleenzymet af mtDNA replikation [3], [4]. At potensere sin anti-cancer virkning, har VK3 blevet kombineret med redox-aktive ascorbinsyre (AA). Hydrogenperoxid genereret af VK3-AA kombination er blevet rapporteret at inducere celledød i forskellige typer af cancer [5], [6].

VK3-AA-induceret oxidativt stress kan være forskellig i tumorceller og normale cellemetabolisme, og kan tillade manipulation designet til at forbedre kræftbehandlingen. Men som svar på oxidativ stress celler aktiverer veje, der fremmer deres overlevelse og tilpasning, [7]. En sådan stress-respons mekanisme er autofagi [8], [9]. ROS kan inducere autofagi, som kan bidrage til caspase-uafhængig celledød eller i modsætning hertil kan autofagi fremme en beskyttende rolle mod ROS-medieret død [10], [11]. Derfor kan opdagelsen af ​​molekyler, der regulerer autofagi være af stor betydning i udviklingen af ​​lægemidler til behandling af cancer.

For nylig subletale koncentrationer af VK3 og AA sammen med en sub-apoptotisk dosis af α-tocopheryl succinat (α-TOS), er blevet vist at effektivt inducere prostatacancer celledød som blev karakteriseret ved DNA-fragmentering, lysosomal /mitokondriel perturbation, cytochrom

c

frigivelse, mens mangler caspaseaktivering [12]. Stigende tegn på, at caspase-uafhængig baner spiller en vigtig rolle i cancer død, og apoptoseinducerende faktor (AIF) fremstår som en central formidler af denne proces [13] – [16]. Relevant for denne præmis, aktivering af DNA-reparation enzym poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1) er blevet rapporteret som afgørende for AIF frigivelse ved en mekanisme, der involverer Ca

2+ indstrømning i cytosolen [17] – [20].

Brug sub-toksiske doser af α-TOS med sub-toksiske koncentrationer af VK3 + AA tidligere identificerede [12], vi evaluerede effekten af ​​α-TOS på ROS-medieret autophagy udløst af VK3 og AA. Mekanismen (r) er involveret i celledød induceret af agenten kombinationen blev også undersøgt. Vi rapporterer, at VK3 plus AA induceret tidlig ROS-dannelse i forbindelse med induktion af autophagy som reaktion på oxidativ stress. Hæmning af autophagy afdækket den beskyttende rolle VK3 + AA-induceret autofagi i PC3 celler. α-TOS viste sig at reducere VK3 + AA-induceret ROS-dannelse ophævelse af ROS udløser autophagosomes formation. Imidlertid ROS produceres, var tilstrækkeligt til at inducere PARP1 aktivering, hvilket resulterer i frigivelse af pro-apoptotisk faktor AIF, fremme celledød manifesteret ved kendetegnende for apoptose, herunder chromatinkondensering. Den kliniske relevans af denne forskning er leveret af betydelig undertrykkelse af kræft i mus behandlet med kombinationen af ​​de tre agenter.

Resultater

α-TOS hæmmer autophagy udløst af ROS genereret som reaktion på VK3 og AA behandling

det er blevet rapporteret, at sub-toksiske doser af kombinationen af ​​VK3 (3 uM) med AA (0,4 mM) resulterede i intracellulær generation af ROS, men cellerne døde kun i nærvær af α -TOS (30 uM) [12]. For at belyse den rolle, som oxidativt stress i kombinationsbehandlingen, ROS-dannelse og cellulære responser på oxidativt stress (autofagi) blev vurderet over tid. Behandling af PC3-celler med VK3 og AA resulterede i dannelsen af ​​peroxid-relaterede molekyler inden for 30 min, hvorefter ROS-associerede fluorescerende signal tilbage til sin basale niveau. Mens alene α-TOS inducerede en sen dannelse af peroxid-relaterede molekyler, som blev observeret efter 120 minutters inkubation, det reducerede tidlig stigning i deres niveauer som respons på behandlingen af ​​cellerne med VK3 og AA alene (fig. 1A, venstre panel). At undersøge om mitokondrier er den største kilde til ROS-generering, blev niveauerne af superoxid vurderet ved anvendelse dihydroetidium (DHE). Ved interaktion med superoxid, DHE giver ethidiumbromid (EtBr), som akkumuleres i cellekernen og giver rød fluorescens [21]. Fig. 1A (højre panel) dokumenter øger superoxid niveauer i 20-60 min for behandling af cellerne med VK3 og AA, der blev reduceret i nærværelse af α-TOS. DHE-afledte EtBr nuklear farvning blev detekteret over tid ved hjælp af fluorescensmikroskopi, og indikerer, at efter behandling med VK3 og AA, blev de apoptotiske bleb’er indeholdende nukleare komponenter dannet på celleoverfladen efter 60-120 min; 36-46% af cellerne var EtBr-negative (blege celler) som en konsekvens af kromatin tab. Nedsat antal celler med nuklear bleb’er (18% af blege celler) blev observeret ved forlænget inkubation. Cellerne udvundet efter 180 minutters inkubation, hvilket således indikerer en reversibel proces. Tilstedeværelsen af ​​α-TOS markant inhiberede “nyttiggørelse” af bleb’er som påvist ved stigningen i blege celler (66%), fremme celledød (Fig. 1B).

(A) PC3-celler blev behandlet med A-TOS (30 uM), VK3 og AA (3 uM VK3, 0,4 mM AA) og vurderet for ROS-generering ved anvendelse af DCF (en indikator for hydrogenperoxid) eller DHE (en indikator for superoxid), udtrykt som gennemsnitlige fluorescensintensitet. Cellerne blev bedømt for den forøgede fluorescens under anvendelse af flowcytometri. (B) Mikroskopisk visualisering af DHE-farvede PC3 celler efter lægemiddelbehandlinger over tid. Ved interaktion med superoxid, DHE (pointere blå) giver ethidiumbromid (EtBr), som akkumuleres i cellekernen og giver rød fluorescens (øvre panel). De nukleare blærer indeholder beskadiget kromatin reducere nukleare EtBr farvning (blege celler). Flowcytometri kvantificering af lyse celler (EtBr-negative celler, nederste panel) blev udført i PC3-celler behandlet som vist. De viste data er middelværdier ± S.D. (N = 3), de mikroskop billeder er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Forstørrelse 600 ×, skala bar = 10 um.

Efter at have dokumenteret, at medicinsk behandling induceret dannelse af ROS, vi næste undersøgt deres effekt på autofagi i PC3 celler ved evalueringen af ​​udtrykket mønster af mikrotubuli -associeret protein-1 (LC3), ved transmissionselektronmikroskopi (TEM), og via dannelsen af ​​sure vakuolære organeller [22]. LC3 eksisterer i to former, LC3-I (18-kDa) og LC3-II (16-kDa), hvor sidstnævnte er membranbundet og steg i autophagy ved omdannelse af det tidligere [23]. PC3 celler behandlet med VK3 og AA viste højere niveau af LC3-II-protein på 60-120 minutter efter behandlingen, som blev inhiberet i nærvær af α-TOS (fig. 2A). TEM blev udført på PC3 celler efter forskellige behandlingsmuligheder kombinationer. Kontrol- og α-TOS-behandlede celler featured mitokondrier med veldefineret cristae, intakt dobbelt membran, homogen densitet og cylindrisk form. Udseende af et stort antal autophagosomes med en dobbelt-membran struktur i cytoplasmaet blev observeret ved TEM efter 120 min af behandling med VK3 + AA, med lille virkning på den mitokondriske morfologi. I modsætning hertil, når VK3 og AA blev kombineret med α-TOS, fremtrædende unormal mitochondrier med uorganiseret cristae, nedsat elektron densitet og stigning i sideaksen overensstemmelse med mitokondrisk kvældning blev observeret, mens dannelsen af ​​autophagosomes ikke blev påvist (fig. 2B). Optagelsen af ​​den røde fluorescerende AO støtter yderligere den hæmmende effekt af α-TOS på VK3 + AA-induceret autophagy (Fig. 2C).

(A) PC3 celler blev behandlet med lægemidler, som angivet, og niveau i LC3-II-protein omregnes til en-actin blev udtrykt som middelværdi ± SD af LC3-II /LC3-I densitometri forholdet. (B) PC3 celler blev behandlet med lægemidler, som er angivet for 2 h og vurderet for fysik ved TEM. Forstørrelse 4000 ×, skala bar = 0,5 um (øverste billeder), forstørrelse 9000 ×, bar = 0,5 um; N = kerne, m = mitokondrier, a = autophagosomes. (C) PC3-celler blev behandlet som angivet, og dannelsen af ​​AO-akkumuleret sure vesikulære organeller (orange-rød fluorescens) blev påvist under anvendelse af flowcytometri. (D) PC3-celler blev behandlet som angivet i nærvær eller fravær af autofagi inhibitorer (3mA og CQ), og cellelevedygtighed blev assed efter 24 timer inkubation. (E) Dannelsen af ​​autophagosomes i kontrolceller (1) og i nærvær 3mA (2) og CQ (3) blev vurderet ved Western blotting som et udtryk for LC3-II efter 2 timers lægemiddelbehandlinger. Dataene er udtrykt som en ændring i forhold til ubehandlet kontrol, og er middelværdier ± standardafvigelse (N = 3), billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 sammenlignet med kontroller

Næste vi spurgte, om autofagi påvirker celledød. For at løse dette spørgsmål, blev autofagi undertrykt med den farmakologiske inhibitor 3mA (tidlig fase hæmning) og CQ (sen fase hæmning). PC3-celler blev derefter behandlet med α-TOS eller VK3 + AA og α-TOS + VK3 + AA. Som vist i fig. 2D, hæmning af tidlige autophagic proces reduceret cellelevedygtighed i VK3 + AA-behandlede celler i et omfang, der kan sammenlignes med, hvad der observeres, når α-TOS blev kombineret med VK3 + AA. Denne virkning blev ikke fundet, når blokerer det sidste trin af autophagic pathway. Dannelsen af ​​autophagosomes i fravær eller nærvær af de autophagic inhibitorer 3mA og CQ blev vurderet som ekspression af LC3-II efter medicinsk behandling (2 timer). Den VK3 + AA blanding induceret LC3-II-ekspression, som blev inhiberet i nærvær af 3 mA, men ikke CQ (fig. 2E). Dette indikerer, at autofagi er en beskyttende respons på VK3 + AA-induceret celledød, og inhiberingen af ​​autophagy på den tidlige fase er en strategi til at inducere celledød.

Mekanisme af α-TOS, VK3 og AA- induceret celledød

for at undersøge mekanismen (er) involveret i celledød induceret af kombinationen α-TOS med VK3 + AA, vurderet vi rollen som AIF. Sub-cellulær fraktionering viste, at kun når a-TOS (30 uM) blev kombineret med VK3 (3 uM) og AA (0,4 mM), AIF videredistribueret fra mitokondrier til cytoplasmaet og cellekernen (fig. 3A). For at teste om AIF omfordeling er involveret i celledød induceret af kombinationen af ​​de tre midler blev proteinet tavshed og cellelevedygtighed evalueres. Som vist i fig. 3B, siRNA targeting AIF effektivt tavshed AIF udtryk der på sin side svækket celledød induceret af kombinationen af ​​α-TOS, VK3 og AA. Effekten af ​​AIF siRNA er dokumenteret i fig. 3C.

Panel (A) viser fluorescens mikroskop billeder i AIF translokation til kernen efter 180 minutters behandling med A-TOS (30 uM), VK3 og AA (3 uM VK3, 0,4 mM AA) alene eller i kombination (venstre panel). Det nukleare translokation af AIF fremgår af tilsvarende fordeling af den røde (AIF-TRITC) og blå signal (kerne); forstørrelse 600 ×, skala bar = 10 um. Højre panel viser western blot analyse af AIF translokation i cellulære fraktioner. Organel (org), cytoplasma (cyto) og nukleare (Nucl) fraktioner blev opnået fra PC3 celler behandlet med medicin som ovenfor, og niveauet af AIF vurderes. PC3-celler blev transficeret med NS siRNA eller AIF siRNA, og vurderet for AIF proteinniveauet (C). De transficerede celler blev behandlet som ovenfor for 24 timers inkubation og vurderet for levedygtighed under anvendelse af MTT-assayet (B). De viste data er middelværdier ± S.D. (N = 3), billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Symbolet “*” indikerer statistisk forskellige resultater for AIF siRNA- og NS siRNA-transficerede celler med p. 0,05

For at bestemme den direkte sammenhæng mellem den øgede intracellulære ROS-niveauer og AIF-medieret celledød induceret af den kombinatoriske behandling, PC3-celler blev forbehandlet med antioxidanten NAC, som effektivt blokeret cytoplasmatisk og nuklear translokation af AIF induceret af de tre agenter, der angiver den rolle af ROS (fig. 4A, B). Inhiberingen af ​​AIF cellekernetranslokering var forbundet med en ophævelse af narkotika-induceret celledød (fig. 4 C, D). Endvidere at teste, om omfordeling af AIF er en caspase-uafhængig måde blev cellerne udsat for de tre midler i nærvær af pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk, som hverken blokeres AIF translokation eller udøvede nogen beskyttende virkning mod den kombinatoriske behandling (fig. 4 A-D).

Panel (A) dokumenterer AIF-TRITC visualiseres ved fluorescens mikroskop, forstørrelse 600 ×, skala bar = 10 um. (Venstre panel), og Western blot billeder (højre panel) AIF translokation til cytosolen og kernen after180 min behandling med á-TOS (30 uM), VK3 og AA (3 uM VK3, 0,4 mM AA) i fravær eller tilstedeværelse fra NAC (10 mM) eller z-VAD-fmk (10 pM). AIF band tæthed blev normaliseret ved hjælp af et-actin eller lamin, og udtrykkes som middel ± S.D. AIF

cyto-AIF

Nucl /AIF

org densitometri ratio. (B). Cytotoksiske virkning af den kombinatoriske behandling på PC3-celler i fravær eller nærvær af NAC (10 mM) og z-VAD-fmk (10 uM) blev evalueret som cellelevedygtighed efter 24 timers eksponering af cellerne for lægemidlerne (C), og fasekontrast mikrografier af cellen behandlet tilsvarende er afbildet (D); forstørrelse 200 ×, skala bar = 100 um. De viste data er middelværdier ± S.D. (N = 3), billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Symbolet “*” indikerer statistisk forskellige resultater for ubehandlet

vs

behandlet PC3 celler i fravær eller tilstedeværelse af NAC eller zVAD-FMK med p. 0,05

Det er tidligere rapporterede, at ROS-medieret DNA-skader udløser aktivering af PARP1 og efterfølgende celledød [24]. PARP1 aktivering genererer PAR polymer i kernen og det translokere til mitokondrier at mediere AIF frigivelse [20]. For at afklare forholdet mellem AIF og PARP1, vi evaluerede AIF frigivelse og PARP1 aktivitet i PC3 celler efter udsættelse for a-TOS, VK3 og AA på forskellige tidspunkter. AIF translokation til cytoplasmaet kunne påvises inden for 5 til 60 minutter af det kombinatoriske behandling af cellerne, og cytoplasmatisk frigivelse af AIF var samtidig med PARP1 aktivering. I modsætning hertil blev translokation af AIF til kernen forsinket med mindst 60 min (fig. 5A, B). Hæmning af PARP1 af 3ABA svækkede både AIF nuklear translokation (fig. 5C, D) og celledød induktion (fig. 6 E, F).

Panel A viser kinetik for AIF frigivelse og panel B aktivitet PARP1 i PC3 celler udsat for a-TOS (30 uM), VK3 (3 uM) og AA (0,4 mM). Panel C viser fluorescens mikrografier hjælp PARP1-FITC og AIF-TRITC (forstørrelse 600 ×, skala bar = 10 um) (venstre panel), og Western blot billeder (højre panel) af PARP1 og AIF translokation til kernen efter 180 min behandling med á-TOS + VK3 + AA i fravær eller nærvær af 3ABA (2 mM). (D) AIF band tæthed blev normaliseret til en-actin eller lamin og udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af AIF

cyto-AIF

Nucl /AIF

org densitometri ratio. (E) cytotoksiske virkning af den kombinatoriske behandling på PC3 celler i fravær eller nærvær af 3ABA blev evalueret som cellelevedygtighed efter 24 timers eksponering af cellerne for lægemidlerne. Panel F viser fasekontrast mikrografier af cellerne behandlet med de tre lægemidler med eller uden 3ABA; forstørrelse 200 ×, skala bar = 100 um. De viste data er middelværdier ± S.D. (N = 3), billederne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Symbolet “*” indikerer statistisk forskellige resultater for ubehandlet vs behandlede PC3 celler i fravær eller tilstedeværelse af 3-ABA med p 0,05

Behandling med α-TOS + VK3 + AA undertrykker tumor progression.

for at vurdere anti-cancer virkning af de tre lægemidler, Balb-c nøgne mus med PC3 xenotransplantater blev oralt behandlet med sub-toksiske doser af VK3 (3 mg /kg), AA (400 mg /kg), og med α-TOS (15 mg /kg) leveret intraperitonealt, og med kombinationerne VK3 + AA, eller α-TOS + VK3 + AA. En væsentlig inhibering af tumorvækst blev observeret i VK3 plus AA behandlingsgruppe; denne virkning blev væsentligt forbedret på længere tidspunkter af behandlingen, når de to agenter blev kombineret med α-TOS (fig. 6A). Det kombinatoriske terapi med de tre lægemidler inducerede DNA-streng break-dannelse (TUNEL positivitet), svarende til en apoptotisk proces, der var forbundet med nuklear AIF translokation (fig. 6B). Greater tumorcelledød områder blev fundet i mus udsat for tri-kombinatoriske terapi i forhold til ubehandlede mus (85 ± 16 × 10

3 um

2

vs

238 ± 45 × 10

3 um

2, henholdsvis

s

0,05). Denne behandling viste sig at udøve nogen påviselig side toksicitet, eftersom mus viste intet vægttab samt ingen tegn på cytotoksicitet i nyren og leveren som påvist ved histologisk evaluering og ved biokemiske analyser (data ikke vist).

(A) Balb-c nøgne mus med xenografter afledte PC3-celler blev behandlet med oral indtagelse af VK3 (3 mg /kg) andAA (400 mg /kg) og intraperitoneal injektion af en-TOS (15 mg /kg) alene eller i kombination, som indikeret, 5-gange om ugen, og tumorvolumen (mm

3) blev kvantificeret ved kalibre. (B) formalinfikserede, paraffinindstøbte tumor sektioner (5 um) blev inspiceret for TUNEL positivitet (grøn præget celler) (forstørrelse 200 ×, skala bar = 100 um) og blev immuno-farvet med anti-AIF IgG (hvide pile indikeret nukleare translokation af AIF-TRITC og pycnotic kerner opdages ved hjælp af DAPI); forstørrelse 400 ×, skala bar = 50 um. Data for tumor volumen er gennemsnit ± SEM (n = 8), blev der ikke fundet signifikante forskelle mellem kontrol mus og enlige lægemiddelbehandlede mus, hvorimod der ikke blev fundet signifikante forskelle mellem kontrol mus og VK3 + AA-behandlede dyr på dag 22-31 ( p = 0,034) og α-TOS + VK3 + AA-behandlede dyr på dag 43-49 (p = 0,043).

diskussion

Oral administration af AA og VK3 blev anvendt i behandlingen af ​​patienter med prostatacancer [25]. Denne fremgangsmåde var fordelagtig, når kombinationen lægemidlet blev co-administreret med kendte kemoterapeutiske midler [26]. Derfor co-administration af subletale doser af AA + VK3 (redox-aktive system) med redox-silent α-TOS resulterede i effektiv

in vitro

celledød. Kombinationen af ​​VK3 + AA blev vist synergistisk fremme produktion af hydrogenperoxid i det ekstracellulære miljø [12], [27].

I overensstemmelse med tidligere bemærkninger, fandt vi, at kombinationen af ​​VK3 + AA forårsagede hurtigt generation af både hydrogenperoxid (DCF fluorescens) og superoxid (DHE fluorescens), toppede ved 10-20 min og 30-60 minutter for eksponering af cellerne for de to lægemidler (

cf

fig. 1A). Som reaktion på denne oxidativt stress, cellerne aktiveret autophagic pathway. Dette fremgik af dannelsen af ​​nukleare blærer og autophagic vesikler (sure vakuolære organeller), samt øgede niveauer af LC3-II protein (

cf

Fig. 2A-C). Men efter 180 minutter af denne behandling, cellerne fuldstændigt inddrevet. Dette fremgår af DHE oxidation-induceret EtBr nuklear farvning, der dokumenterer, at den øgede indeks af blege celler observeret efter 60 minutter af behandling med VK3 + AA markant nedsat over længere tidsperioder (

cf

fig. 1B). Den autophagy inhibitor 3mA (tidlig autophagic proces) udløser VK3 + AA-induceret celledød indikerer, at autofagi er en beskyttende mekanisme i forbindelse med PC3-celler (

cf

fig. 2D). Disse resultater viser, at den tidlige oxidativt stress resulterer i et adaptivt respons af de kræftceller, der giver mulighed for deres udvinding fra insult. På den anden side, sub-apoptotiske doser af α-TOS inducerede en reduktion i ROS-dannelse udløst af VK3 + AA (

cf

fig. 1A). Hypotesen er, at hydrolysen af ​​α-TOS af esteraser i celler fører til dannelse af α-tocopherol (α-TOH), der fungerer som en ROS scavenger [28]. Som tidligere fundet [29], observerede vi, at ROS genereret i afhængighed af a-TOS består hovedsageligt af peroxid-relaterede arter, men ikke superoxid. I modsætning hertil blev α-TOS rapporteret at inducere superoxid produktion via interaktion med komplekset II i den mitokondriske respiratoriske kæde [30]. Vi kan ikke udelukke, at i vore eksperimentelle betingelser, sub-giftige doser ofα-TOS føre til generering af små mængder af superoxid, der hurtigt kan dismutated og opdaget.

Ingen dannelse af autophagosomes eller ændret morfologi organeller blev observeret i α-TOS- og VK3 + AA behandlede celler (

cf

fig. 2A-C). Dette linker reduktion af “adaptiv” tidlig oxidation stress med forhindring af autophagic proces induceret af kombinationen af ​​VK3 + AA alene, og er yderligere underbygget af TEM, afslører fravær af autophagosomes i celler behandlet ved kombinationen af ​​de tre lægemidler (

cf

fig. 2B). Hæmning af autophagy induceret byα-TOS fremmet udseende øget sub-sæt af lyse celler, dannelse af nukleare blærer og mitokondrie hævelse med uorganiseret cristae og nedsat elektron tæthed, alle funktioner i celledød. Derfor medtagelse af α-TOS i kombinatorisk behandling af PC3-celler inhiberer de adaptive mekanismer og overlevelse fører til induktionen af ​​deres død.

Induktion af autofagi er blevet rapporteret at fremme overlevelsen af ​​tumorceller og derved modvirke eller begrænse effekten af ​​celledød induktion med kemoterapeutiske midler, bringe resultatet af cancerbehandling [31]. Efter aftale med dette begreb, vores data viser en beskyttende rolle autophagy ved udsættelse af PC3 celler til VK3 og AA. Vi fandt, at de behandlede celler, som udviste morfologi minder om (autophagic) celledød, stort set kommet, og kun en mindre fraktion af cellerne med forstyrret mitokondrie transmembrane potentiale var udover rednings- og døde under disse betingelser.

det blev konstateret tidligere, at apoptose er forsinket i celler, der mangler de Bax og Bak-proteiner, der kræves til mitokondrisk ydre membran permeabilisering (MOMP), som er kendetegnende for apoptotisk celledød og en forudsætning for cellen at krydse “point of no tilbagesendelse “[32]. Det blev konstateret, at α-TOS inducerer translokation af Bax i mitokondrier i brystcancerceller [33] – [36]. En anden rapport dokumenteret α-TOS at fremkalde mitokondrie apoptose involverer de FoxO1-Noxa-Bak aksen [37], [38]. En AIF-medieret caspase-uafhængig indre vej via Bak er tidligere blevet beskrevet [39]. Den AIF opløselige fragment frigives fra mitokondrier upon ydre membran permeabilisering gennem Bax /Bak porer [40]. Vi viser, at AIF frigivelse fra mitokondrier er nødvendig for celledød fremkaldt af kombinatoriske behandling af prostata cancer celler med α-TOS + VK3 + AA på sub-toksiske doser af de enkelte agenter. Deaktivering AIF protein ved siRNA svækket død af PC3 celler induceret af den kombinatoriske behandling væsentligt (

cf

fig. 3).

ROS produktion spiller en central rolle i frigivelsen af ​​AIF og efterfølgende fremme af celledød. Vi dokumenterer, at denne forudsætning gælder for vores system, der viser, at ROS scavenger NAC fuldstændigt ophævet død PC3 celler udsat for kombinationen af ​​α-TOS + VK3 + AA (

cf

fig. 4). Vi dokumenterer endvidere, at PARP1 aktivering ROS-afhængige er forbundet med udgivelsen af ​​AIF fra mitokondrier til kernen (

cf

fig. 5). Som svar på DNA-skade, PARP1 katalyserer syntesen og overførsel af PAR-enheder til acceptoren proteiner, hvorved modulering af deres aktiviteter og regulering DNA-reparation [41], [42]. Men overdreven DNA skader aktiverer en unik PARP1-afhængig celledød program, som er caspase-uafhængig, men afhængig af AIF [43]. Selv om i mindre grad med hensyn til VK3 + AA, den α-TOS + VK3 + AA kombination induceret tidlig ROS-dannelse, som tidligere blev fundet at inducere tidlig DNA-beskadigelse [12]. Den ROS-induceret DNA-skader udløst en robust stigning i PARP1 aktivitet, hvilket resulterede i frigivelsen af ​​AIF fra mitokondrier til cytoplasmaet, og videre til kernen. Således, som sa konsekvens af PARP1 aktivering, AIF protein translokeres fra cytoplasmaet til kernen, hvilket resulterer i induktionen af ​​chromatinkondensering med deraf følgende celledød (

cf

fig. 5).

andre har observeret, at høje doser af AA induceret autophagy i prostatacancerceller, som ikke genindvinde og har forpligtet sig til at dø [10], [44]. Forskellige doser af lægemidler udøver forskellige virkninger på celler ved at producere varierende mængder af ROS. Baseret på ROS fornærmelse, cellerne forskelligt reagere ved induktionen af ​​deres overlevelse eller død program. Her sub-toksiske doser af VK3 + AA inducerede en ROS fornærmelse ikke er i stand til at udløse celledød, men forårsager skade af cellulære organeller med efterfølgende aktivering af overlevelse autophagic processen. Tilstedeværelsen af ​​α-TOS reducerede VK3 + AA-induceret oxidativ insult, og dermed hæmme den cellulære overlevelse respons. Men ROS blev dannet, blev, tilstrækkelig til at inducere PARP1 aktivering resulterer i AIF frigivelse og efterfølgende celledød.

I betragtning af den mulige anti-cancer aktivitet af de tre midler, virkningen af ​​kombinationen af ​​α-TOS + VK3 + AA på tumorvækst blev undersøgt i nøgne mus. Oral indgivelse af blandingen af ​​VK3 + AA reduceret signifikant tumorvækst på dag 22-31 (p = 0,034). Nr TUNEL positivitet blev fundet i dele af VK3 + AA-behandlede tumorer, hvilket antyder, at reduktion i tumorstørrelsen induceret af VK3 + AA skyldtes tumorvækst inhibering snarere end celledød (

cf

Fig 6A). Dette bekræftes af, at der på længere tid af eksponering stof (dag 35-49) tumorer igen begyndt at vokse. Behandling med α-TOS + VK3 + AA signifikant hæmmede tumorvækst (dag 43-49, p = 0,04), inducerer store områder af celledød i forbindelse med AIF nukleare translokation sammenlignet med kontroldyr og dem behandlet med de enkelte lægemidler (

cf

fig. 6A, B). Især den anti-tumor effekt af α-TOS + VK3 + AA kombination blev associeret med ingen tegn på sekundære skadelige virkninger. Disse resultater understøtter

in vitro

data, der viser, at α-TOS hæmmer kræft celle genopretning og overlevelse efter VK3 + AA behandling, overtalelse effektiv celledød ved længere perioder med eksponering for kombinationen af ​​de tre agenter.

konklusioner

Mange faktorer såsom tumor vaskularisering og kræft celle optagelse påvirker narkotika koncentrationer inden tumor masse. Derfor ved tumor-niveau, kunne de anti-cancerlægemidler være ikke på aflivning niveau, selv når administreres i høje koncentrationer. I stedet for at inducere celledød, lave niveauer af anticancerlægemidler kan føre til et adaptivt respons fører cancercellerne at formere sig. Her fandt vi, at den adaptive cellulære respons på oxidativ stress induceret af redox-aktive system VK3 + AA blev overvundet ved kombination med redox-silent middel α-TOS, som forårsagede et skifte fra autophagic overlevelse til celledød (Fig . 7). Eftersom serumniveauer af anti-cancer agenter var under detektionsgrænsen, blev deres farmakokinetik ikke evalueret, derfor den effektive koncentration af de midler, der kunne resultere i kliniske omgivelser er ikke præcist kendt. I klinisk praksis kan lave doser af AA og VK3 nemt opnås ved oral indgivelse. Da α-TOS fuldstændigt omdannes til den ineffektive α-tocopherol efter oral applikation, intravenøs eller transdermal administration repræsenterer en plausibel måde til at nå sine farmakologiske niveauer og anti-cancer virkning. Uanset kliniske midler til administration, som endnu skal testes, denne betænkning viser den potentielle anvendelse af målrettede narkotika kombination til behandling af prostatacancer.

AA kombination VK3 + inducerer ROS-dannelse (i), til