PLoS ONE: Androgen-Reguleret ekspression af Arginase 1, Arginase 2 og interleukin-8 i Human Prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Prostatakræft (PCA) er den hyppigst diagnosticerede kræft i nordamerikanske mænd. Androgen-deprivationsbehandling (ADT) accentuerer infiltration af immune celler i prostata. Imidlertid er de immunsuppressive veje reguleres af androgener i PCa ikke godt karakteriseret. Arginase 2 (ARG2) ekspression ved PCA celler fører til en reduceret aktivering af tumorspecifikke T-celler. Vores hypotese var, at androgener kunne regulere ekspressionen af ​​ARG2 ved PCA celler.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne rapport, viser vi, at både ARG1 og ARG2 udtrykkes af hormon-følsomme (HS ) og hormon-refraktær (HR) PCa cellelinjer, med de LNCaP-celler, der har den højeste arginase aktivitet. I prostata vævsprøver blev ARG2 mere udtrykt i normal og ikke-maligne prostatavæv sammenlignet med tumorvæv. Efter androgen stimulering af LNCaP-celler med 10 nM R1881, både ARG1 og ARG2 blev overudtrykt. Reguleringen af ​​arginase ekspression efter androgen stimulering var afhængig af androgen receptor (AR), som et siRNA rettet behandling AR hæmmede både ARG1 og ARG2 overekspression. Denne observation blev korreleret

in vivo

hos patienter med immunhistokemi. Patienter, der behandles af ADT før operation havde lavere ARG2 udtryk i både ikke-maligne og maligne væv. Endvidere ARG1 og ARG2 var enzymatisk aktivt og deres nedsatte ekspression ved siRNA resulterede i reduceret samlet arginase aktivitet og L-arginin metabolisme. Den faldt ARG1 og ARG2 udtryk også oversat med formindsket LNCaP celler celle vækst og øget PBMC aktivering efter udsættelse for LNCaP celler konditioneret medie. Endelig fandt vi, at interleukin-8 (IL-8) blev også opreguleret efter androgen stimulering, og at den direkte forøgede ekspression af ARG1 og ARG2 i fravær af androgener.

Konklusion /Signifikans

Vores data giver den første detaljerede

in vitro

in vivo

hensyn til en androgen-reguleret immunosuppressiv vej i human PCa gennem ekspression af ARG1, ARG2 og IL-8.

Henvisning: Gannon PO, Godin-Ethier J, Hassler M, Delvoye N, Aversa M, Poisson AO, et al. (2010) Androgen-reguleret ekspression af Arginase 1, Arginase 2 og interleukin-8 i human prostatacancer. PLoS ONE 5 (8): e12107. doi: 10,1371 /journal.pone.0012107

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Marts 17, 2010; Accepteret: 6 juli 2010; Udgivet: 11 August, 2010

Copyright: © 2010 Gannon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev understøttet af en Sanofi Aventis forskningsbevilling (FS), af en canadisk Uro-Oncology Group /AstraZeneca forskningspris (FS) og ved en bevilling fra Prostata Cancer Research Foundation of Canada (RL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, udveksling af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Endvidere F.S. holder University of Montreal Chair i prostatakræft. R.L. understøttes af et fællesskab fra Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ). P.O.G. er en modtager af en Ph.D. studentship fra FRSQ og modtaget yderligere støtte fra Institut du kræft de Montréal /Canderel stipendium og fra Molekylær Biologi program Université de Montréal

Konkurrerende interesser:. Dette projekt blev finansieret delvist af en Sanofi Aventis forskning tilskud (FS) og af en canadisk Uro-Oncology Group /AstraZeneca forskningspris (FS). Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den hyppigst diagnosticerede kræft og tredje hyppigste årsag til kræft relaterede dødsfald for Nordamerikanske mænd [1]. Prostata er organogenese og carcinogenese afhængige af tilstedeværelsen af ​​androgener [2]. Som sådan er den mest almindelige behandlingsmodalitet for mænd med et fremskredent stadium eller tilbagevendende PCa er androgen-deprivation terapi (ADT). ADT fører til apoptose af hormon følsomme prostata epitelceller [3]. Desværre, inden for et til fem år efter ADT indvielse, de fleste patienter udvikler hormon refraktær PCa (HRPC), hvis behandling fortsat palliativ [4]. Nye behandlingsmodaliteter, såsom immunterapi, forsøg på at tackle disse senere faser af PSA. Imidlertid har de nuværende immunterapier mod PCa medført begrænset succes i de kliniske omgivelser. En detaljeret forståelse af tumoren immunologiske mikromiljø i patienter med prostatacancer skal give ny indsigt i, hvordan at forbedre de nuværende immun-baserede protokoller.

De seneste data viser, at forskellige immunosuppressive mekanismer er til stede i prostata og kan hæmme anti- tumoral immunrespons i forbindelse med en immunterapi (revideret i [5]). Arginase 2 (ARG2) udtrykkes i human PCa [6] og dets hæmning, samtidig med iNOS, øger aktiveringen af ​​tumor-infiltrerende lymfocytter (tils) [7]. Mens de immunsuppressive egenskaber arginases gennem metabolismen af ​​L-arginin er veldokumenteret (gennemgået i [8]), regulering af human arginase ekspression, er imidlertid i øjeblikket udefineret.

Androgener vides at have immunsuppressive egenskaber , hvilket illustreres af intra-prostata inflammation efter ADT [9], [10]. Genekspression analyser og murine undersøgelser antyder, at androgener regulerer ekspressionen af ​​ARG2 og andre enzymer af polyaminen pathway [11], [12], [13]. Således overvejer de grundlæggende roller androgener i prostata carcinogenese og i skulptur af prostata er mikromiljø, vi vurderet om androgener kunne regulere ekspressionen af ​​arginases ved PCA celler

in vitro

in vivo

.

I denne undersøgelse rapporterer vi, at PCA cellelinjer udtrykker både funktionelt aktiv ARG1 og ARG2. Interessant, hormon følsom (HS) og hormon refraktær (HR) væv udtrykte mindre ARG2 end ikke-maligne væv. I HS LNCaP-cellelinien, androgen stimulering førte til forøget ekspression af både ARG1 og ARG2 i et androgen receptor (AR) afhængig måde. Denne androgen-reguleret ekspression blev også observeret i den primære tumor for ADT-behandlede patienter, der udtrykte mindre ARG2 i både den ikke-maligne væv støder op til tumoren og tumorvæv sammenlignet med kontrolpatienter. Endelig har vi opdaget, at IL-8 også blev reguleret af androgener under kontrol af AR, og deltog i reguleringen af ​​ARG1 og ARG2 udtryk. Sammenlagt vores data giver den første detaljerede

in vitro

in vivo

hensyn til en androgen-reguleret immunosuppressiv vej i human PSA.

Resultater

ARG1 og ARG2 udtryk i PCa

Vi først evalueret arginases udtryk fra PCA cellelinjer og kliniske prøver. Vores data viser, at PCA cellelinjer udtrykker både ARG1 og ARG2. Genekspression analyser af qPCR viste, at

ARG1

mRNA var mere rigelige i 22Rv1 cellelinje (figur 1A), mens ARG1 protein blev lidt mere udtrykt af to HR PCA cellelinjer (DU145 og PC3) end i LNCaP-celler (figur 1B, bund panel). ARG1 proteinekspression korrelerede ikke med genekspression analyse antyder en mulig post-transkriptionel regulering. Som for ARG2 udtryk, LNCaP cellelinie udtrykte de højeste niveauer af

ARG2

mRNA (figur 1A). Low

ARG2

mRNA-ekspression blev påvist i to HR cellelinier DU145 og PC3 forhold til de to HS PCA cellelinier. ARG2 protein overflod korreleret med qPCR resultater med LNCaP-celler, der udtrykker signifikant mere ARG2 end de andre tre cellelinier (figur 1B, nederste panel). Endvidere LNCaP-celler havde den højeste arginase aktivitet antyder, at ARG2 er den dominerende enzym med hensyn til arginase aktivitet af PCA-celler (figur 1B, top panel).

PCA cellelinier (LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC3) blev opretholdt i RPMI suppleret med 10% FBS. A) genekspression af

ARG1

(venstre panel) og

ARG2

(højre panel). Mean relative ekspression (n = 3) med standardfejl på middelværdien (fejlmargener). B) Overfyld: Arginase aktivitet af PCA-cellelinjer kvantificeret i mU /mg protein. Bundplade: Western blot af ARG1 og ARG2. Ran tjente som lastning kontrol. C) repræsentativt billede af immunhistokemi farvning af ARG2 ekspression i prostatavæv. Bemærk, at ekspressionen af ​​ARG2 var begrænset til epitelcellerne uden stromale farvning. D) Kvantificering af ARG2 ekspression ved immunhistokemi i prostata prøver. * Statistisk signifikant forskel i ARG2 ekspression mellem PIN- og HR væv (p = 0,033, Mann-U). ** Statistisk signifikant forskel i ARG2 ekspression mellem tumorvæv og normalt væv (p 0,001, Mann-U), ikke-maligne væv støder op til tumor (p 0,01, Mann-U) og PIN væv (p 0,001, Mann- U).

Ekspression af ARG2 protein blev evalueret i kliniske prøver ved immunhistokemi på tre forskellige væv mikro-arrays (TMAS) omlægning prostata prøver fra en kohorte af 99 PCA patienter og 50 normal prostata fås fra obduktioner. Vi har ikke vurdere ARG1 protein udtryk som, i vores hænder, anti-arg1 testede antistoffer var ikke egnet til immunhistokemi på arkiverede formalin-fikserede paraffin-indstøbt væv. Vi observerede, ARG2 ekspression var begrænset til prostata epitel og fraværende fra stroma (figur 1C). ARG2 var statistisk signifikant mindre udtrykt i tumorvæv sammenlignet med normale (p 0,001, Mann-U), til ikke-malign normale tilstødende (p 0,01, Mann-U) og prostata intraepitelialneoplasi (PIN) væv (p 0,001 , Mann-U) (figur 1D). HR væv udtrykte også mindre ARG2, selv om kun signifikant forskellig fra PIN væv (p = 0,033, Mann-U). Der var ingen sammenhæng mellem ARG2 udtryk inden for de normale tilstødende og tumorvæv (tabel S1). Endelig har vi vurderet hvis ARG2 ekspression korrelerede med klinisk-patologiske parametre såsom Gleason score, præoperativ prostataspecifikt antigen (PSA) niveauer og biokemisk tilbagefald. Vores resultater viser, at ARG2 ekspression inden for den normale tilstødende væv omvendt korreleret med vesikel skelsættende invasion (tabel S1). Alt i alt er disse

in vitro

in vivo

data viser forskellen udtryk for ARG1 og ARG2 mellem forskellige stadier af PCa progression, uafhængigt af HR-status.

androgen- reguleret udtryk for ARG1 og ARG2

Den differentielle udtryk for ARG1 og ARG2 mellem HS og HR PCA cellelinjer førte os til at undersøge de lovgivningsmæssige roller androgener i arginase udtryk. For at gøre dette, vi evaluerede arginases gen og protein-ekspression efter androgen stimulering.

ARG1

mRNA-ekspression blev ikke statistisk signifikant opreguleret i enten LNCaP eller 22RV1 cellelinjer følgende R1881 stimulering (figur 2A). Men i LNCaP celler,

ARG2

mRNA ekspression blev forøget ved 48 timer (p = 0,002, Mann-U) og 72 timer (p = 0,016, Mann-U) efter R1881 stimulering (Venstre panel, Figur 2B). Overekspressionen af ​​

ARG2

i 22RV1 var ikke statistisk signifikant (p = 0,248, Mann-U) (Højre panel, figur 2B). Faktisk

ARG2

ekspression korrelerede med højere androgen følsomhed LNCaP-celler sammenlignet med 22RV1 (fig S1A). Som sådan blev LNCaP-celler anvendt til yderligere eksperimenter. Der bekræfter PCR-data, Western blots fra LNCaP celler viste, at R1881 stimulering øgede ARG2 proteinekspression (Figur 2C). Interessant, selv om der blev observeret nogen signifikante ændringer i

ARG1

mRNA-ekspression i LNCaP celler behandlet med R1881, ARG1 proteinekspression blev væsentligt forøget. Vi har ikke observere eventuelle stigninger i ARG1 eller ARG2 proteinekspression i DU145 og PC3 stimuleret med 10 nM R1881 (figur S1B).

AB) LNCaP celler (venstre paneler) og 22RV1 (højre paneler) blev stimuleret i løbet af en periode på 72 timer med 10 nM R1881 efter en 72 timers inkubationstid i kul-strippet medier og genekspression af a)

ARG1

og B)

ARG2

analyseret af qPCR. Kontrol (lyse grå søjler) og R1881-stimulerede (sorte søjler). * Statistisk signifikant forskel (p 0,05, Mann-U). Den gennemsnitlige relative udtryk (n = 4) med standard fejl (fejl barer). C) Øget protein udtryk for både ARG1 og ARG2 efter R1881 stimulering af Western blot. LNCaP-celler blev stimuleret med 10 nM R1881 som beskrevet tidligere. PSA tjente som positiv kontrol. Repræsentativt eksperiment, (n = 6). D) Hæmning af AR aktivitet med bicalutamid (bicalutamid). LNCaP-celler blev stimuleret med R1881 i 72 timer som beskrevet tidligere i nærvær af stigende doser af bicalutamid (0, 10, 20 og 40 uM). ARG1 og arg2 ekspressionsniveauer blev evalueret ved Western blot. Repræsentativt forsøg er vist, (n = 3). Bemærk agonisten virkning af bicalutamid i fravær af R1881 vist ved en forøget PSA og ARG2 ekspression. E) Inhibering af AR ekspression ved siRNA. LNCaP-celler blev transficeret som beskrevet tidligere. AR, blev arg1 og ARG2 ekspressionsniveauer vurderet ved Western blot. Repræsentativt forsøg er vist, (n = 4). F) Arginase aktivitet blev kvantificeret i mU /mg af proteiner. LNCaP-celler blev transficeret med siCTRL (lysegrå søjler) eller Siar (sorte søjler) og derefter stimuleret med R1881 i 72 timer som beskrevet tidligere. Repræsentant eksperiment, (n = 3).

AR er impliceret i ARG1 og ARG2 udtryk

Som vores resultater tyder på, at androgener regulerer arginase udtryk, vi evaluerede bidrag AR . Vi inhiberede AR aktivitet med det ikke-steroide anti-androgen bicalutamid (Casodex) (figur 2D). Vi bemærkede en nedsat ekspression af ARG1 med den højeste koncentration (40 uM) af bicalutamid følgende R1881 stimulering. Androgen induktion af ARG2 blev ikke blokeret, selv ved den højeste koncentration af bicalutamid. Som tidligere dokumenteret [14], bemærkede vi, at bicalutamid havde AR-agonist aktivitet i LNCaP celler dyrket i fravær af androgener. Der var en R1881-uafhængig induktion af PSA og ARG2 ekspression i LNCaP-celler stimuleret med 20 pM og 40 pM af bicalutamid i fravær af androgener. I denne samme tilstand, bicalutamid forårsagede et fald i ARG1 ekspression. Disse resultater antyder, ARG1 ekspression kan være mere følsomme over AR inhibering end ARG2, hvis ekspression blev induceret ved agnostiske virkning af AR inhibitor.

Vi besluttede at yderligere inhibere AR ved at blokere AR-ekspression i LNCaP-celler hjælp siRNA. Tilstedeværelsen af ​​siRNA mod AR resulterede i en signifikant inhibering af AR ekspression og i en reduceret PSA ekspression efter R1881 stimulering (figur 2E). Både ARG1 og ARG2 induktion efter R1881 stimulering blev inhiberet af siRNA behandling, som oversat i mangel af en opregulering i arginase aktivitet (figur 2F). Disse resultater tyder på, at AR regulerer ekspressionen af ​​ARG1 og ARG2

in vitro

og at ARG1 og ARG2 har en anden følsomhed over for AR hæmning.

Formindsket ARG2 udtryk i PCA patienter efter ADT

Baseret på vores

in vitro

data, vi hypotese, at androgener kan modulere ARG2 proteinekspression i PCA patienter så godt. Vi observerede, at sammenlignet med kontrol kræftpatienter (kirurgi kun), ADT-behandlede patienter (ADT før operation) havde signifikant lavere ARG2 ekspression i både de ikke-maligne væv støder op til tumoren (46,4 vs. 23,5 relative enheder; p 0,001 , Mann-U) og tumorvæv (41,7 vs 31,5 relative enheder; p 0,01, Mann-U) (figur 3A). Vi bemærkede også, at androgen deprivation

in vitro

kunne falde ARG2, men ikke ARG1 proteinekspression, i LNCaP og 22RV1 celler dyrket i syv dage i fravær af androgener (figur 3B). Tilsammen disse resultater tyder på, at androgener regulere ekspressionen af ​​ARG2

in vivo

i PCA patienter som ADT reducerer ARG2 udtryk.

A) Analyse af androgen-regulerede ARG2 udtryk i PCA patienter ved immunhistokemi . patienter Kontrol (lysegrå søjler, n = 40) og ADT-behandlede patienter (sorte bjælker, n = 35). B) Nedsat ARG2 proteinekspression i fravær af androgener

in vitro

bestemt af Western blot. Ran tjente som lastning kontrol. PCA-cellelinier (LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC3) blev opretholdt i RPMI 10% FBS eller i RPMI suppleret med 10% trækul strippet FBS i 7 dage (n = 3). Bemærk, at ARG1 udtryk ikke variere, men at ARG2 blev reduceret i LNCaP og 22Rv1 celler i fraværet af androgen.

ARG1 og ARG2 er metabolisk aktive

For at vurdere, om ARG1 og ARG2 udtrykt af LNCaP-celler blev metabolisk aktiv, inhiberede vi ekspressionen af ​​enten ARG1 eller ARG2 af siRNA. Sammenlignet med en siCTRL, både siRNA signifikant inhiberet ARG1 eller ARG2 ekspression (figur 4A). Inhibering af enten ARG1 eller ARG2 resulterede i formindsket arginase enzymatisk aktivitet (figur 4B). Ved HPLC, vi derefter fastsat virkningen af ​​hæmning af ARG1 og ARG2 udtryk på metabolismen af ​​L-arginin med LNCaP celler. Fraværet af enten ARG1 eller ARG2 førte til højere koncentrationer af L-arginin i de konditionerede medier tyder en lavere metabolisme af L-arginin ved LNCaP-celler (figur 4C). Desuden har vi bemærket, at R1881 stimulering førte til en nedsat koncentration af ekstracellulær L-arginin, hvilket bekræfter vore resultater demonstrerer en forøget arginase ekspression efter androgen stimulering. Vi evaluerede ekspressionen af ​​nitrogenoxidsyntase (NOS), også kendt for at metabolisere L-arginin. Men vi ikke observere udtryk for iNOS eller nNOS (protein) samt ingen produktion af NO (funktion) i vores model (data ikke vist).

LNCaP celler blev transficeret med enten en siCTRL eller en cocktail af tre siRNA mod ARG1 eller ARG2. Efter transfektion (24 timer) blev cellerne udpladet i kul-strippet serum suppleret medier i 72 timer og derefter stimuleret i 72 timer med 10 nM R1881. A) siRNA inhibering af ARG1 og ARG2 ekspression blev vurderet ved Western Blot. Repræsentativt forsøg er vist, (n = 4). B) Nedsat arginase aktivitet efter transfektion med siARG1 eller siARG2 i LNCaP-celler. Den tilsvarende Western blot er vist i det nederste panel. Repræsentativt forsøg er vist, (n = 3). C) Nedsat metabolisme af L-arginin i fravær af arginase ekspression. Konditionerede medier af LNCaP-celler transficeret med siCTRL, siARG1 eller siARG2 blev analyseret ved HPLC for L-arginin koncentration. De konditionerede medier analyseret ved HPLC var fra LNCaP-celler vist i figur 4A. * Statistisk signifikant forskel (p 0,05, Mann-U). D) Nedsat proliferation af LNCaP-celler i fraværet af arginase ekspression. LNCaP-celler blev transficeret som beskrevet tidligere. Proliferation blev målt ved celletælling 96 timer efter transfektion. * Statistisk signifikant forskel (p 0,05, Mann-U), (n = 3). E) Hæmning af arg2 udtryk medfører øget PBMC proliferation og aktivering. PBMC’er fra normale donorer blev aktiveret med anti-CD3 (OKT3, 1 ug /ml) med eller uden IL-2 i nærvær af frisk medium eller konditionerede medier af LNCaP-celler transficeret med enten kontrol, siCTRL, siARG1 eller siARG2 som tidligere beskrevet. Kontrol- PBMC’er inkuberedes med IgG isotypekontrol (1 ug /ml) og med PBS i stedet for IL-2. Venstre panel: PBMC proliferation blev kvantificeret ved BrdU-inkorporering efter 120 timers OKT3 og IL-2-stimulering. Mean absorbans (n ​​= 4) er vist med standard fejl (fejl søjler). Højre panel: PBMC sekretion af IFN-γ kvantificeret ved ELISA. Samme forsøg som tidligere beskrevet, men PBMC’erne blev aktiveret i 24 timer uden IL-2. Repræsentant udtryk er vist (n = 4) med standardafvigelse på middelværdien (fejllinjer).

Som arginases er impliceret i polyaminsyntese pathway nødvendig for cellulær proliferation, vi evaluerede virkningen af ​​ARG1 og ARG2 på cellevækst. Vi observerede, at inhibering af enten ARG1 eller ARG2 ekspression resulterede i en lavere proliferation af LNCaP-celler opretholdt i komplette medier (p = 0,02 og p = 0,01 for henholdsvis siARG1 og siARG2) (figur 4D). Endvidere for at undersøge, om ARG1 og ARG2 ekspression ved LNCaP-celler påvirkede deres immunundertrykkende potentiale, PBMC’er fra raske donorer blev aktiveret i nærvær af konditioneret medium fra LNCaP + siCTRL eller LNCaP + siARG1 eller LNCaP + siARG2. Hæmning af enten ARG1 eller ARG2 oversat til øget PBMC proliferation som kvantificeret ved BrdU inkorporering (figur 4E, venstre panel). Denne forøgede proliferation var forbundet med en forhøjet IFN-γ-sekretion fra PBMC’er som målt ved ELISA (figur 4E, højre panel). Ingen signifikante forskelle i sekretionen af ​​IL-2 eller IL-10 blev observeret (data ikke vist). Endelig har vi vurderet om ARG2 ekspression korreleret med immun celleinfiltration af den primære tumor, som vi for nylig offentliggjort [10]. Vi bemærkede, at ARG2 ekspression omvendt havde korrelerer med infiltrering af T-lymfocytter og makrofager i prostata (tabel S2). Kollektivt antyder disse resultater, at ARG1 og arg2 udtrykkes af LNCaP-celler er enzymatisk aktive og deltage i vigtige fysiologiske processer, såsom cellulær proliferation og tumor-afledt immunsuppression.

IL-8 induktion af ARG1 og ARG2 ekspression

som arginases er veldokumenteret at deltage i sculpting af tumoren immunologisk mikromiljø [15], og at cytokiner er kendt for at inducere arginase ekspression i murine modeller [16], vi vurderet om cytokiner også kunne regulere arginase ekspression i human PCa . Den cytokinekspression profil LNCaP-celler stimuleret med 10 nM R1881 blev kvalitativt evalueret under anvendelse af en Proteome Profiler cytokin array (R & D Systems) (figur 5A). Proteomik-data illustreret, at R1881-stimulerede LNCaP-celler var forøget ekspression af IL-8 og Serpin E1 (fig S2A). Vi undersøgte yderligere rolle af IL-8 i arginase udtryk som IL-8 er for nylig blevet forbundet med ekspressionen af ​​androgen-regulerede gener i PCa [17]. Vi kvantificerede derfor den forhøjede ekspression af IL-8 i LNCaP-celler efter R1881 ekspression (figur 5B). Denne IL-8-induktion var afhængig af AR som inhibering af AR-ekspression ved siRNA forhindrede IL-8 sekretion efter androgen stimulation (figur 5C). Vi evaluerede derefter, om inhibering af IL-8 kunne mindske ARG1 og ARG2 ekspression efter R1881 stimulering. Ved hjælp af en siRNA mod IL-8, kan vi markant mindske IL-8 sekretion (figur 5D). Dette reducerede IL-8-produktion var forbundet med en reduktion af ARG1 og arg2 24 timer efter R1881 stimulering (figur 5E). Behandlingen af ​​LNCaP-celler med siIL-8 også oversat til et fald i arginase aktivitet (figur S2B). Endelig har vi stimulerede androgen-berøvet LNCaP celler med stigende koncentration af eksogen IL-8 i 72 timer og overvåges udtryk for ARG1 og ARG2. Ved Western blot-analyse, observerede vi, at både 50 ng /ml og 100 ng /ml IL-8-induceret ekspression af ARG1 og ARG2 sammenlignet med kontrolpatienter LNCaP-celler (figur 5F). Faldet i ARG1 og ARG2 proteinekspression med 250 ng /ml IL-8 korrelerede med IL-8-induceret cellulær toksicitet. Vi observerede også en induktion af

ARG2

, men ikke

ARG1

, genekspression efter en 24 timers stimulering (figur S2C). Endelig, som det var tidligere rapporteret, at phenolrødt kunne aktivere AR [18], vi stimulerede også LNCaP-celler med IL-8 i phenolrødt-frit RPMI-medier. Disse kontrol eksperimenter viste, at IL-8-afhængig induktion af ARG1 og ARG2 kunne forekomme i fravær af phenol rød (Figur S2D). Taget sammen dataene klart viser, at androgener regulere ekspressionen af ​​IL-8, som i sig selv kan inducere ekspression af både ARG1 og ARG2.

Evaluering af cytokinekspression profil LNCaP-celler efter R1881 stimulering. A) Konditionerede medier af LNCaP celler stimuleret som beskrevet tidligere blev analyseret med en Proteome Profiler ™ (R & D Systems). B) Konditionerede medier af LNCaP-celler stimuleret med tiden med enten ethanol kontrol (lysegrå søjler) og R1881 (sorte søjler) blev analyseret for produktion af IL-8 ved ELISA. Den repræsentativt eksperiment viste blev udført med den samme konditioneret medium anvendt til Proteome Profiler analyse i 5a, (n = 3). C) Kvantificering af IL-8-sekretion af LNCaP-celler transficeret med Siar og stimuleret med R1881 som beskrevet tidligere. Repræsentativt forsøg er vist, (n = 3). D) Kvantificering af IL-8-sekretion af LNCaP-celler transficeret med siIL-8 og stimuleret med R1881 som beskrevet tidligere. Repræsentativt forsøg er vist, (n = 3). For 5b og 5c, var der ingen IL-8 sekretion detekteret i fravær af R1881 stimulering. E) Ekspression af ARG1 og ARG2 i LNCaP-celler efter transfektion af siIL-8 og R1881 stimulering i 24 timer. Repræsentativt forsøg er vist, (n = 3). F) LNCaP-celler blev udpladet i kul-strippet serum suppleret medier i 72 timer og i 24 timer i serumfrit RPMI. Celler blev derefter stimuleret i 72 timer med 10 nM R1881 eller med 50, 100 eller 250 ng /ml IL-8 i serumfrit RPMI. ARG1 og arg2 ekspressionsniveauer blev påvist ved Western blot. Repræsentativt eksperiment, (n = 3). Bemærk induktion af både ARG1 og ARG2 ved 50 og 100 ng /ml IL-8-koncentration i fravær af R1881.

Diskussion

En mere grundig forståelse af prostata immunologiske microenvironment mekanismer kan forbedre den kliniske effekt af de nuværende immunterapier mod PSA. Vi og andre har vist, at adt fører til drastiske ændringer i prostata immunologiske mikromiljø [9], [10]. Den arginase pathway deltager i udviklingen af ​​en immunosuppressiv stat inden den primære tumor af PCA patienter [7]. Men reguleringen af ​​arginase udtryk ved PCA celler forbliver udefineret.

I denne rapport, vi observeret, at androgener inducerede udtryk for både ARG1 og ARG2 i HS PCA cellelinjer. AR blev impliceret i denne forordning, da både bicalutamid og Siar transfektion forhindret ARG1 og ARG2 overekspression efter R1881 stimulering. Omvendt androgen deprivation og ADT reducerede ARG2 udtryk

in vitro

i den primære tumor af PCA patienterne. LNCaP-celler udtrykte enzymatisk funktionelle ARG1 og ARG2 som, når deres proteinekspression blev inhiberet, forårsagede et fald i cellulær proliferation og i deres immunsuppressive potentiale. Endelig viste vi, at IL-8 også blev reguleret af R1881 og kunne stimulere ekspressionen af ​​ARG1 og ARG2 uafhængigt af androgen. Alt i alt, vores resultater giver den første mekanistiske tegn på en androgen-drevet immunosuppressiv vej i PCa gennem ekspression af ARG1, ARG2 og IL-8 ved PCA celler.

Vi viser, at PCA celler udtrykker både ARG1 og ARG2. ARG2 blev overvejende udtrykt af HS PCA cellelinjer og af ikke-maligne prostata væv. Disse resultater bekræfter offentliggjorte data, der beskriver en lavere ARG2 ekspression i androgen-ufølsom PCA cellelinjer (DU145 og PC3) og i tumoren og HR væv af PCA patienter [6], [19]. Men for at vi ved, vi er den første gruppe til at studere ekspressionen af ​​ARG1 ved PCA celler og definere mekanistiske konsekvenser fører til sin androgen-reguleret induktion. Svarende til ARG2, inhibering af ARG1 ekspression førte til nedsat tumorcelleproliferation, reduceret L-arginin metabolisme og reduktion af deres immunundertrykkende potentiale. Baseret på proteinekspression (figur 1B, nederste panel) og på arginase aktivitet af PCA-celler (Figur 1B, top panel), vores data antyder, at ARG2 alligevel kan have en mere fremtrædende rolle end ARG1 i arginase aktivitet potentiale PCA-celler [20].

Desuden viste vores data, at ARG1 og ARG2 forskelligt blev reguleret af androgener. I modsætning til ARG2 genet og proteinekspression, vi tydeligt vist, at genet og protein ekspression af ARG1 ikke korrelerer. Dette antyder, at androgener kan påvirke en post-transkriptionel regulering af ARG1 som det tidligere blev rapporteret i Xenopus [21], og i gær-modeller [22]. Da ARG2 ekspression er lokaliseret til mitokondrierne, vi vurderet om cellulær proliferation uafhængig af androgener kunne inducere ARG2 ekspression i LNCaP-celler. I et proliferationsassay med EGF i stedet for R1881, blev der ikke ARG2 induktion observeret (data ikke vist). Kollektivt, vores resultater viser, at selv om begge fremkaldt af R1881, de signalveje, der fører til ARG1 og ARG2 udtryk er forskellige for de to enzymer og skal undersøges nærmere.

Implikationen af ​​en androgen-reguleret udtryk for ARG1 og ARG2 i prostata carcinogenese kræver yderligere undersøgelser. Arginase udtryk og polyaminsyntese er forhøjet i PCa [23], [24] og i forbindelse med tumor kvalitet [25]. En høj arginase aktivitet korrelerer med øget proliferation af brystcancer [26], tyktarmskræft [27] og nyre cellelinier [28]. observerede imidlertid, at tumor- eller HR væv udtrykker mindre ARG2 end ikke-maligne væv. Det er muligt, at tumorceller ikke erhverver udtryk for disse enzymer som et middel til yderligere at udnytte deres immunosuppressiv potentiale, en aspekt forbundet med tumor progression. Faktisk da prostata er organet med det højeste polyamin produktion, kan arginase ekspression ved prostatacellerne forud for udviklingen af ​​cancer, som polyamin produktion er afgørende for proliferation af prostataceller. Således kan det immunsuppressive fordel, prostata celler være sekundær til den proliferative rolle, som arginases spillede. Fra vores data og andres, vi hypotesen, at arginase kan være impliceret i de tidligere hormon-følsomme stadier af prostata carcinogenese ved at fremme kræft celledeling og udvikling af en androgen-reguleret immunosuppressive miljø.

Endelig har vi observeret, at IL-8 blev opreguleret efter androgen stimulering og kunne inducere ekspressionen af ​​ARG1 og ARG2. IL-8 medierer sine virkninger gennem aktivering af to høj affinitet G-proteinkoblede receptorer, CXCR1 og CXCR2 [29], som begge udtrykkes af LNCaP-celler [30], [31]. Det er vigtigt at bemærke, at ekspression af ARG1 og ARG2 efter IL-8-stimulering blev ikke så kraftigt som med R1881 stimulation antyder, at andre androgen-regulerede veje kunne være involveret.