PLoS ONE: Prostata stromacellers Express progesteron receptor til bekæmpelse af kræft Cell Mobility

Abstrakt

Baggrund

Gensidige interaktioner mellem epitel og stroma spiller afgørende roller for prostatakræft udvikling og progression. Forbedrede sekreter af cytokiner og vækstfaktorer ved cancer associerede fibroblaster i prostata tumorer skabe en gunstig mikromiljø for kræftceller til at vokse og metastaserer. Vores tidligere arbejde viste, at progesteronreceptoren (PR) blev udtrykt specifikt i prostata stromale fibroblaster og glatte muskelceller. Imidlertid er ekspressionsniveauer af PR og dens konsekvenser for tumormikromiljøet i prostatatumorer dårligt forstået.

Metoder

Immunhistokemi assays anvendes til humane prostata vævsbiopsier. Cellemigrering, invasion og proliferationsassays udføres under anvendelse af humane prostata celler. Real-time PCR og ELISA anvendes til at måle genekspression på molekylært niveau.

Resultater

Immunhistokemi assays viste, at PR proteinniveauer var nedsat i cancer associeret stroma sammenlignet med parrede normale prostata stroma. Brug

in vitro

prostata stromale celle modeller, viste vi, at konditionerede medier indsamlet fra PR-positive stromale celler hæmmede prostatakræft celle migration og invasion, men havde mindre undertrykkende virkninger på kræft celleproliferation. PR undertrykt sekretion af stromal afledt faktor-1 (SDF-1) og interleukin-6 (IL-6) ved stromale celler uafhængig til PR ligander. Blokering PR-ekspression ved siRNA eller supplering af eksogent SDF-1 eller IL-6 til konditionerede medier fra PR-positive stromaceller modvirket de inhiberende virkninger af PR til kræft cellemigration og invasion.

Konklusioner Salg

nedsat ekspression af PR i cancer associeret stroma kan bidrage til forhøjede SDF-1 og IL-6-niveauer i prostatatumorer og forbedre prostata tumor progression

Henvisning:. Yu Y, Lee JS, Xie N, Li E , Hurtado-Coll A, Fazli L, et al. (2014) Prostate stromacellers Express progesteron receptor til bekæmpelse af kræft Cell Mobility. PLoS ONE 9 (3): e92714. doi: 10,1371 /journal.pone.0092714

Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: December 1, 2013; Accepteret: 24. februar, 2014 Udgivet: Marts 24, 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af canadiske Institutes of Health Research driftstilskud (MOP- 97.934), Rising Star Award og Discovery Grant fra prostatakræft Canada til XSD og PNW Prostata Cancer SPORE pilot tilskud til XSD og MG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatatumorer har flere cellepopulationer. Kræftceller er omgivet af ikke-epitel cellulære miljø bestående af fibroblaster, glatte muskelceller og myofibroblaster. Akkumulerede beviser viser, at gensidige epitel-stroma interaktioner er kritisk for tumor udvikling, vækst og metastase [1], [2]. For eksempel benign prostatahyperplasi epitelcellelinie BPH-1 er normalt ikke-tumorigene i nøgne mus. Men når de kombineres med carcinom forbundet fibroblaster (CAF) og transplanteret ind nyrekapslen BPH-1-celler dannede tumorer [3]. Disse resultater viser, at stromale celler spiller afgørende roller i malign transformation. Gennem secernerende cytokiner og vækstfaktorer, CAF giver også en støttende mikromiljø at lette tumorvækst, invasion og metastase [4], [5]. Trods disse kritiske roller stroma i prostatacancer (PSA), den terapeutiske strategi målretning prostata stroma er meget under værdsat. Dette afspejler vores begrænsede viden om stroma-epitel interaktioner ved de cellulære og molekylære niveau.

Det er kendt, at kræft er forbundet stroma øger udskillelsen af ​​flere cytokiner, som er vigtige komponenter i tumor mikromiljø [6]. Stromacelle afledt faktor-1 (SDF-1) udskilles af stromale fibroblaster og virker ved binding til dets receptor, CXCR4, på membranen af ​​epitelceller til at udløse flere signalveje [7] – [10]. SDF-1 /CXCR4 akse har vist sig at lette cancercelleinvasion, tumorangiogenese [11], [12], stimulere celleproliferation [13], [14] og beskytte celler mod kemoterapeutisk lægemiddel-induceret apoptose [15] – [ ,,,0],17]. SDF-1 mRNA niveauer øges i kræft væv sammenlignet med tilstødende godartede væv [18], og er de højeste i metastatisk PCa [19]. Desuden er CXCR4 udtryk også forhøjet i PCA væv [19], hvilket yderligere forstærker handlinger SDF-1. Interleukin 6 (IL-6) er også en vigtig cytokin, der kan stimulere de Janus kinaser /Signal Transducer og Activator Transskription 3 vej i cancerceller [20]. Både SDF-1 og IL-6 kan aktivere androgen receptor (AR) ved lave niveauer af androgener i PCA-celler og bidrage til tumorudvikling til kastrationsresistent fase [21] – [23]. IL-6 blev rapporteret at forbedre PCa celleproliferation og beskytte celler mod apoptose i tumorxenotransplantater [24], [25]. Forhøjet serum IL-6-niveauer blev også påvist at være en dårlig prognose markør [26], [27].

Prostata stromale celler udtrykker også flere steroidreceptorer herunder androgen og østrogen-receptorer. Disse receptorer blev rapporteret at være vigtigt for stromaceller til direkte PCa udvikling gennem modulering ekspression af cytokiner /chemokiner [28] – [30]. Vi har for nylig rapporteret, at begge progesteronreceptoren (PR) isoformer, PRA og PRB, blev udtrykt specifikt i prostata stroma og reguleres negativt stromal celle proliferation [31]. I denne undersøgelse har vi udvidet vores indsats for at måle PR protein niveauer i PCa og PR-regulering af SDF-1 og IL-6-ekspression i prostata stromale celler.

Materialer og Metoder

Menneskelige Prostata væv og Immunhistokemi

Tyve-syv hele mount sektioner af humane prostata væv biopsier blev opnået fra radikale prostatektomi. Detaljerede oplysninger om hver vævsprøve blev opført i tabel 1. Alle patienter underskrev et informeret samtykke til en protokol, der blev revideret og godkendt af UBC Clinical Research Ethics Board (Certificate #: H09-01628). Immunhistokemisk (IHC) analyser blev udført ved hjælp af Ventana Discovery XT autostaineren (Ventana Medical Systems) med antistoffer mod PR (ABCAM) og PRB (Cell Signaling) som rapporteret [31]. Digitale billeder af væv slides blev scannet af en BLISS scanner-system (Bacus Lab Inc). Inden for de perifere zoner, 5 stromale felter ( 1000 kerner) blev valgt af patolog (L. F.) støder op til godartede epitelceller og 5 andre stromale områder var fra tilstødende kræft epitelceller. Fem andre stromale områder var fra overgangszoner. De patologiske scorer blev opnået ved softwaren Digital Image Hub (Leica Biosystem) til at beregne procentdelen af ​​farvede kerner og farvningsintensitet. De relative niveauer af PR og PRB blev beregnet som indekset for HScore = Σpi (i + 1), hvor i = intensiteten af ​​farvning, og pi = procent farvede celler. HSCOREs blev anvendt til at sammenligne PR og PRB niveauer mellem normal og cancer stroma og mellem perifere zoner og overgangszoner.

Prostata stromacellelinier

Menneskelig prostata stromacellelinje (WPMY-1 ) og PCA cellelinier LNCaP og PC-3 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). LNCaP afledte C4-2B celler blev købt fra Urocore (Oklahoma City, OK, USA). LNCaP, C4-2B og PC-3 celler udtrykker ikke-detekterbare niveauer af PR mRNA og protein. Humane cancer associeret fibroblaster (hCAFs) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Simon Hayward (Vanderbilt University). De blev afledt af humane primære dyrkede cancerassocierede fibroblaster [2]. Humane primære prostata stromale celler, HPS-19i blev generøst tilvejebragt af Dr. David Rowley (Baylor College of Medicine) [4]. Eksogent PRA og PRB blev indført i WPMY-1, hCAF og HPS-19i ved lentivirus som beskrevet [31]. Protein-ekspressionsniveauer samt cellulær lokalisering af PRA og PRB blev bekræftet (figur S1). Alle forsøg med hCAFs var inden for 8-10 celle passager og HPS-19i celler inden for 5-6 passager på modtaget fra leverandører.

Kvantitative Real-Time PCR

Samlet RNA blev ekstraheret ved hjælp Trizaol (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. To mikrogram totalt RNA blev udsat for et vilkårligt primet revers transkription under anvendelse SuperScritpt 2 revers transkriptase (Invitrogen). Real-time PCR blev udført i triplikater under anvendelse Applied Biosystem 7900 HT med 5 ng cDNA, 1 uM af hver primer par og SYBR Green PCR Master Mix (Roche). Primersekvenserne blev anført i tabel S1. Relative mRNA niveauer blev normaliseret til GAPDH. SiRNA målrettet PR blev købt fra Thermo Fisher (Cat N. J-003433-08-0005).

Indsamling af konditioneret medium

Halvfems procent sammenflydende hCAFs, WPMY-1 og HPS-19i stromale cellerne blev vasket to gange med PBS-buffer og tilført serumfrit DMEM-medium i nærvær af køretøjet, P4 eller PR-antagonist RU486 i 48 timer. Proteinkoncentrationer af konditionerede medier (CM) blev målt ved bicinchoninsyre-assay (Thermo Scientific). Den samme mængde CM fra PR positive og negative celler blev anvendt til at behandle PCA celler til celle migration, invasion og proliferationsassays.

ELISA assay

SDF-1 og IL-6 koncentrationer i CM blev målt ved kommercielt ELISA-kit efter fabrikantens protokol (R 0,05 som *, P 0,01 som ** og P 0,001 som *** .

Resultater

PR protein niveauer er faldet i prostata tumorer

Vi har samlet 27 hele mount sektioner af menneskelig prostata væv biopsier fra patienter behandlet med radikal prostatektomi (tabel 1) . Patienterne er 46 til 88 år i alder, med Gleason score fra 6 til 9 og tumor stadier lige fra T2A til T3B. Brug af IHC assays, blev både total PR og PRB isoformer detekteres i kerner af en del af prostata stromale celler (fig.1A-B). Imidlertid HScore af PR (kombineret beregning af intensitet og percentil af positive kerner) blev 41% lavere (P = 0,001) i cancer associeret stroma sammenlignet med parrede normale stroma i prostata perifere zoner (Fig.1C). Desuden HScore af PRB i cancer associeret stroma var ca. 44% lavere end den normale stroma (P = 0,004) (Fig.1D). I øjeblikket er der ingen specifikke antistof til påvisning PRA isoform. I betragtning af, at både total PR og PRB fald i lignende grader, er det sandsynligt, at de PRA ekspressionsniveauerne følger samme tendens som PRB. Der var ingen signifikante forskelle i enten PR eller PRB HScore mellem godartede perifere zoner og overgangszoner (Fig.1C-D). Der var ingen statistiske forskelle af de samlede PR eller PRB protein niveauer i forbindelse med Gleason score og serum PSA koncentrationer blandt disse 27 patienter. Sammen disse resultater viste, at PR-niveauer blev nedsat i cancer associeret stroma.

Hele mount sektioner af humane prostata biopsier (n = 27) blev immunfarvet med PR-antistof (ABCAM) eller PRB antistof (Cell Signaling). Repræsentative IHC billeder af PR (A) og PRB (B) fra godartede perifere zoner, kræft perifere zoner og overgangszoner vises. IHC farvning af PR (C) og PRB (D) protein niveauer i parret godartet

vs

kræft perifere zoner og i parrede godartet perifere

vs

overgangszoner fra 27 hele mount sektioner af humane prostata biopsier blev scoret af Digital Image Hub (Leica Biosystem). HScore indekser blev plottet som ± SE. En-vejs ANOVA og parret t-test beregne signifikansniveau.

Stromal PR hæmmer PCa celle migration og invasion

For at studere PR funktioner på celleniveau, vi har anvendt flere humane prostata-stromale celle modeller, herunder hCAFs, WPMY-1 og HPS-19i. Disse celler udtrykker lave niveauer af PR-mRNA, men detekterbare niveauer af PR-protein. Vi introducerede exogene PRA eller PRB isoform i disse celler ved lentiviral tilgang som rapporteret [31], som tillod os at studere funktionen af ​​hver PR isoform. Selvom WPMY-1-celler er afledt af primære dyrkede stromaceller fra benigne prostatahyperplasi væv, er disse celler immortaliseres med SV40 large-T-antigen. De har samme tumorigen egenskab hCAFs, når rekombineret med BPH-1-celler og podet under musen renal kapsel (upublicerede data).

For at fastslå virkningen af ​​PR i stromale celler på PCa cellemigration, vi udførte sårheling assays. CM indsamlet fra PR-positive og PR-negative hCAFs og WPMY-1-celler i nærvær af køretøjet eller 10 nM P4 blev anvendt til at inkubere med PC-3-celler. Sårheling analyser viste, at CM fra PR positive celler resulterede i signifikant nedsat celle migration (2A-B). P4 behandling til stromaceller ikke havde nogen indvirkning på migrationen på PC-3 celler. 2A-B udviste repræsentative billeder fra en af ​​tre uafhængige forsøg. Vi havde også udført celle migration assays til yderligere at bekræfte ligand-uafhængig virkning af PR i at kontrollere kræft celle migration. PR positive WPMY-1-celler blev behandlet med stigende doser af P4, og deres CM blev opsamlet og inkuberet med PC-3-celler i celle migration assays (2C). Vi observerede, at P4 ikke havde nogen indvirkning på PC-3 celle migration sats, heller ikke PR-antagonist RU486 (Fig.2D). Disse resultater var gentagelig når vi udskiftet PC-3 celler med knogle metastatisk LNCaP-afledte C4-2B celler (Fig.2E-F).

Konditionerede medier (CM) blev indsamlet fra forældrenes hCAFs, WPMY-1 eller deres afledte cellelinier, som udtrykker mock, PRA eller PRB i nærvær af køretøjet eller 10 nM P4. PC-3-celler blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet med CM fra hCAFs (A) eller fra WPMY-1 (B) celler i 24 timer ved sårheling assays. Repræsentative billeder efter 24 timer CM behandling blev erobret af et inverteret mikroskop. WPMY-1 og dens afledte cellelinier, der udtrykker mock, PRA eller PRB blev behandlet med 0, 10 nM og 100 nM af P4 i 24 timer (C og E) eller med bærer, 10 nM P4 og /eller 10 uM af RU486 for 24 timer (D og F). CM blev derefter opsamlet og inkuberes med PC-3-celler (C-D) og C4-2B (E-F) i celle migration assays som beskrevet i materialer og metoder sektion. En-vejs ANOVA og parret t-test beregne den statistiske signifikans sat til P 0,05 som * og P. 0,001 som ***

For at fastslå virkningen af ​​PR i stromale celler på PCa celle invasion, vi anvendte Matrigel invasion assays. CM blev indsamlet fra PR-positive og PR-negative WPMY-1 celler behandlet med køretøjet, 10 nM eller 100 nM P4 (Fig.3A). Vi observerede, at CM indsamlet fra PR-positive WPMY-1-celler resulterede i 50-75% af faldet i PC-3 celleinvasion. Denne PR-funktion blev ikke ændret ved P4 eller RU486 (Fig.3A-B). Derudover blev også observeret lignende resultater, når C4-2B celle blev anvendt i Matrigel invasion assays (Fig.3C-D). Desuden gentog vi også forsøgene med CM indsamlet fra to andre prostata stromale celler, hCAFs og HPS-19i. Vi viste, at CM fra PR positive hCAFs eller HPS-19i celler resulterede i ~20-30% af faldet i PC-3 celle invasion, som PR-funktion var også uafhængig til P4 (Fig.3E-F). Tilsammen viste disse resultater, at PR besad suppressive funktion til PCa cellemigrering og invasion i en ligand-uafhængig måde.

WPMY-1 og dens afledte cellelinier, der udtrykker mock blev PRA eller PRB behandlet med 0, 10 nM og 100 nM af P4 i 24 timer (A og C) eller med bærer, 10 nM P4 og /eller 10 uM af RU486 i 24 timer (B og D). CM blev derefter opsamlet og inkuberet med PC-3 (A-B) og C4-2B (C-D) celler i celleinvasion assays. hCAFs (E), HPS-19i (F) celler og afledte cellelinier, der udtrykker mock, PRA eller PRB blev behandlet med 0, 10 nM og 100 nM af P4 i 24 timer. CM blev derefter opsamlet og inkuberet med PC-3-celler i celleinvasion assays. Cell invasion blev beregnet som beskrevet i Materiale og metode afsnittet. En-vejs ANOVA og parret t-test beregner statistisk signifikans sat til P 0,05 som * og P 0,001 som ***

For at undersøge betydningen af ​​stromale PR på PCa cellevækst

in vitro

udførte vi celleproliferationsassays (figur S2). LNCaP-celler udtrykker en mutant AR, der kan stimuleres af P4. Behandling LNCaP-celler direkte med P4 i dyrkningsmedium resulterede i 3 gange induktion af celleproliferation. CM indsamlet fra PR positive hCAFs i fravær af P4 havde statistisk signifikante, men meget milde hæmmende virkning på LNCaP cellevækst. Ligeledes blev milde undertrykkende effekter også observeret, når du bruger CM indsamlet fra PR positive WPMY-1 celler i tilstedeværelse af P4.

PR undertrykker SDF-1 og IL-6-ekspression i prostata stromaceller

Da PR protein-niveau er faldet i cancer associeret stroma og CM fra PR-positive stromale celler hæmmer PCa celleinvasion og migration

in vitro

, vi hypotesen, at PR kan fungere til at undertrykke sekretoriske faktorer syntetiseret af stromale celler og regulere prostata epitel i en parakrin måde. For at teste denne hypotese, vi menneskerettighedsinitiativer gen microarray data profilering PR regulerede gener i prostata stromaceller [31]. Ved at stratificere alle cytokiner og vækstfaktorer, der er konstateret vi SDF-1 og IL-6 som de højest rangerede gener, hvis mRNA-niveauer blev inhiberet af PR. For at bekræfte disse resultater, udførte vi realtids-PCR og viste, at PRA inhiberede 70%, mens PRB inhiberede 80% af SDF-1-mRNA-niveau i hCAFs (fig. 4A-B). Denne PR handling var ligand uafhængig, da hverken P4 eller RU486 haft nogen indflydelse på PR undertrykkelse til SDF-1 mRNA-niveauer. Vigtigere, undertrykt SDF-1-mRNA-niveauer efter PR resulterede i nedsat SDF-1-sekretion af prostata stromale celler, når målt ved ELISA (Fig.4C). Endvidere blev PR inhiberende virkning på SDF-1-ekspression observeret ikke kun i hCAFs, men også i WPMY-1 (Fig.4D-E) og HPS-19i celler (Fig.4F). Vi har også observeret lignende inhibitoriske virkninger af PR til IL-6-mRNA og protein niveauer i et ligand-uafhængig måde (fig.5). Det er vigtigt at blive bemærket, at PR ikke frembyder en generel undertrykkende effekt til alle cytokiner eller vækstfaktorer. Adskillige vækstfaktorer herunder bFGF, HGF, VEGF og KGF er enten opreguleret eller ikke ændret af PR og /eller P4 behandling (Figur S3).

hCAFs og deres afledte cellelinjer, der udtrykker mock, PRA eller PRB var behandlet med bærer, 1 (A) eller vehikel, 10 nM P4 og /eller 10 uM af RU486 (B) i 24 timer. Real-time PCR måles mRNA-niveauer af SDF-1 i forhold til GAPDH. (C) hCAFs og afledte cellelinier, der udtrykker mock blev PRA eller PRB behandlet med vehikel eller 10 nM P4 i 24 timer. CM blev opsamlet og anvendt til at måle SDF-1 proteinniveauer ved ELISA. WPMY-1 og dens afledte cellelinier, der udtrykker mock, PRA eller PRB blev behandlet med bærer, 1 nM, 10 nM og 100 nM af P4 (D) eller vehikel, 10 nM P4 og /eller 10 uM af RU486 (E) for 24 timer. Real-time PCR måles mRNA-niveauer af SDF-1 i forhold til GAPDH. (F) HPS-19i-celler og afledte celler, der udtrykker mock blev PRA eller PRB behandlet med vehikel eller 10 nM P4 i 24 timer. Real-time PCR måles mRNA-niveauer af SDF-1 i forhold til GAPDH. En-vejs ANOVA efterfulgt af t-test beregner betydningen sat til P 0,01 som * og P. 0,001 som ***

hCAFs og deres afledte celler, der udtrykker mock, PRA eller PRB blev behandlet med bærer, 1 (A) eller vehikel, 10 nM P4 og /eller 10 uM af RU486 (B) i 24 timer. Real-time PCR måles mRNA niveauer af IL-6 i forhold til GAPDH. (C) hCAFs og afledte celler, der udtrykker mock blev PRA eller PRB behandlet med vehikel eller 10 nM P4 i 24 timer. CM blev opsamlet og anvendt til at måle IL-6 proteinniveauer ved ELISA. WPMY-1-celler og afledte celler, der udtrykker mock blev PRA eller PRB behandlet med vehikel, 1 nM, 10 nM og 100 nM af P4 (D) eller vehikel, 10 nM P4 og /eller 10 uM af RU486 (E) for 24 timer. Real-time PCR måles mRNA niveauer af IL-6 i forhold til GAPDH. (F) HPS-19i-celler og afledte celler, der udtrykker mock blev PRA eller PRB behandlet med vehikel eller 10 nM P4 i 24 timer. Real-time PCR måles mRNA niveauer af IL-6 i forhold til GAPDH. En-vejs ANOVA og t-test beregnet betydningen sæt med P 0,01 som * og P. 0,001 som ***

For at bekræfte PR medieret direkte hæmning til SDF-1 og IL 6-genekspression, vi forbigående transficeret prostata stromaceller med siRNA mod PR (Fig.6A-B). Akut PR knockdown dramatisk vendt de inhiberende virkninger af PR til begge SDF-1 og IL-6-mRNA-niveauer. Desuden PR udøvede sin inhibitoriske virkninger direkte til SDF-1 og IL-6 gentranskription og krævede ikke andet protein syntese, som PR forblev undertrykkende selv i nærvær af cycloheximid behandling (Fig.6C-D). Vi udførte også kromatin immunpræcipitationsassay at vise, at histonacetylering niveauer på SDF-1-promotorområdet blev dramatisk reduceret i PR-positive stromaceller. Disse ændringer var i modsætning til histonacetylering status ved GAPDH-promotoren (Fig.6E). Tilsammen understøtter disse resultater, at PR spiller en direkte rolle i at undertrykke promotoraktiviteter af SDF-1 og IL-6-gener og hæmme gentranskription.

WPMY-1-celler, der udtrykker mock, PRA eller PRB blev transient transficeret med kontrol siRNA eller siRNA mod PR. SDF-1 (A) og IL-6 (B) mRNA-niveauer i forhold til GAPDH blev målt ved real-time PCR. hCAFs udtrykker mock blev PRA eller PRB isoform behandlet med enten kontrol eller 20 ug /ml cycloheximid i 16 timer. Real-time PCR-assays måles mRNA-niveauer af SDF-1 (C) og IL-6 (D) i forhold til GAPDH. (E) WPMY-1-celler og afledte celler, der udtrykker mock blev PRA eller PRB behandlet med vehikel eller 10 nM P4 i 24 timer. Chromatin immunopræcipitationsanalyser blev udført ved anvendelse acetyl-histon 3-antistof. Eluerede DNA-fragmenter blev underkastet måling af berigelse af acetyl-Histon 3 niveauer i SDF-1 og GAPDH promotorregioner. En-vejs ANOVA og t-test beregnet betydningen sæt med P 0,01 som * og P 0,001 som ***

For at vise, at PR-medieret undertrykkelse af SDF-1. og IL-6-ekspression er den vigtigste mekanisme, der reducerer PCa celleinvasion og migration kapacitet, har vi transient slået ned PR-ekspression og observerede migrationen og invasion satser af PC-3 (Fig.7A-C) og C4-2B (fig. 7B-D) celler blev udvundet. Hertil kommer, når rekombinant SDF-1 eller IL-6-peptid blev tilsat til CM, observerede vi, at exogent SDF-1 eller IL-6 afskaffet PR undertrykkende virkninger til PC-3 celleinvasion (Fig.7E). Tilsammen understøtter disse resultater, at PR-medieret suppression til PCa celle mobilitet er hovedsagelig gennem inhibering SDF-1 og IL-6-genekspression.

WPMY-1-celler, der udtrykker mock, PRA eller PRB blev transient transficeret med kontrol siRNA eller siRNA mod PR i 24 timer. Celler blev vasket to gange med PBS-buffer og genopfyldes med serumfrit DMEM-medium i 48 timer. CM blev opsamlet og inkuberet med PC-3 (A og C) eller C4-2B (B og D) celler for cellemigration assays (A og B) og Matrigel invasion assays (C og D) som beskrevet i Materiale og metode sektion. (E) CM blev opsamlet fra hCAFs i nærvær af køretøjet eller 10 nM P4 og derefter blandet med køretøjer, 10 ng /ml af SDF-1 eller 10 ng /ml IL-6 og inkuberet med PC-3-celler i Matrigel invasion assays. En-vejs ANOVA og parret t-test beregne signifikansniveau sat til P 0,05 som * og P 0,001 som ***

Diskussion

Vores undersøgelser viser. at PR-proteinniveauer er nedsat hos cancer associeret stroma og at PR udøver inhiberende virkninger PCA celle mobilitet gennem modulering af ekspressionen af ​​to vigtige cytokiner, SDF-1 og IL-6. Disse observationer tyder på, at reduceret PR udtryk i kræft associeret stroma ændrer afbalanceret prostata mikromiljø, som kan bidrage til PCa celle invasion og metastase.

Den iagttagelse, at faldet PR udtryk i kræft forbundet stroma svarer til hvad der blev rapporteret med andre steroid receptorer, såsom AR og eR-β [34] – [36], hvilket tyder på et generelt princip, der kan kræves tab af steroid receptorer for prostata stroma skal genaktiveres og opbygge et støttende mikromiljø for PSA. I begunstige denne hypotese blev stromale AR vist at undertrykke PCa celledeling og invasion [37]. ER-β-agonist forbedret apoptose af prostata stromale og epiteliale celler i aromatase knock-out-mus [38]. Selvom PR og AR deler høj homologi i deres DNA-bindende domæner, har gen microarray undersøgelser viste forskellige gen profiler reguleret af disse to receptorer [31], [39]. Endvidere PR udtrykt som to store isoformer med identisk DNA-bindende domæner. Men de regulerer forskellige transkriptom. En forklaring kan være, at PR udøver sin transkriptionsaktivitet gennem protein interaktioner med andre transkriptionelle faktorer [40], [41].

Den mekanisme, hvorved PR ekspressionsniveauerne er faldet i PCA celler er ukendt. Både intensiteten af ​​PR farvning og percentil af PR positive kerner er lavere i PCA væv. Eftersom ikke alle prostata stromale celler udtrykker PR, er det uklart, om PR negative stromale celle population bliver dominerende, eller om PR positive celler miste sin udtryk under tumorprogression. Vores tidligere arbejde viste, at PR positive stromaceller prolifererede meget langsommere end PR negative celler [31]. Dog kunne det også være muligt, at kræftceller kan udøve parakrine påvirkninger at genaktivere prostata stromale celler ved undertrykke deres PR udtryk. Disse muligheder er ikke eksklusivt til hinanden og kan sameksistere under udvikling af kræft.

Vores IHC analyser blev anvendt på hele mount dele af prostata biopsier, snarere end væv microarray (TMA), til at måle stromale proteinmarkører. Den heterogenitet prostata stroma kræver flere områder per patient dias, der skal analyseres ved patolog. Dette er et afgørende standard, ikke kan opfyldes, hvis du bruger TMA. På grund af de små størrelser af vævet kerner på TMAs, er det teknisk vanskeligt at fange repræsentative parret godartet og kræft forbundet stroma og udfører patologisk sammenligning analyser.

ligand-uafhængige virkninger af PR på gentranskription blev rapporteret i flere undersøgelser [42], [43]. Både ligand og ikke ligandholdigt PR kan være placeret i cellekernen, men i forskellige sub-nukleare rum [44], [45]. Posttranslationelle modifikationer såsom phosphorylering eller sumoylation også bidrage til PR-aktivering i fraværet af progestin [46]. Interessant nok er det blevet nylig rapporteret, at AR regulerer c-myc ekspression ligand-uafhængigt, hvilket bidrager til kastrationsresistent progression af PCa [47]. Disse opdagelser sammen tyder på, at der kan være en bredere vifte af gener, hvis ekspression reguleres af steroidreceptorer uafhængig til ligander.