PLoS ONE: Udveksling af Cytosolisk indhold mellem T-celler og tumorceller Aktiverer CD4 T-celler og hæmmer kræft vækst

​​

Abstrakt

Baggrund

T-celler er kendt for at deltage i svaret til tumorceller og reagerer med cytotoksicitet og cytokinfrigivelse. Samtidig tumorer etableret alsidige mekanismer til lyddæmpning af immunreaktioner. Samspillet er langt fra helt forstået. I denne undersøgelse viser vi kontakter mellem tumorceller og lymfocytter afslørende nye egenskaber i interaktionen af ​​T-celler og cancerceller på en måde, der ikke tidligere er beskrevet.

Metoder /forhold

Eksperimenter er baseret på den anvendelse af en hydrofil fluorescerende farvestof, der forekommer frit i cytosolen og dermed overførsel af fluorescerende cytosol fra en celle til den anden kan observeres ved anvendelse af flowcytometri. Tumorceller fra cellelinjer af forskellig oprindelse eller primært hepatocellulært carcinom (HCC) -celler blev inkuberet med lymfocytter fra humant og mus. Denne eksponering fremkaldte en kontakt afhængige optagelse af tumorafledte cytosol af lymfocytter – selv i CD4

+ T-celler og murine B-celler – som ikke kunne påvises efter inkubation af lymfocytter med raske celler. Samspillet var en direkte en, der ikke kræver tilstedeværelsen af ​​accessoriske celler, men uafhængig af cytotoksicitet og TCR engagement.

elektronmikroskopi oplyses 100-200nm store huller i cellemembranerne af indbyrdes forbundne celler, som adskilte levedygtige og afslørede forbløffende resultat. Mens lymfocytter blev induceret til at proliferere i et langsigtet mode, tumorcellerne undergik en midlertidig pause i celledeling.

in vitro

resultater blev bekræftet

in vivo

ved hjælp af en muse akut lymfoblastær leukæmi (ALL) model. Anholdelsen af ​​tumor spredning resulterede i en signifikant forlænget overlevelse udfordret mus.

Konklusioner

De rapporterede celle-celle kontakter afslører nye egenskaber dvs. den enabling af cytosol flow mellem cellerne herunder biologiske aktive proteiner, der påvirker hele cellecyklus og biologiske opførsel af de modtagende celler. Dette tilføjer en helt ny aspekt i tumor-induceret immunologi

Henvisning:. Hardtke-Wolenski M, Kraus L, Schmetz C, Trautewig B, Noyan F, Vondran FWR, et al. (2013) Udveksling af Cytosolisk indhold mellem T-celler og tumorceller Aktiverer CD4 T-celler og hæmmer kræft vækst. PLoS ONE 8 (10): e78558. doi: 10,1371 /journal.pone.0078558

Redaktør: R. Lee Mosley, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: April 30, 2013; Accepteret: September 19, 2013; Udgivet: 24 okt 2013

Copyright: © 2013 Hardtke-Wolenski et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Novartis Pharma GmbH og Hilf tildelingen af ​​Hannover Medical School. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde er finansieret af Hilf tildelingen af ​​Hannover Medical School og Novartis Pharma. Det betyder dog ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft er ligesom skjul-og-søger mellem tumorceller og immunforsvaret . Immunsystemet når udfordret af kræft, dog står over det problem, at MHC selv-udtrykkende celler skal kontrolleres i deres malignitet. Ikke desto mindre er kontakten af ​​normale celler til tumorceller ledsages af ekspressionen af ​​tumorspecifikke peptider i stand til at aktivere T-celler (gennemgået af [1]). De fleste af disse peptider nedstammer fra proteiner ikke udelukkende produceres af tumorceller, men modificeret i deres struktur. T-celle-respons holder tumor i en stabil eller hvilende tilstand [2,3]. Det har været en accepteret hypotese, at de fleste anti-tumor-responser medieres af CD8

+ T-celler og CD4

+ T-celler er begrænset til enten at hjælpe CD8

+ T-celler til effektiv cytotoksicitet [4, 5] eller prime dendritiske celler (DC) for at forbedre respons af CD8

+ T-celler [6,7].

I modsætning til dette dogme seneste rapporter afslørede deltagelse af CD4

+ T-celler som kraftige effektor celler med kapacitet til direkte aktion mod tumorceller, der fører til regression af tumoren [8-10]. Det er blevet vist, at overførsel af tumor-antigen specifikke CD4

+ T-celler i udfordrede men immun-deficiente mus kan forårsage komplet tumorregression uden brug af CD8

+ T-celle, NK-celle eller B-celle-bistand [10 ]. Men formodningen for alle beskrevne kraftige T-cellereaktioner er enten en transgen specificitet af T-celle receptor (TCR) mod kendte tumor-antigener eller isolering og ekspansion af tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL).

Således kan observeres aktivering af immunresponset, men i løbet af tumorvækst opstår en redigering af immunresponset. Dette omfatter ækvilibrering og endelig immun udslip af tumorceller ved induktion af resistens [11]. Denne effektive immune unddragelse af tumorer skyldes oprettelsen af ​​et mikromiljø, der tiltrækker suppressive myeloide-afledte celler og regulatoriske T-celler. Desuden cytokinet og kemokin sammensætning samt ekspressionen af ​​visse ligander på tumorceller kan konvertere effektorceller til regulatoriske celler eller køre dem ind anergi og apoptose (gennemgået af [11,12]). Kendskabet til denne frem og tilbage af immunsystemet og cancer

in vivo

er stadig fuld af huller således hver ekstra vekselvirkning af T-celler med tumorceller hjælper til at forstå svaret og undslippe mekanismer.

i denne undersøgelse rapporterer vi en hidtil ikke beskrevet interaktion mellem tumorceller og T-celler, både CD4

+ og CD8

+ T-celler. Dette omfatter kontakt formation med forskellige karakteristika fra den immunologiske synapse. Dannelsen af ​​synapsen er blevet grundigt undersøgt og består af flere led, herunder pseudopodia, mikrotubulusdannelse og co-lokalisering af mitokondrier og endoplasmatisk reticulum [13]. Alle disse egenskaber mangler i de kontakter, vi observerede. I stedet kontakterne fører til cytosol udveksling mellem lymfocytter og tumorceller

in vitro

in vivo

fremkalde en pause i proliferation af tumorcellerne. I modsætning til tidligere rapporter opstår disse kontakter uafhængigt af tilstedeværelsen af ​​antigenpræsenterende celler. Som følge af disse interaktioner, er løbende T celledeling induceret i lymfocytter, der inkorporerer tumorafledte cytosol. Denne specifikke fænomen er et nyt aspekt af samspillet mellem immunsystemet med tumorceller.

Resultater

Kontakt dannelse mellem tumorceller og T-celler inducerer strøm af cytosol uassocieret med cytotoxocicity

En kort bemærkning: Forsøgene præsenteret i figur 1 viser interaktionen af ​​menneskelige PBMC’er med porcin B-celle-leukæmi linje L23. Oprindeligt vi spurgte, om celler af denne porcin cellelinje er mål for menneskelige NK og cytotoksiske T-celler og har til formål at analysere dette i flowcytometri, som vi har udført tidligere ved hjælp af parasitter som mål for NK-celler [14,15]. Som en tilfældighed fandt vi tilpasningen af ​​fluorescens af T-celler efter eksponering for L23-celler. Det viste sig endvidere, at denne effekt er ikke en xenogen bestemt fænomen, men kan observeres med humane og murine lymfocytter og flere tumorer af forskellig oprindelse. Men denne model viste de væsentligste resultater og er således bedst egnet til at afspejle dette hidtil ukendte interaktion mellem T-celler og tumorceller. Vi er opmærksomme på det kunstige system, da menneskelige PBMC’er og svin tumorceller er usandsynligt, at der findes sammen under naturlige forhold. Således begrænses vi data ved hjælp af porcine celler til figur 1 og efterfølgende skiftet til en musemodel.

(A) 2×10

6 humane PBMC’er eller oprenset CD4

+ T-celler blev inkuberet med 2×10

6 CMFDA-mærkede L23 celler i 4 timer, derefter farvet for CD3, CD4 og CD8 og analyseret i flowcytometri, henholdsvis. Eksponeringen af ​​lymfocytter til L23 celler førte til en optagelse af fluorescens i talrige T-celler.

(B) Sammenfatning af fire uafhængige forsøg udført som beskrevet ovenfor. Hyppigheden af ​​grønne fluorescerende T-celler er relateret til bulkpopulation af PBMC’er.

(C) PBMC’er præinkuberet med 5 mM strontiumchlorid at inducere degranulering før udsættelse for L23 celler. Adpation af fluorescens blev vurderet i CD4

+ og CD8

+ T-celler.

(D) 2×10

6 oprensede T-celler og 2×10

6 L23 blev inkuberet i 4 timer sammen eller adskilt af transbrøndene (TW), de mærkede L23 celler i bunden af ​​en 96 brønd rundbundet plade og T-celler anbragt i transbrøndene.

(E) Oprenset CD4

+ T-celler blev inkuberet med L23 celler i 4 timer, faste og forberedte til elektronmikroskopi (EM). Scanning (i) og transmission EM (ii-iv) afslørede intense kontakter. I transmission EM strøm af cytosol blev visualiseret ved elektronen tætte cytosolen i lymfocytter, som distribueres fra det sted kontakter i tumorcellen (pile i (ii) og (iii)). I den højeste forstørrelse huller i cellemembranerne kunne påvises (pile i iv). De huller Rumperede længde op til 200 nm tillade fri strøm af cytosol og opløselige komponenter, men ikke af cellulære strukturer, f.eks mitokondrier. aggregeringen af ​​mitokondrier i kontaktområdet dannelse, kan imidlertid være en indikation af energiforbrugende processer. Salg

(F) CD4

+ T-celler blev sorteret efter inkubation med CMFDA-mærket luciferase-transgeneic L23 celler i grøn-fluorescerende og ikke-fluorescerende T-celler. 5×10

4 separeret T-celler blev efterfølgende inkuberet i medium suppleret med 100 ug /ml luciferin i 96 brønd rundbundede plader. Luminescens blev vurderet efter 30 minutters inkubation under anvendelse IVIS analyse. 5×10

4 transgeneic L23 celler tjente som kontrol af luminescens intensitet.

Resultaterne er vist som repræsentative billeder og scatter-gram eller sammenfatter 4 uafhængige forsøg som middelværdi ± SEM.

for fluorescerende mærkning af celler anvendte vi CellTracker Green (5-chlor-methylfluorescin diacetat [CMFDA]). CMFDA oprindeligt er et ikke-fluorescerende molekyle i stand til at passere cellemembranen. I levedygtige celler CMFDA spaltes i fluorescerende, stærkt hydrofil formular opbygge et voluminøst vand kappe. Dette averts dens udgivelse gennem intakt cellemembran af levedygtige celler. CMFDA kan anvendes som en markør for levedygtighed da i tilfælde af cytotoksisk lysis, mærkede celler bliver ikke-fluorescerende på grund af tab af CMFDA-holdige cytosol [14]. En analyse i flowcytometri er mulig, hvis effektorceller og målceller afviger markant i størrelse og dermed kan skelnes i fremadrettede sidelæns-scatter (fig S1). Men i stedet for tab af fluorescens vi observeret en optagelse af fluorescens af lymfocytter efter co-dyrkning af tumorceller med PBMC’er indikerer en overførsel af CMFDA molekyler fra en celle til den anden (figur 1A). Tilpasning af fluorescens næsten udelukkende begrænset til T-celler, eftersom kun en meget lille brøkdel af CD3

– celler blev fluorescerende. Af note, den observerede interaktion af T-celler med tumorceller kræves ingen bystander-celler som eksemplificeret ved udsættelse af højt oprenset CD4

+ T-celler til L23 celler. Også denne indstilling inducerede en markant forhold af grøn-fluorescerende celler (figur 1A).

Som prikken skamplet shows, denne interaktion vedrørte et betydeligt antal T-celler: I gennemsnit 20% af CD4

+ og 7% af CD8

+ T celler blandt bulk-PBMC’er blev grøn fluorescerende (figur 1B). Dette fænomen kan kun forklares ved optagelsen af ​​cytosolen indeholder CMFDA molekyler fra en celle til den anden. Det er bemærkelsesværdigt, at NK-celler viste ingen tegn på indsamling fluorescerende tumorafledte cytosol selvom de udviser stærk cytotoksisk aktivitet mod de L23 tumorceller (figur S2). Imidlertid synes cytotoksicitet at være en rimelig forklaring på den observerede effekt. Vi testede muligheden for cytotoksicitet være ansvarlig for udveksling af cytosol ved behandling af PBMC’er med strontiumchlorid (SrCl

2), et reagens, som inducerer eksocytose af lytiske granula [16]. Således behandling med SrCl

2 blade cytotoksiske celler ineffektiv. Ikke desto mindre, lymfocytter stadig afslørede en optagelse af CMFDA (figur 1C). Dette er baggrunden for både CD4

+ og CD8

+ T-celler, hvilket er en indikation af, at cytotoksicitet ikke er agent for udveksling af cytosol. Selv om kun lidt vi observeret en stigning i fluorescerende tilpasning efter SrCl

2 behandling i begge populationer af T-celler. Imidlertid kontakt formation var obligatorisk for effekten observeret. T-celler og tumorceller blev inkuberet enten i co-kultur eller adskilt af transbrøndene. Grønt fluorescerende T-celler kunne kun påvises efter direkte udsættelse for tumorceller, men ikke i transwell kulturer (figur 1D).

Huller i cellemembranerne af tumorceller og naive lymfocytter tillader overførsel af cytosolen herunder høj molekylvægt molekyler og inducere proliferation af T-celler

Vi yderligere fokuseret på samspillet af CD4

+ -T-celler med tumorceller ved visualisering af kontakt formation. Scanning elektronmikroskopi (SEM) afslørede den intense karakter af de celle-kontakter, der fører til polarisering af de interagerende tumorcelle-lymfocyt partnere (figur 1E i). Endvidere transmissionselektronmikroskopi (TEM) viste, selv ved lav forstørrelse, en strøm af elektron tætte cytosol fra T-cellen i tumorcellen, der fremkom ved den højeste forstørrelse, der skal aktiveres af huller i cellemembranen af ​​begge parter (figur 1E ii-iv). Disse huller udvidet områder mellem 100-200nm og derfor bør gøre det muligt at overføre mere end blot lavmolekylære komponenter i cytosolen, men også molekyler med enzymatisk funktion med høj molekylvægt. Følgelig passagen af ​​30 kDa proteinet luciferase blev bedømt ved samdyrkning af PBMC’er med retroviral transduceret luciferase udtrykker L23 celler. Transducerede L23 celler blev mærket med CMFDA og T-celler blev separeret efter eksponering til tumorcellerne adskille Green Fluorescent fra den ikke-fluorescerende CD4

+ T-celler. Oprensede T-celler blev efterfølgende inkuberet med luciferin at vurdere enzymatisk aktivitet. Faktisk T-celler med optagelse af CMFDA afslørede luminescens mens de ikke-fluorescerende T-celler var negative for luciferaseaktivitet (figur 1F). Dette viste tydeligt en overførsel af cytosol forbundet med en udveksling af molekyler, som vedvarende biologisk aktivitet i recipientcellen. Det er således interessant at følge konsekvenserne af kontakter til de partnere, hvis cytosoliske komponenter bevare deres biologiske funktion. Dybest set gjorde vi, i musemodel

in vitro

in vivo

men fandt støtte data også med humane lymfocytter og svin tumorceller.

Vi adskilt fluorescerende og ikke- fluorescerende CD4

+ T-celler efter udsættelse for CMFDA-mærkede tumorceller og isolerede celler blev dyrket uden yderligere stimulation i medium i 5 dage. Vi fandt udtalt proliferation af disse T-celler med inkorporering af tumor afledt cytosol (fig S3). T-celle-ekspansion kan induceres af T-cellereceptor afhængige og uafhængige pathways. Det er blevet rapporteret, at T-celler internaliserer TCR efter udsættelse for anti CD3-monoklonalt antistof (mAb) klon OKT3 visse betingelser [17]. Således har vi anvendt den protokol i vore forsøg og efterprøvede forsvinden TCR fra celleoverfladen af ​​T-celler. Ikke desto mindre blev optagelsen af ​​fluorescens ikke ophævet af behandlingen. Desuden blokering af svin MHC II-molekyler med mAb MSA-3 forlod resultatet af cytosol overførsel mellem lymfocytter og tumorceller næsten upåvirket. Sidst men ikke mindst, for optagelse af cytosol lymfocytterne ikke behøvede at være præ-aktiveret. Naive T-celler afslørede kapacitet til at gennemgå de kontakter med tumorceller mindst i samme grad som IL-2 aktiverede eller røntgenfotograferet L23 pre-eksponerede T-celler (alle data vist i figur S3).

Udveksling af cytosol er ikke begrænset til en bestemt art og type af tumorceller

Skift til musemodel, brugte vi en meget aggressiv tumor cellelinje BM185, isoleret fra BALB /c mus, der lider fra ALL [18], for at validere universalitet af de observerede kontakt mellem T-celler og tumorceller. Udvidelsen i muse model giver desuden mulighed for

in vivo

verifikation.

Electron mikroskopi og flowcytometri analyse bekræftede de kontakter og overførsel af cytosol mellem murine T-celler og BM185 celler (Figur 2A og figur S4). Af note i modsætning til menneskelige PBMC’er, blandt bulk-murine splenocytter en brønd påviselig population af CD3

– celler afslørede kapacitet til at interagere med tumorceller resulterer i cytosol optagelse. Yderligere farvning af splenocytter med CD19 identificeret befolkningen som B-celler ved gating på CD3

– celler, som var næsten helt CD19

+ (figur 2B), mens der i overensstemmelse med resultaterne ved hjælp af humane celler, NK-celler var ikke involveret i cytosol overførsel (data ikke vist).

(A) 2×10

6 splenocytter inkuberet med 2×10

6 CMFDA-mærkede BM185 celler i 4 timer og analyseret for fluorescens optagelse af T-celler. Ligeledes til de humane PBMC’er musemodellen afslørede grønt-fluorescerende CD4

+ og CD8

+ T-celler. Derudover kunne en godt detekterbar grøn-fluorescerende population forlængelse af T-celle populationen observeres inden splenocytterne.

(B) Farvning af splenocytter med CD3 og CD19 efter udsættelse for tumorceller identificerede ikke-T-celle population stand til cytosol optagelse som B-celler.

(C) Sammendrag af fire uafhængige inkuberingsbetingelser eksperimenter af splenocytter med celler af forskellige cellelinier. BNL celler ikke tumor afledt mens de andre linjer er tumorceller.

(D) Analyse af MHC II udtryk for de respektive cellelinier BM185, KLN-205 og BNL CL.2. Niveauet af udtryk korrelerede ikke med udfaldet af cytosol overførsel

(E) I modsætning til upåvirket CD4

+ T-celler (CMFDA

-)., CD4

+ T-celler afslører en optagelse af tumor afledt cytosol (CMFDA

+) viste tegn på aktivering i henhold til forøget ekspression af CD25 og tidlig aktivering markør CD69 hvorimod CD62L faldt en smule. Celler blev inkuberet som beskrevet ovenfor (A) med efterfølgende farvning af CD4 T-celler og aktiveringsmarkører. Mønsteret af aktivering var anderledes end den stimulation med 2 ug /ml ConA.

(F) Proliferation analyse af 1×10

4 oprensede T-celler afslører CMFDA optagelse efter 4 h eksponering af splenocytter til mærkede BM185 celler. Til kontrol oprenset CD4

+ T-celler fra naive mus blev dyrket i medium, som det blev udført med sorterede T-celler i 4 dage og yderligere 16 timer med

3H-thymidin før szintilization.

Resultater er vist som repræsentative scatter-gram eller beskrives mindst 3 uafhængige forsøg som middelværdi ± SEM.

Generelt murine T-celler havde en mindre udtalt tendens til at forstyrre tumor celler i sammenligning med humane T-celler. Selv med L23 celler kun et gennemsnit på 10% CD4

+ T-celler blev grønt fluorescerende og dette kombineret med en meget høj standardafvigelse. Alligevel L23 celler inducerede den højeste optagelse af CMFDA (data ikke vist). Desuden kan andre murine cellelinjer, herunder de KLN-205 lungecarcinomaceller, embryonale BNL CL.2 leverceller, mastcytoma celler P815, J558L B celle myelomceller, C1498 myeloid tumorceller og leveren tumorcellelinier HEPA-1C1C7 og HEPA 1-6 blev testet. Med undtagelse af BNL celler, var variabel, men godt detekterbar overførsel CMFDA for de forskellige tumorceller fundet (figur 2C). Interessant, selvom permanent dividere, BNL CL.2 celler betragtes ikke som klassiske tumorceller [19]. Modstanden i BNL CL.2 celler, også tilbudt for musemodel mulighed for at validere TCR uafhængighed og tumor specificitet effekten. Vi vurderede niveauerne af MHC II-ekspression på de forskellige cellelinier. Det viste sig, at BM185 og BNL CL.2 udtrykte høje MHC II under KLN-205-celler var fuldstændigt negative for MHC II (figur 2D). TCR /MHC interaktion synes således ikke at være obligatorisk for udveksling af cytosol. Dette understreges også af overførslen af ​​cytosolen observeret mellem B-celler og tumorceller. Desuden har vi udført forsøg under anvendelse af hæmagglutinin (HA) -transduced BM185 celler og sammenlignet resultatet af cytosol overførsel efter udsættelse for vildtype (wt) BALB /c og transgene 6.5 mus. 6,5 mus har en karakteristisk befolkning på omkring 20% ​​af CD4-T-celler, der udtrykker et HA-specifikt TCR. Begge stammer afslørede en tendens til øget hyppighed af celler, der viser udvekslingen af ​​cytosol efter eksponering for BM185-HA i forhold til BM185 celler. Men splenocytter afledt af 6,5-mus ikke vise stigning hyppighed af celler, der viser udvekslingen af ​​cytosol med HA-transgene BM185 celler (Figur S5).

Men efter udsættelse for tumorceller T-celler viste, tidlige tegn på aktivering. Inkubation af splenocytter med BM185 resulterede i opregulering af aktiveringsmarkører CD25 og CD69 og marginal ændring af ekspression af CD62L i T-celler afslører en optagelse på tumorafledte cytosol henviser T-celler uden tilpasning af fluorescens viste ekspressionsniveauer af aktiveringsmarkører sammenlignes med medium inkuberet lymfocytter (Figur 2E). De fundne niveauer af CD25 på medium inkuberes og CMFDA

– T-celler skyldtes konstitutiv CD25 ekspression på regulatoriske T-celler således niveauer steget i denne baggrund var tegn på aktivering. Den vurderede aktivering af T-celler kombineres med proliferation af lymfocytterne ligesom kunne observeres med humane T-celler interagerer med L23 celler (figur 2F).

påviselig overførsel af cytosolen in vivo

Kontrollen af ​​cytosol overførsel

in vivo

er af stor interesse for at udelukke muligheden for, at cytosolen udveksling er kun på grund af en

in vitro

artefakt. Derfor blev CMFDA-mærkede BM185 celler injiceret intravenøst ​​(i.v.) i BALB /c-mus og musene blev aflivet 6 timer derefter. Efterfølgende milt, lymfeknuder og knoglemarv blev kontrolleret for BM185 celler, men kun i milten kunne påvises talrige tumorceller (data ikke vist), som blev kombineret med fremkomsten af ​​Green Fluorescent CD4

+ T-celler (figur 3A) . I tråd med

in vitro

resultater, også

in vivo

lymfocytter med affinitet cytosolen optagelse kunne findes i bestandene af CD8

+ T-celler og B-celler (figur 3B ).

(A) 1×10

7 CMFDA-mærket BM185 blev injiceret intravenøst. 6 timer senere blev musene aflivet, og milt, lymfeknuder og knoglemarv blev homogeniseret. 5×10

7-celler blev farvet for CD4 og tælles i flowcytometri og andelen af ​​grønne fluorescerende lymfocytter blev vurderet.

(B) Vurdering af fænotypen af ​​grøn-fluorescerende splenocytter 6 timer efter i.v. anvendelse af 1×10

7 CMFDA-mærket BM185. Ud over CD4

+ og CD8

+ T-celler, også

I

vivo

B-celler (B220

+ celler) afslørede CMFDA optagelse.

Resultaterne er vist som repræsentative scatter-gram 3 uafhængige forsøg.

Tumor celler holder op prolifererende efter optagelse af T-celle afledt cytosol, som fører til forlænget overlevelse af mus

strømmen af cytosol er ikke en ensrettet vej, men kan observeres i begge retninger. Således ikke kun T-celler blev grøn-fluorescerende efter eksponering for CMFDA-mærkede tumorceller, men også en del af tumorceller blev grøn-fluorescerende efter inkubation med CMFDA-mærkede lymfocytter (figur 4A). For at følge overførslen af ​​lymfocyt afledt cytosol BM185 celler blev mærket med CellVue Maroon, et farvestof, som er inkorporeret i lipid regioner af membraner med det fremhævede bemærkning af producenten af ​​minimal uspecifik overførsel mellem celler. Ved at udsætte CellVue-mærkede tumorceller til lymfocytter kunne vi påvise en positiv fraktion med CellVue induceret fluorescens på CD4

+ T-celler indikerer en overførsel af dele af cellemembranen af ​​tumorcellerne til overfladen af ​​lymfocytter (figur 4B ). Dette er overbevisende validering af indtrykket af fusionen af ​​cellemembraner som påvist ved TEM (figur 2 og figur S4).

(A) BM185 celle blev mærket med CellVue at skelne populationen af ​​tumorceller fra CMFDA-mærkede lymfocytter. Tumorceller og splenocytter blev inkuberet i lige stort antal i 4 timer og optagelse af CMFDA blev bedømt ved flowcytometri. . Længere fremme, blev BM185 adskilt ved cellesortering i ikke-fluorescerende og fluorescerende celler

(B) Vurdering af overførsel af membrankomponenter fra CellVue mærket BM185 til lymfocytter efter eksponering af celler i en ration 1: 1 til 4 h. CellVue indarbejder i lipide regioner af cellemembraner.

(C)

3H-thymidin inkorporering af BM185 celler udsat for CMFDA-mærkede splenocytter fra BALB /c og efterfølgende adskilt ved FACS cellesortering i tumorceller, der udveksles cytosol med musen lymfocytter (CMFDA

+) eller de, der forblev upåvirket (CMFDA

-). Celler blev dyrket i 3 dage i plader med 96 brønde og 16 timer efter tilsætning af radioaktivt thymidin.

(D) Overlevelse kurve af BALB /c-mus efter i.v. injektion af 1×10

4 BM185 celler (5 mus pr gruppe /eksperiment, overlevelse kurve repræsenterer to uafhængige forsøg, således n = 10) med eller uden optagelse af CMFDA efter udsættelse for CMFDA-mærkede murine splenocytter. Forløbet af BM185 fremkaldte leukæmi er yderst reproducerbar. Overlevelsen af ​​de BM185 celler uden optagelsen af ​​lymfocyt afledt cytosol svarer helt til denne kendte fald på viablitiy. I modsætning hertil mus injiceret med BM185 indarbejdet splenocytter afledt cytosol overlevede signifikant længere (p ≤ 0,0042).

Resultaterne er vist som repræsentative scatter-gram eller sammenfatter 2-4 uafhængige forsøg som middelværdi ± SEM.

Vi adskilt BM185 celler i fluorescerende og ikke-fluorescerende efter udsættelse for murine splenocytter . De isolerede tumorceller blev dyrket i 4 dage med efterfølgende vurdering af

3H-thymidin-inkorporering. Overraskende, kunne en drastisk reduktion af proliferation af BM185 celler efter absorption af lymfocyt afledt cytosol måles (figur 4C). Dette var kun en midlertidig afbrydelse af cellecyklus. 7 dages dyrkning afslørede godt detekterbar proliferation selv af tumorcellerne der undergik overførsel af cytosol (data ikke vist).

Bruddet tumor celledeling kan have mulige konsekvenser for overlevelsen af ​​BALB /c mus. Notatet BM185 celler er meget ondartet forårsager en aggressiv løbet af ALLE. Selv en lav dosis på 10

4 celler fører til døden inden for 20 dage. BM185 celler, der optrådte ikke-fluorescerende efter udsættelse for splenocytter afslørede en meget reproducerbar forløb dødelighed. I modsætning hertil mus injiceret med BM185, inkluderet cytosol fra splenocytter overlevede signifikant (p ≤ 0,0042) længere og 20% ​​af musene (to ud af ti) selv overlevede udfordringen med tumorceller (figur 4D).

T-celler udveksle cytosol specifikt med tumorceller, men ikke med sund celler

Spørgsmålet er stadig: Er dette en eksklusiv vekselvirkning af T-celler med tumorceller? Og i så fald: Er effekten begrænset til tumorcellelinjer eller gøre primære tumorceller også fremkalde dette fænomen? Sidstnævnte spørgsmål er af interesse, da cytosol overførsel med primære tumorceller vil bekræfte klinisk betydning særligt, når man overvejer, at immunsystemet aktiveres af celle kontakter med tumorceller og tumoren afslører en midlertidig anholdelse i celledeling.

som udført med murine splenocytter blev eksperimenter gentaget ved at eksponere forskellige tumorcellelinjer til humane PBMC’er. Vi valgte BM185 celler som en ekstra xenogen tumor linje, humane B-celle lymfom celler og leveren tumor HepG2. I sammenligning med L23 celler effekten var mindre markant i alle testede cellelinier. Imidlertid kunne en klar optagelse af cytosol af CD4

+ T-celler efter samdyrkning med alle tumorcellelinier observeres (figur 5A). Interessant, BM185 celler også induceres inden humane PBMC’er en tilpasning af fluorescens i 5% af CD4

+ T-celler fra bulk-PBMC ligesom med murine syngene splenocytter. Således adskiller udveksling af cytosol med L23 celler kan ikke udelukkende forklares med xenogen indstilling.

(A) Udsættelse af PBMC’er til forskellige CMFDA-mærket tumorcellelinier herunder xenogene porcin L23 celler og murine BM185 celler samt den humane B-celle lymfom T5.1 og Laz, Jurkat T-cellelinje og leverkarcinom celler HepG2. Med alle testede tumorcellelinier en overførsel af cytosol blev vurderet. I modsætning hertil humane PBMC’er udsat for raske CMFDA-mærkede PBMC’er fra samme bloddonor (syngen) eller forskellige bloddonor (allogene) viste ingen tilpasning af fluorescens.

(B) primære hepatocytter afledt af sundt væv eller HCC og HepG2-celler blev dyrket i 3 dage i Chamber Slides at opnå en løs monolag af celler. Hepatocytter blev mærket med CMFDA og inkuberet med 5×10

5 PBMC’er i 4 timer. Celler blev fikseret og lufttørret med efterfølgende farvning for CD4 (rød, kun HCC og HepG2) og kernen (blå). Mikroskopi afslørede en optagelse af grøn fluorescens af lymfocytter, hvis de udsættes for tumorceller. Yderligere farvning af CD4 bekræftede, at nogle af de deltagende celler er CD4

+ T-celler.

Resultater er vist som repræsentative billeder og scatter-gram eller opsummerer 3 uafhængige forsøg som middelværdi ± SEM (undtagen for (B ), som opsummerer mindst 6 eksperimenter).

således tumorceller inducerede udveksling af cytosol. Til at styre, hvis denne virkning var specifik for tumorceller menneskelige PBMC’er blev inkuberet med CMFDA-mærkede allogene PBMC’er eller autologe PBMC’er afledt fra raske bloddonorer. Vi fandt ikke optagelsen af ​​CMFDA sammenlignelige, når tumorceller blev anvendt (figur 5A). Notatet blev splenocytter fra Lewis rotter avlet under specificerede-patogenfri (SPF) betingelser ikke provokere tilpasning af fluorescens i menneskelige PBMC’er, også (data ikke vist).

For at udelukke, at denne effekt var forårsaget af tumorcellelinier som ofte induceret og stabiliseret med vira (som for L23 celler, [20]) primære tumorceller afledt fra human HCC blev dyrket med allogene PBMC’er. Da vi udelukket muligheden for cytosol overførsel mellem allogene donorceller, er de observerede effekter fortolkes at være relateret til tumorcellerne. Ved hjælp af mikroskopiske teknikker en kraftig optagelse af CMFDA efter udsættelse af PBMC’er til HCC celler var synlig. Som kontrol blev sunde primære humane hepatocytter inkuberet med PBMC’er som ikke inducerer en overførsel af fluorescens (figur 5B). Desuden blev resultaterne opnået med HepG2-celler i flowcytometri bekræftet i mikroskopisk analyse.

Støtte Information

Figur S1.