Abstrakt
Telomerase er nødvendig for ubegrænset levetid af kræftceller. Langt størstedelen af pancreas-adenocarcinomer overudtrykke telomeraseaktivitet og blokering telomerase kan begrænse deres levetid. GRN163L (Imetelstat) er et lipid-konjugeret N3 ‘→ P5’ thio-phosphoramidat oligonukleotid, der blokerer skabelonen region af telomerase. Formålet med denne undersøgelse var at definere virkningerne af langvarig GRN163L eksponering på vedligeholdelsen af telomerer og levetid af pankreatiske cancerceller. Telomer størrelse, telomeraseaktivitet, og telomerase inhibering reaktion på GRN163L blev målt i et panel af 10 pancreas cancercellelinier. De cellelinjer udviste store forskelle i telomerase-aktivitet (46-fold variation), men de fleste linier havde meget korte telomerer (2-3 kb i størrelse). GRN163L hæmmede telomerase i alle 10 bugspytkirtelkræft cellelinjer, med IC
50 fra 50 nM til 200 nM. Kontinuerlig GRN163L eksponering af CAPAN1 (IC
50 = 75 nM) og CD18-celler (IC
50 = 204 nM) resulterede i en initial hurtig afkortning af telomerer efterfulgt af opretholdelse af ekstremt korte, men stabile telomerer. Kontinuerlig eksponering for lægemidlet til sidst førte til krisen og til et fuldstændigt tab af levedygtighed efter 47 (CAPAN1) og 69 (CD18) fordoblinger. Krise I disse celler blev ledsaget af aktivering af en DNA-skade respons (γ-H2AX) og dokumentation for både ældning (SA-β-galactosidase aktivitet) og apoptose (sub-G1 DNA-indhold, PARP spaltning). Fjernelse af lægemidlet efter lang tids GRN163L eksponering førte til en reaktivering af telomerase og re-forlængelse af telomerer i den tredje uge af dyrkning uden GRN163L. Disse resultater viser, at levetiden for bugspytkirtelkræftceller kan begrænses ved kontinuerlig telomerase inhibering. Disse resultater bør lette udformningen af fremtidige kliniske forsøg med GRN163L i patienter med kræft i bugspytkirtlen
Henvisning:. Burchett KM, Yan Y, Ouellette MM (2014) telomeraseinhibitor Imetelstat (GRN163L) begrænser Levetid for Human kræft i bugspytkirtlen celler. PLoS ONE 9 (1): e85155. doi: 10,1371 /journal.pone.0085155
Redaktør: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, USA
Modtaget: Juli 19, 2013; Accepteret: November 23, 2013; Udgivet: 7 Jan 2014
Copyright: © 2014 Burchett et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en National Cancer Institute (NCI) SPORE tilskud (P50 CA127297) og NCI træning tilskud (T32 CA09476). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. GRN163L og uoverensstemmende oligo blev leveret gratis af Geron Corp (Menlo Park, CA). Forfatterne ønsker at udtrykke deres taknemmelighed for rådgivning, feedback og yderligere reagenser leveres til dem af Sergei Gryaznov, Robert Tressler, Ning Go og Katia Bassett fra Geron Corp. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker for deling data og materialer.
Introduktion
kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i den vestlige verden. Kræft i bugspytkirtlen er en sygdom i snigende progression og høj dødelighed, med en 5-års overlevelse på kun 6%. I USA alene, forventes en anslået 43,920 patienter at blive diagnosticeret med sygdommen i 2012 og forventes 37,390 patienter at dø af det [1]. Langt de fleste af disse sager er pancreas ductusceller adenocarcinomer, der udvikler sig i kanalerne i bugspytkirtlen. Disse meget invasive tumorer består af en rigelig desmoplastiske stroma, med indlagte maligne cancerceller, der udtrykker markører for pankreatiske duktale celler [2], [3]. For patienter med pancreatisk ductal adenocarcinom, den eneste helbredende mulighed er kirurgi [3]. Den normale procedure er en pancreaticoduodenectomy (eller Whipple procedure), en kirurgisk operation, der fjerner lederen af bugspytkirtlen, men skåner resterende væv. Desværre er de fleste bugspytkirtlen kræftpatienter til stede med inoperabel metastatisk eller lokalt fremskreden sygdom. Faktisk er det kun 20% af patienterne har resekterbare tumorer ved diagnosetidspunktet [3]. Men selv for de patienter, der gennemgår kirurgi, den samlede 5-års overlevelse er på kun 20%, da de fleste af disse patienter vil tilbagefald inden for et år af deres operation [3]. Derfor er der et kritisk behov for nye lægemidler, der mere virkningsfuldt kan målrette disse tumorceller og /eller reducere forekomsten af tilbagefald. Der er blevet foreslået telomerase-inhibitorer, der skal særligt velegnede til at blokere genvækst af resterende cancerceller efter konventionel cancerterapi [4], [5]. Ikke alene skal de selektivt målrette telomerase-positive kræftceller, men deres væksthæmmende effekter stige som de målrettede celler udfører et stigende antal celledelinger. I den foreliggende undersøgelse har vi karakteriseret virkningerne af en telomeraseinhibitor, GRN163L, på den cellulære levetid og overlevelse af et panel af bugspytkirtelkræft cellelinjer.
Telomerase er enzymet ansvarlig for vedligeholdelse af telomerer, afgørende strukturer, der kasket og beskytter enderne af lineære kromosomer. Humane telomerer er lavet af tandemkopier af (TTAGGG)
n DNA gentager og associerede proteiner, som sammen danner en beskyttende capping kompleks [6], [7]. Denne hætte beskytter kromosomal ender mod nedbrydning, interchromosomal fusioner og fra at blive anerkendt som dobbeltstrenget (ds) DNA pauser, en form for DNA-skader [7], [8]. På grund af problemer forbundet med replikationen af enderne af lineære DNA-molekyler, de såkaldte ende-replikeringsproblemer, telomerer forkorte hver gang humane somatiske celler deler og denne nedslidning begrænser deres levetid [9]. Når den korteste telomer bliver reducerede, er en DNA-skader respons induceret der mobiliserer den p53 og p16 /PRB veje, som derefter handle sammen for at fremkalde ældning, en levedygtig tilstand af irreversibel hvile [10], [11]. Hvis p53 og p16 /PRB veje er deaktiveret, vil cellerne ignorere disse væksthæmmende signaler og vil fortsætte med at dele og forkorte deres telomerer. Til sidst, terminal telomer afkortning føre til krise, en ikke-levedygtige tilstand er forbundet med programmeret celledød [10], [11]. Krise er udløst af tilbagevendende cyklusser af telomer-telomer fusioner, anafase broer og kromosombrud [12]. Når der forekommer, kan telomerase forhindre fremkaldelse af ældning og krise og udvide cellulær levetid ved syntese og tilføjelse af nye telomere gentagelser til telomerer. Telomerase er allestedsnærværende stede i de tidlige stadier af menneskets udvikling. Men på tidspunktet for fødslen, er udtryk for enzymet undertrykt og telomerase bliver fraværende fra de fleste somatiske væv [13], [14], herunder bugspytkirtlen [15], [16], [17]. Kræft prøver, i skarp kontrast til normale væv, er næsten altid positiv for telomerase-aktivitet [18], herunder pancreas duktalt adenocarcinomer [15], [16], [17]. Detekteret i mere end 85% af cancere, uanset tumortype, telomerase er en af de bedst kendte markører for cancerceller [18]. Desuden er dette udtryk for telomerase i cancerceller kræves til deres ubegrænsede proliferation eller udødelighed, et kendetegn for cancer. Følgelig inhibering af telomerase i cancerceller fører til telomer nedslidning og begrænser levetiden for disse celler [19], [20], [21], [22]. Efter tilstrækkelig telomer nedslidning har fundet sted, vil telomerase-inhiberet cancerceller bukke under for enten senescens eller apoptose, afhængigt af det cellulære system. Denne afhængighed af telomerase fra deres ubegrænsede vækst og den næsten universelle udtryk for telomerase i cancerceller gør telomerase et attraktivt mål for kræftbehandling. En potentiel ulempe, at imidlertid forsinkelserne nødvendige før de målrettede cancerceller har mistet tilstrækkeligt telomerer for senescens eller krise induceres. Dette forsinket virkning kan udelukke deres anvendelse som en første linje i behandling for cancer, men at blokere genvækst af tilbageværende sygdom efter konventionel terapi, have forventet telomerase-inhibitorer at have god terapeutisk potentiale [4], [5].
humant telomerase indeholder to essentielle underenheder: proteinet hTERT (human telomerase revers transkriptase) og den lille nukleare RNA hTR (human telomerase-RNA). Den første giver katalytisk aktivitet, og den anden indeholder en kort sekvens (5′-CUAACCCUAA-3 ‘), der fungerer som en skabelon for syntesen af telomere gentagelser [23]. Underlaget af telomerase er den enkeltstrengede 3′-telomere udhæng, der hætter allersidst i alle telomerer. Enzymet fungerer som en revers transkriptase og anvender RNA hTR som en skabelon for syntesen og tilsætning af telomert DNA gentager til 3′-telomere udhæng. For telomerase inhibering, skabelonen område af det humane telomerase RNA (hTR) præsenterer en tilgængelig mål for oligonukleotid-inhibitorer [4], [24]. Oligonukleotider udformet til at hybridisere til templaten region kan anvendes til at inhibere aktiviteten af telomerase [25], [26]. Oligonukleotider med forskellige kemier er blevet testet og N3’-P5 ‘thio-phosphoramidat oligonukleotider har givet nogle af de mest potente og selektive inhibitorer af telomerase [25], [27], [28]. Disse forbindelser er ikke-toksiske, vandopløselige, nukleaseresistente og udviser høj termisk stabilitet duplexer dannet med deres komplementære RNA-strenge. GRN163L er en anden generation N3’-P5 ‘thio-phosphoramidat telomeraseinhibitor designet af Geron Corp (Menlo Park, CA) [20]. Denne inhibitor, også kendt som Imetelstat, bærer en 5’-terminal palmitoyl-del konjugeret til N3 ‘ P5′ thio-phosphoramidat skelet (5’-palmitat-TAGGGTTAGACAA-NH
2-3 ‘). GRN163L er fedtopløselige og kræver ikke transfektion for cellulær optagelse. Ved nanomolære koncentrationer, GRN163L hæmmer telomerase i et stort spektrum af kræft cellelinjer [20]. I opfølgende undersøgelser, kunne langsigtet GRN163L eksponering begrænse levetiden for dyrkede cancerceller afledt af glioblastom [29], myelomatose [30] og Barretts spiserøret adenocarcinom [31] samt bryst [32], [33], lunge [34] og lever [35] cancere. I musemodeller, kan inhibitoren inhibere væksten af xenografter fremstillet i mus ved implantation af disse humane cancerceller [29], [30], [31], [33], [34], [35]. GRN163L er i øjeblikket i kliniske forsøg hos patienter med myelomatose (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01242930)., Essentiel thrombocythemi eller Polycytæmia Vera (NCT01243073), og primær eller sekundær myelofibrose (NCT01731951)
Virkningerne af telomerase hæmning, endsige GRN163L, er aldrig blevet undersøgt i bugspytkirtelkræft, en af de dødeligste og hyppigst tilbagevendende ondartetheder. I denne rapport har vi testet effekten af GRN163L på et panel af 10 bugspytkirtelkræft cellelinjer. Med IC
50 i det nanomolære område, GRN163L virkningsfuldt hæmmet telomerase i alle 10 cellelinjer. Kontinuerlig GRN163L eksponering af CAPAN1 og CD18-celler resulterede i en initial hurtig afkortning af telomerer efterfulgt af opretholdelse af ekstremt korte, men stabile telomerer. Kontinuerlig eksponering for lægemidlet til sidst førte til krise og et fuldstændigt tab af levedygtighed efter 47 og 69 fordoblinger, hhv. Disse resultater viser, at vedvarende udsættelse for GRN163L kan vende udødelige fænotype af pankreatiske cancerceller. Disse resultater bør lette udformningen af fremtidige kliniske forsøg med GRN163L i patienter med kræft i bugspytkirtlen.
Materialer og metoder
Materialer
føtalt bovint serum (FBS) var fra HyClone ( Logan, UT, USA). T4-polynukleotidkinase, blev proteinase K, Gentamycin, Penicillin /Streptomycin, Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), RPMI-1640-medium, Iscoves modificerede Dulbeccos medium og McCoys 5A-medium indkøbt fra Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA). Restriktionsenzymerne AluI, MspI, HaeIII, Hinfl og RsaI var fra New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) henviser Cfol blev opnået fra Promega Corporation (Madison, WI, USA). Den pattedyr proteasehæmmer cocktail var fra Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MO, USA). Den palmitoyl-konjugeret N3 ‘ P5 “thio-phosphoramidat GRN163L oligo (5’-palmitat-TAGGGTTAGACAA-NH
2-3″) og uoverensstemmende oligo (5′-palmitat-TAGGTGTAAGCAA-NH
2-3 “; uoverensstemmelser understreget) blev leveret af Geron Corporation (Menlo Park, CA, USA). N3 ‘ P5’ thio-phosphoramidat oligoer opløstes i phosphatpufret saltvand (PBS) for at gøre 1 mM stamopløsninger, som blev holdt frosset ved -80 ° C. Alle andre kemikalier var fra Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA).
cellelinier
anvendte cellelinier blev tidligere beskrevet af andre [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40], [41]. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO
2. Alle cellelinier blev dyrket i medium suppleret med 10% FBS og enten 50 ug /ml gentamycin eller 100 U /ml penicillin /streptomycin. De anvendte medier var som følger: DMEM for de fleste cellelinjer (Va13, HeLa, HPAF, CD18, Hs766T, CAPAN1, MiaPaCa2, Panc1 og L3.6pl celler); RPMI-1640 medium til AsPC1 celler; Iscoves modificerede Dulbeccos medium for CFPAC1; og McCoys 5A medium for CAPAN2 celler.
telomer Size Analysis
Totalt genomisk DNA blev isoleret fra frosne pellets af celler. Kort beskrevet blev celler resuspenderet i 2 volumener af en puffer indeholdende 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) og 25 mM EDTA (pH 8,0), hvorefter 0,4 mg /ml proteinase K blev tilsat. Natriumdodecylsulfat (SDS) blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 0,5% (vægt /volumen), og prøverne blev roteret natten over ved 50 ° C. Den næste dag blev prøver ekstraheret to gange med Tris-buffer-mættet phenol og derefter en gang med vandmættet CHC
3. Dernæst blev prøver dialyseret natten over ved 4 ° C mod to skift af TE-buffer (1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCI, pH 8,0). Genomisk DNA-prøver blev opbevaret ved 4 ° C.
Genomisk DNA (5-10 ug) blev fordøjet ved 37 ° C i 2-4 timer i 100 pi af React 1 puffer (10 mM MgCl
2 og 50 mM Tris-HCI, pH 8,0) med en cocktail af restriktionsenzymer, der ikke skære telomere DNA: Alul, Cfol, HaeIII, Hinfl, MspI, og RsaI (16 enheder hver). Fordøjede prøver blev sat på en 25 cm lang 0,7% agarosegel i 0,5 × TBE-buffer (Tris-EDTA-borat), sammen med en endemærket [
32P] -molecular vægt DNA-markør. Elektroforese blev udført natten over ved 50 volt, hvorefter gelen blev overført til en 3 M papir og vakuum-tørret ved 60 ° C i en time. Gelen blev udblødt i 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 15 minutter, hvorunder den 3 M papiret blev skrællet af. Gelen blev neutraliseret i 2 × 15 minutter i 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCI, pH 7,4 og derefter overført til 6 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM natriumcitrat, pH 7,0). Pre-hybridisering blev udført i 2 timer ved 30 ° C i en puffer indeholdende 5 x SSC, 5 x Denhardts opløsning, 1 mM EDTA, 0,1% SDS (vægt /volumen) og 10 mM LiCI. Hybridiseringen blev udført i den samme buffer ved 37 ° C natten over, under anvendelse af 0,5-1,0 × 10
6 cpm /ml af en endemærket [
32P] – (TTAGGG)
4 probe. Gelen blev forvasket i 5 x SSC (to gange i 10 minutter hver ved 37 ° C) og derefter i 0,1 x SSC indeholdende 0,1% SDS (tre gange i 10 minutter hver ved stuetemperatur). Gel blev blottet tør, dækket med Saran Wrap og eksponeret for en Phosphoimager kassette.
Median telomer størrelser blev estimeret ud fra den densitometrisk scanning af hver bane. Signalintensitet blev først afbildet som en funktion af migrationen afstand. Radiomærkede molekylvægtsmarkører blev anvendt til at frembringe en kalibreringskurve med til at genberegne størrelse for hver afstand migreret. Telomer signalintensitet blev derefter plottet igen som en funktion af den anslåede størrelse, snarere end afstanden (fx figur S4). Median blev estimeret som den størrelse, der svarede til halvdelen af den samlede sum af alle signal intensiteter.
Bestemmelse af relativ Telomerase Aktivitet
Telomerase-aktivitet blev målt ved hjælp af en ikke-radioaktivt modifikation af TRAP assay (telomere Repeat forstærkning Protocol), ifølge Herbert
et al
. [42]. Assayet blev udført under anvendelse af trapez telomerase detektion kit (cat # S7700; Millipore, Billerica, MA), der erstatter den [
32P] -mærket TS oligo med en Cy5-konjugeret TS oligo (5′-Cy5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 «integrerede DNA Technologies, Coralville, IA). Assayet blev udført ifølge producentens anvisninger, bortset fra, at: 1) lastning farvestof indeholdt ikke xylencyanol; 2) PCR blev udført i 33 cyklusser; 3) gel blev scannet direkte uden tørring. Halvdelen reaktioner blev separeret på en 10% polyacrylamid /0,5 × TBE gel til 165 minutter ved 200 volt, hvorefter scanning af gelen blev udført ved anvendelse af en Molecular Dynamics Typhoon Imager System (Molecular Dynamics). Assayet omfatter en intern standard (ITAS) med til at normalisere signalerne for forskelle i PCR effektivitet. Med ImageQuant programmet (Molecular Dynamics), blev telomeraseaktivitet beregnes ud fra forholdet mellem intensiteten af telomer varer i den af de ITAS. At sammenligne niveauer af telomerase-aktivitet mellem cellelinier blev serielle fortyndinger (50, 100, 200, 500 celler /analyse) af hver linie analyseres parallelt i telomeraseaktivitet (telomerase produkter /ITAS forhold). Plotning telomerase-aktivitet som en funktion af celletal, blev data fra hver linje monteret af mindste kvadraters regression til en lineær kurve. Hældningen af hver kurve og 95% konfidensintervaller kunne så bruges til at sammenligne de relative niveauer af telomerase-aktivitet.
Bestemmelse af IC
50 for GRN163L
IC
50 bestemmelser var udført i 96-brønds plader. Celler blev podet ved 5 x 10
4 /brønd, lodes fastgjort, og derefter eksponeret i tre eksemplarer til en variabel dosis GRN163L (0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 4000 nM) eller mismatchede oligo (0, 4000 nM). Fireogtyve timer senere blev cellerne vasket tre gange med 100 pi iskold phosphatbufret saltvand (PBS) og lyseres derefter i 50 pi 1 × CHAPS puffer (trapez Kit). Lysis blev gjort ved vuggende på is i 30 minutter, hvorefter 96-brønds plade blev frosset. Dagen for assayet blev pladen optøet og prøver blev fortyndet 1:20 på en ny plade under anvendelse iskold 1 × CHAPS buffer (slutkoncentrationer = 50 celler /pi). To mikroliter af hver fortyndet prøve (100 celler) blev derefter analyseret som beskrevet ovenfor under anvendelse af ikke-radioaktive TRAP-assay. Telomeraseaktivitet (Telomerase produkter /ITAS forhold) blev beregnet for hvert datapunkt, blev derefter udtrykt som en procent af den gennemsnitlige værdi af de ubehandlede prøver (n = 3), og blev derefter rapporteret på punktdiagram som en funktion af log [ ,,,0],GRN163L]. Med SigmaPlot versionen 11,0, blev datapunkter efterfølgende monteret af ikke-lineær regression til en 2-parametter sigmoid kurve (Procent telomerase = D + (100-D) /(1 + 10
((log [GRN163L] -log [IC50 ]) * 1,59)), hvor D er den minimal residual aktivitet), hvorfra vi anslået værdien og 95% konfidensinterval på loggen [IC
50].
SA-β-galactosidase aktivitet
celler blev udpladet ved en densitet på 10
4 celler /brønd i en 24-brønds plade. Den næste dag blev cellerne fikseret og udsat for histokemisk farvning for human senescens-associerede β-galactosidaseaktivitet. Fiksering og farvning blev udført som tidligere [43] beskrevne. Uden en fase kontrast filter, både de positivt (blå) og negativt (ufarvede) farvede celler blev talt under mikroskop. Kombinere data fra ti separate felter, blev procent af blå celler tabelform fra i alt mindst 200 optalte celler.
vækstkurver
Celler blev podet ved en tæthed på 3 × 10
5 celler pr 150 mm skål. Narkotika (PBS køretøj, en uM GRN163L, 1 pM uoverensstemmende oligo) blev tilsat, så snart cellerne blev fastgjort (efter 4-8 timer). Celler blev dyrket i 7 dage, i hvilken periode friske lægemidler blev tilsat hver 2-3 dage. Efter en uges vækst blev celler trypsiniseret og talt, og antallet af populationsfordoblinger udført af hver prøve blev igen beregnet. Cellerne blev derefter belagt på samme oprindelige tæthed til en anden uge af væksten, mens resterende celler afsat til enten DNA isolering eller til fremstilling af frosne bestande. Celler blev holdt i kultur indtil den fuldstændigt tab af de GRN163L-behandlede kulturer.
Western blot-analyse Salg
adhærerende celler blev vasket to gange med iskold phosphatbufret saltvand (PBS), høstet ved skrabning i en lysepuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1% pattedyr proteaseinhibitorcocktail, og hver af de følgende kinase /phosphatase-inhibitorer: 1 mM na
3VO
4, 50 mM NaF, 5 mM natriumpyrophosphat, 10 mM natrium-2-glycerophosphat, og 1 pM microcystin. Flydende celler blev opsamlet ved centrifugering, hvorefter cellerne blev lyseret i den samme lyseringspuffer. Kombineret flydende og adhærente celler fra samme skålen var flash frosset og opbevaret ved -80 ° C. Proteiner blev kvantificeret under anvendelse af Bradford-metoden (Bio-Rad). Prøver (80-100 ug /brønd) blev adskilt på 4-20% gradient SDS-PAGE geler (Bio-Rad) og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). Blokering trin og inkuberinger med antistofferne blev udført i TBS-T (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7,6) indeholdende enten 5% fedtfri tørmælk eller 5% bovint serumalbumin (når anvendelse af phospho-specifikke primære antistoffer). Vaske blev udført under anvendelse af TBS-T. Signaler blev påvist ved anvendelse af SuperSignal West Pico kit (Thermo Scientifics). Antistoffer anvendt inkluderet mod H2AX (kaninantiserum, kat # 07-627) og γH2AX (phospho-Ser139, mus monoklonalt, klon JBW301) var fra Upstate. Anti-PARP1 antistof (mus monoklonalt, klon C-2-10) var fra Calbiochem /EMD Biosciences mens anti-actin antistof (ged polyklonale, sc-1616) var fra Santa Cruz Biotechnology. Sekundære antistoffer blev anvendt, var peberrodsperoxidasekonjugeret antistoffer mod mus, kanin eller gede-IgG (Jackson ImmunoResearch).
flowcytometrisk analyse
adhærerende celler blev opsamlet ved trypsinbehandling efterfulgt af centrifugering. Flydende celler blev opsamlet ved centrifugering. Kombinerede adhærente og flydende celler blev resuspenderet i PBS, fikseret ved tilsætning af ethanol til 80%, og derefter opbevaret ved -20 ° C. Tyve tusinde fikserede celler blev farvet med propidiumiodid og analyseret for DNA-indhold i overensstemmelse med producentens anvisninger under anvendelse af en FACS Calibur-instrument (vinke Dickinson, Mansfield, MA, USA).
Immunofluorescens Analyse af Telomerer
celler dyrket på dækglas blev vasket i PBS og fikseret i methanol: acetone [01:01] ved -10 ° C i 15 minutter. Efter en vask i PBS blev prøver blokeret ved stuetemperatur i 30 minutter i PBS indeholdende 10% hesteserum. Efter en vask i PBS blev prøver inkuberet ved 4 ° C natten over med det primære antistof i PBS indeholdende 2% hesteserum. Efter tre 5 minutter vaske i PBS blev prøver inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med det sekundære antistof i PBS indeholdende 2% hesteserum. Efter tre 10 minutter vaske i PBS blev prøver monteret i Vectashield hårdt indeholdende DAPI. Billeder blev visualiseret på et Zeiss 510 Meta konfokal Laser Scanning Microscope. Primære antistoffer blev anvendt, var en kanin-anti-TRF2 (H-300, Santa Cruz) og muse-anti-y-H2AX antistoffer (klon JBW301, Upstate). Sekundære antistoffer var et FITC-konjugeret æsel-anti-kanin-antistof og et Cy5-konjugeret æsel-anti-muse-antistof, både fra Jackson ImmunoResearch.
Påvisning af ALT ved kvantitativ PCR
Påvisning af telomert C -rige cirkler indikerer ALT udførtes som beskrevet af Reddel gruppen [44]. Tredobbelt blev 20 pi reaktioner indeholdt 32 ng genomisk DNA, 0,2 mg /ml bovint serumalbumin, 0,1% Tween-20, 4 mM dithiothreitol (DTT), 7,5 enheder Φ29 DNA-polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA) , 1 × Φ29-DNA-polymerase-buffer og 1 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Polymerasereaktioner blev inkuberet ved 30 ° C i 8 timer efterfulgt af 65 ° C i 20 minutter. Reaktioner blev prik-blottet på en nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Efter UV-tværbinding blev membranen hybridiseret natten over til en [
32p] -mærket (TAACCC)
4 probe. Hybridisering og vask blev udført som beskrevet i telomer størrelse analysen sektion (se ovenfor).
Resultater
telomerlængde og Telomerase Aktivitet Vary Blandt bugspytkirtelkræft cellelinier
Et panel af 10 bugspytkirtelkræft cellelinjer var præget for telomer længde og relative telomerase-aktivitet. Genomisk DNA isoleret fra hver linie blev fordøjet med en cocktail af 4 bp fræsere, opløst på agarosegel og underkastedes
in situ
hybridisering til en [
32p] -mærket (TTAGGG)
4 probe . Signaler afslørede en udstrygning af telomere fragmenter, der spænder i størrelse fra 1 til 7 kb (figur 1A). Densitometrisk analyse tillod bestemmelse af medianen størrelse af telomere signal for hver cellelinje (figur 1B). AsPC1 havde de korteste telomerer (median = 2,2 kb), mens CAPAN2 og Panc1 havde de længste (medianerne = 3,5 og 3,7 kb, henholdsvis). I nogle af linjerne, især CAPAN1 og CFPAC1, telomer fordeling var bifasisk. I disse linjer, en overflod af korte telomerer coexisted med en lille brøkdel af meget længere telomerer ( 5 kb). Forvent for CAPAN2 og Panc1, alle linjer havde meget korte bulk-telomerer, med mediane størrelser lige fra 2,2 til 2,8 kb. Til sammenligning telomerer i de normale menneskelige bugspytkirtlen er mellem 9 og 15 kb i længden, afhængigt af alder af donorernes [45].
A) telomer størrelse målinger. Genomisk DNA blev fordøjet med restriktionsenzymer, opløst ved elektroforese i agarosegeler og påvist ved in situ hybridisering til [
32P] – (CCCTAA)
4. B) Kvantificering af telomer størrelse. Gel i A blev scannet, og intensiteten af hver bane blev afbildet som en funktion af telomer størrelse, som beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. Medianen telomer størrelse blev estimeret som størrelse svarende til halvdelen af den kumulative sum af intensiteterne. C) Påvisning af telomeraseaktivitet ved TRAP-assay. Celleekstrakter der indeholder 300 celler hver blev analyseret under anvendelse af en Cy5-mærket TS oligo substrat. Efter PCR med den samme oligo og en telomere comeback primer, blev produkter opløst ved elektroforese og detekteret med en Typhon phosphoimager. Buffer var kun lysisbuffer. ITAS, Intern Telomerase Assay Standard. D) Kvantificering af relative telomeraseaktivitet. Relative telomeraseaktivitet blev beregnet som forholdet mellem intensiteten af telomerase stigen over intensiteten af ITAS. Hver måling er Mean ± standardafvigelse af tredobbelte prøver (n = 3). Telomeraseaktivitet i hver linje er udtrykt som en procent af HeLa-celler aktivitet.
Brug af en ikke-radioaktiv TRAP-assay (telomere Repeat Amplification Protocol) blev basislinje telomeraseaktivitet målt kvantitativt i hver cellelinie. Den TRAP assay bruger PCR til at forstærke produkterne af telomerase forlængelse (Telomerase stige) sammen med en intern telomerase assay standard (ITAS). Telomeraseaktivitet kvantificeres som forholdet mellem intensiteten af telomerase stigen forhold til den for de ITAS. Figur 1C viser et repræsentativt eksempel på et TRAP-assay udført på panelet, under anvendelse af samme antal celler fra hver linje. Der blev observeret store forskelle i den relative intensitet af ITAS og telomerase stigen, indikerer store forskelle i baseline telomerase aktiviteter. For at få mere præcise målinger af telomeraseaktivitet, blev serielt fortyndede prøver af hver linje samtidigt analyseret og sammenlignet med HeLa-celler. Densitometrisk analyse tillod beregning af baseline telomerase aktivitet for hver linje (Figur 1D). Kræft i bugspytkirtlen cellelinjer havde niveauer af telomerase-aktivitet, der lå fra 0,5% (CD18) til 23% (AsPC1) i nævnte af HeLa-celler. Fire linjer (L3.6pl, MiaPaCa2, HPAF, AsPC1) var en del af en gruppe med højere niveauer af telomerase (15,8 ± 4,8 procent af HeLa). Seks linjer (CD18, Panc1, Hs766T, CFPAC1, CAPAN1, CAPAN2) var en del af gruppen, der viser 10 gange lavere telomerase (1,53 ± 1,1% procent af HeLa). En 46-fold forskel i telomerase-aktivitet blev bemærket mellem AsPC1 (højeste aktivitet) og CD18 (laveste aktivitet) celler. Ingen korrelation blev fundet mellem størrelsen af telomerer og niveauet af telomerase-aktivitet (figur S1A).
Telomerase inhiberende aktivitet af GRN163L i bugspytkirtelkræft cellelinier
Næste, vi undersøgte de telomerase hæmmende virkninger af GRN163L i hver af de 10 bugspytkirtelkræft cellelinjer. I hver linje blev telomeraseaktivitet målt 24 h efter tilsætning af stigende koncentrationer af GRN163L til cellerne (n = 3 for hver dosis). Figur 2A viser resultaterne af denne analyse i HPAF celler. Densitometrisk analyse af TRAP gel tilladte målinger af relativ telomerase-aktivitet, som derefter kunne udtrykkes som en funktion af GRN163L koncentration. Disse dosisresponskurver blev tilpasset ved ikke-lineær regression for at tillade beregning af en IC
50 for hver linje. Figur 2B viser 95% interval af tillid til værdien af IC
50 i hver linje. Alle 10 bugspytkirtelkræft cellelinjer reagerede på GRN163L, med IC
50, der varierede fra 50 nM til 200 nM. Den mindst følsomme linje var CD18 (IC
50 = 204 nM) og de mest lydhøre dem var CFPAC1 og MiaPaCa2 (IC
50 = 52 nM, begge). Vi så ingen sammenhæng mellem baseline telomerase aktivitet og respons af cellelinier til GRN163L, målt ved deres respektive IC
50 (figur S1B).
A) kurve af telomerase hæmning af GRN163L Dosis-respons . HPAF celler blev behandlet i tre eksemplarer med stigende koncentrationer af GRN163L (50 nM til 4 pM). Fireogtyve timer senere blev telomeraseaktivitet målt under anvendelse af TRAP-assayet. Prøver behandlet med intet lægemiddel, blev sat til 100%. B) IC
50 af hver linje til inhibering af telomerase af GRN163L. Dosis-respons-kurver blev udført som i panel A. Ikke-lineær kurvetilpasning tilladt beregning af en IC
50 for hver linje. Resultaterne er udtrykt som IC
50 (midterste bar) og dens 95% interval på tillid (flankerende søjler).
Virkninger af kronisk GRN163L Eksponering på spredning og Cellular Levetid
To bugspytkirtelkræft cellelinjer blev valgt til at undersøge effekten af langvarig udsættelse for GRN163L: CAPAN1 og CD18. Sammenlignes med de fleste af de adspurgte linjer, CAPAN1 og CD18 begge havde relativt korte telomerer (2-3 kb) og lavt niveau telomerase aktiviteter (0,5-1% af HeLa-celler). centrifugation.
doi:10.1371/journal.pone.0085155.s005
(TIF)
Acknowledgments
GRN163L
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.