PLoS ONE: Immunhistokemi for Myc forudser overlevelse i kolorektal Cancer

Abstrakt

MYC overekspression som bestemt ved molekylære midler er blevet rapporteret som en gunstig prognostisk biomarkør i kolorektal cancer (CRC). Men MYC udtryk analyse er ikke tilgængelig i den rutinemæssige kliniske omgivelser. Vi undersøgte, om immunhistokemi (IHC) for myc-proteinet ved anvendelse af en hidtil ukendt kommercielt tilgængeligt kanin-monoklonalt antistof [klon Y69], som i øjeblikket er i udbredt klinisk anvendelse til lymfom diagnose kunne anvendes til at forudsige udfaldet i resekterede CRC. Myc IHC blev udført på en væv microarray (TMA), der omfatter en retrospektiv kohorte af 1421 CRC patienter og afsluttet blindet, at alle kliniske og patologiske data. IHC blev også udført på en subcohort af hele afsnit CRC’er at vurdere farvning egenskaber og konkordans med TMA udtryk. MYC overekspression blev fundet i 980 (69%) af CRCs og var forbundet med tumor stadium og DNA mismatch reparation /BRAF status. Der var betydelig enighed mellem TMA og hele afsnittet myc IHC (kappa = 0,742, p 0,01). CRC’er med MYC overekspression demonstrerede forbedret 5-års overlevelse (93,2% vs. 57,3%), med den virkning betydeligt moduleres af den dominerende effekt af tumor stadie, alder ved diagnose og lymphovascular plads invasion status på overlevelse. Vi konkluderer, at myc status som bestemt ved IHC alene kan bruges til at forudsige den samlede overlevelse hos patienter med CRC gennemgår kirurgisk resektion

Henvisning:. Toon CW, Chou A, Clarkson A, DeSilva K, Houang M, Chan JCY et al. (2014) Immunhistokemi for Myc forudser overlevelse i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (2): e87456. doi: 10,1371 /journal.pone.0087456

Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Oktober 4, 2013; Accepteret: December 27, 2013; Publiceret: 4 februar 2014

Copyright: © 2014 Toon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Patologi North Personale Specialist Trust Fund. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Christopher W. Toon er ansat af Histopath Pathology. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere

Introduktion

dysregulering af MYC (HGNC: 7553). er en tidlig konsekvens af aktiverende mutationer i APC (HGNC: 583), en vigtig drivkraft mutation i adenom-carcinom vej i kolorektal cancer (CRC). Medieret af beta-catenin via den kanoniske Wnt pathway, afvigende overekspression af MYC og cyclin D1 resulterer i ukontrolleret celleproliferation, der giver en vækstfordel til cancerceller [1], [2]. Rolle MYC overekspression i kørsel CRC tumorigenese er blevet bekræftet af genekspression profilering undersøgelser [3], og mere for nylig af CRC genom-dækkende analyse som en del af initiativet Cancer Genome Atlas netværk [4].

Interessant MYC overekspression, som bestemt ved Northern blot-analyse blev rapporteret som en biomarkør for godt resultat i kolorektal cancer så langt tilbage som 1996. [5] i øjeblikket dets anvendelse som en prognostisk biomarkør er vanskeligt at begrunde grund af den begrænsede tilgængelighed og omkostninger involveret i molekylær test. Derfor teste for MYC overekspression i CRC er i øjeblikket ikke tilgængelig, mulig eller berettiget i den rutinemæssige kliniske omgivelser.

For nylig en roman yderst følsom og specifik kanin monoklonalt antistof rettet mod myc protein (klon Y69) er blevet rådighed. Dette antistof er blevet valideret i rutinemæssig klinisk indstilling i formalinfikseret paraffinindlejret væv, hvor myc immunohistochemsitry i kombination med BCL2 immunhistokemi, er blevet anvendt til at identificere den dårlige prognostiske undergruppe af non-Hodgkin lymfom kendt som ‘double hit lymfom’. [6], [7] Faktisk MYC og BCL2 udtryk som bestemt af immunohistochemsitry i formalin fikseret paraffinindlejret væv er hurtigt blevet en del af den rutinemæssige diagnostiske vurdering af patienter med høj kvalitet B-celle lymfom. [8].

Vi søgte at revidere brugen af ​​MYC udtryk som biomarkør i CRC ved at korrelere resultatet med MYC udtryk bestemt efter denne bredt tilgængelige kanin monoklonalt antistof.

Materialer og metoder

Vores CRC kohorte er tidligere blevet beskrevet. [9] Kort fortalt blev retrospektive CRC sager rekrutteret ved at søge i databasen for Institut for Anatomisk Patologi, Royal North Shore Hospital, Sydney patologi for patienter, som havde endelige operationer for CRC mellem 2004 og 2009. I denne periode dette center udført centraliseret patologisk test for to kvaternære hospitaler med dedikerede kolorektale kirurgi enheder og 4 community hospitaler. denne patient kohorte repræsenterer derfor et sandt øjebliksbillede af CRC tilfælde stødt på i det australske samfund som helhed.

Eksklusionskriterier var tumorer af ekstra-colon og appendiceal placering, tumorer behandlet udelukkende endoluminalt og histologiske typer bortset adenocarcinom defineret af WHO 2010-systemet. [10].

Tumorer blev uafhængigt gennemgået af tre patologer (CT, KDS og AG) for at bekræfte diagnosen og for at genopsætte tumorer ifølge 7

th udgave 2009 AJCC /TNM. [11] For resektioner involverer synkrone tumorer, tumoren med den højeste patologisk stadium blev udvalgt og kommenteret. Tissue microarrays (TMA) indeholdende to eksemplarer 1 mm kerner blev derefter konstrueres ud fra tilgængelige tumor vævsblokke

Immunhistokemi blev udført på den TMA under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kanin-anti-myc antistof (klon Y69, kat:. Ab32072, Abcam, Burlingame CA USA) under anvendelse af Leica BondIII autostaineren (Leica Microsystems, Mount Waverley, Victoria, Australien) ifølge fabrikantens protokol. Glassene blev afvokset i Bond afvoksning løsning (AR9222, Leica Microsystems) og hydreret i Bond Wash løsning (AR9590, Leica Microsystems). Heat epitopgenfinding blev udført i 60 minutter i fabrikantens alkaliske hentning løsning ER2 (VBS varenr: AR9640, Leica Microsystems). Objektglas blev derefter inkuberet med det primære antistof ved en fortynding på 1 100 i 30 minutter ved stuetemperatur. Antistof detektion blev udført ved anvendelse af biotin fri Bond Polymer Defined Detection System (DS9713 Leica Microsystems) ifølge fabrikantens protokol. Objektglas blev derefter modfarvet med hæmatoxylin.

MYC overekspression blev vurderet ved myc IHC scoret med en to-delt visuelle system af en praktiserende kirurgisk patolog (CT) blindet til alle kliniske, patologiske og resultatet information. Nuklear farvning af enhver intensitet i mere end 10% af neoplastiske celler blev scoret som positiv (overudtrykt). Alle andre mønstre af farvning blev bedømt som negative. En ekstern kontrol (en MYC forstærket lymfom) blev kørt med hver batch af dias.

DNA mismatch repair (MMR) og BRAF IHC status blev bestemt ved immunhistokemi som beskrevet tidligere [9], [12].

for at undersøge nøjagtigheden af ​​TMA IHC fortolkning, blev Myc IHC udført på hele sektioner af CRC’er på en subcohort af 98 på hinanden følgende CRC’er fra 2004, fortolket af samme vurderingsmand på TMA (CT) blindet til alle kliniske, patologiske og TMA-data.

Sammenhæng mellem MYC overekspression og CRC patient klinisk-patologiske variabler blev undersøgt i 2 × 2 contingengy tabeller for kategoriske variable eller ved hjælp af Mann-Whitney-test for alder (tabel 1). Variabler, som viste en betydning p 0,10 indgik i en binær logistisk regressionsmodel for yderligere at undersøge forholdet mellem MYC overekspression og DNA mismatch repair (MMR) /BRAF status IHC fænotype (tabel 2)

.

Opfølgning blev opnået ved undersøgelsen af ​​hospitalets medicinske journaler, de fra kirurger private værelser og arkivering offentlige død bekendtgørelser og nekrologer i staten New South Wales, Australien. Samlet overlevelse blev defineret som varigheden live fra tidspunktet for definitiv kirurgi. Patienterne blev fulgt op indtil døden eller deres sidste dato for opfølgning ikke mere end 7 år efter endelig kirurgi.

Kaplan Meier-analyse blev anvendt til at rapportere 5-årige overordnede overlevelse, for CRC’er med og uden MYC overekspression med den forskel vurderes ved log rank test. Multivariable cox regression blev anvendt til at undersøge sammenhængen mellem justerede effekt af MYC overekspression på den samlede overlevelse, i en fuld model, som omfattede alder ved diagnose, køn, anatomisk site af tumor, tumor fase kombineret fejlparringsreparationsmangel og BRAF IHC status, tumorstørrelse, histologiske, tilstedeværelse eller fravær af lymphovascular plads invasion og peritumoral lymfocytrespons status

A p. 0,05 blev taget som signifikant, undtagen i den indledende modelling using binær logistisk regression (nævnt ovenfor). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af IBM SPSS Statistics V21 på OSX.

Resultater

I alt 1421 CRC’er blev vurderet på TMA. De kliniske og patologiske træk er opsummeret i tabel 1. Kort fortalt var der omtrent lige kønsfordeling, med en median alder på diagnose på 74 år (spændvidde 17-100 år). Det 5-års samlet overlevelse for kohorten var 66,3%, med et gennemsnit på 52,9% (95% CI = 5,14-5,44).

Myc IHC viste konsekvent nukleare immuno-lokalisering, og der var en synlig forskel mellem tilfælde, der var negative (scoret som negativ for overekspression), og dem, som viste svag til stærk farvning i 10% eller mere neoplastiske celler (scoret som positive for overekspression). Eksempler på myc IHC farvning egenskaber er vist i figur 1. Forekomsten af ​​MYC overekspression i CRC var 69%.

De kliniske og patologiske træk af myc IHC negative (n = 441, 31,0% ) og myc IHC positive (mYC overudtrykt, n = 980, 69,0%) CRCs er opsummeret i tabel 1. mYC over-ekspression blev signifikant associeret med tumor stadium og MMR /BRAF IHC fænotype, men ikke køn, anatomiske placering, histologiske kvalitet, nærvær eller fravær af lymphovascular plads invasion, eller peritumoral lymfocytreaktion status. Forholdet mellem MYC overekspression og alder ved diagnose tendens til at signifikans (p = 0,07).

Tabel 2 viser den justerede effekt af MMR /BRAF IHC fænotype myc IHC status. MYC overekspression blev stærkt forbundet med den MMRd /BRAFV600E IHC fænotype [odds ratio = 2,17 (95% CI = 1,45-3,24), p 0,01].

overlevelse 5-år for CRC’er med MYC løbet -expression var 93,2% (samlet 50

th percentil overlevelse 3,06 år, interkvartile område 0,56-5,22) sammenlignet med myc negativ CRC på 57,3% (samlet 50

th percentil overlevelse 2,32 år, interkvartile interval 0,31-4,26) .

virkningen af ​​myc status på CRC samlet overlevelse er vist i figur 1. CRCs med mYC overekspression udviste signifikant bedre overlevelse sammenlignet med myc negative tilfælde (log rank test p 0,01), med en rå effekt (univariable model) hazard ratio på 0,67 [(95% CI = 0,54-0,83), p 0,01]. Denne rå effekt på den samlede overlevelse forblev signifikant, selv når stratificeret efter MMR /BRAF IHC fænotype [hazard ratio = 0,68 (96% CI = 0,54-0,84), p 0,01].

I den fulde multivariable model, den justerede effekt af MYC overekspression på samlet overlevelse blev ubetydelig [hazard ratio = 0,91 (95% CI = 0,69-1,20), p = 0,52] på grund af den dominerende effekt af alder på diagnosetidspunktet, tumor scenen og lymphovascular plads invasion status og MMR mangelfuld /BRAFV600E mutant IHC fænotype på overlevelse (tabel 3). Tabel 4 viser den fulde model, herunder samspillet mellem myc IHC og MMR /BRAF status

Der var betydelig enighed mellem TMA og hele afsnit myc IHC scoringer. (Kappa = 0,742, p 0,01) . Alle positive TMA tilfælde var positive på hele sektioner. Der var 11 uharmoniske tilfælde (negative på TMA positive på hele afsnittet), alle på grund af pletvis farvning. Univariable Cox regression blev også udført på hele sektioner, hvilket bekræfter den generelt forbedret overlevelse CRC’er viser MYC overekspression (figur 2)

Panel A:. Kaplan Meier kurver viser overlegen samlet overlevelse af CRC’er med MYC overekspression sammenlignet med myc negative CRC’er (Log Rank test p 0,01); Panel B:. Univariable Cox regressionsanalyse viser MYC overekspression signifikant korreleret med forbedret samlet overlevelse [hazard ratio = 0,30 (95% CI = 0,15-0,60), p 0,01]

Diskussion

Tidligere undersøgelser af MYC-ekspression i CRC har været usammenhængende og modstridende formodentlig på grund af anvendelsen af ​​små kohorter (n i området fra 38 til 310) og anvendelse af en række forskellige detektionsmetoder herunder IHC, fluorescerende in situ-hybridisering ( FISH), RNA-baseret analyse og DNA kopiantal. [5], [13] – [17]. Ældre undersøgelser med anvendelse IHC er blevet begrænset af anvendelsen af ​​antistoffer, som viste afvigende (cytoplasmatisk) immuno-lokalisering formodentlig på grund af dårlig specificitet. [18].

Udvikling og validering af en meget specifik kanin monoklonalt antistof til myc har gjort en stor indvirkning på lymfom diagnose, hvor kombinationen af ​​MYC og BCL2 overekspression bestemt ved immunhistokemi alene har været anvendt til at definere en dårlig prognose gruppe B-celle non-Hodgkin lymfom kendt som dobbelt hit lymfomer. [6], [7] Interessant nok i disse lymfom undersøgelser, hvor myc IHC og FISH vurdering har resulteret i modstridende resultater, MYC udtryk, som bestemt ved IHC har været en bedre indikator for udfaldet end den foregående guldstandarden FISH. Formodentlig er det fordi MYC overekspression kan skyldes en række cellulære processer snarere end blot simpel forstærkning.

I den forbindelse vores undersøgelse, som er baseret på en meget stor og umarkerede kohorte på 1421 CRC kohorter ved hjælp af denne næste generation af specifik kanin monoklonale antistof, viser den høje forekomst af mYC over-ekspression i CRCs, og endnu vigtigere, den potentielle rolle for myc som en kraftig prognostisk biomarkør i CRCs. Det faktum, at MYC overekspression er signifikant associeret med en bedre samlet overlevelse i univariable analyse er måske overraskende i betragtning nuværende forståelse af tumorigent potentiale af MYC dysregulering [1] – [4]. Kun én tidligere undersøgelse har vist denne virkning i CRC [5]. Mens der er tilstrækkelige data til at postulere, at den underliggende mekanisme, sammenhængen mellem tumorigent potentiale (onkogenese) og overlevelse, i det mindste for MYC, er at være mere kompleks end oprindeligt troede.

I denne undersøgelse har vi valgt at undersøge MYC over-ekspression i forbindelse med CRCs grupperes efter deres MFR og BRAF status, snarere end MFR og BRAF status individuelt. Det er nu veletableret, at MFR og BRAF interagerer på komplekse måder i forhold til deres effekt på overlevelse. For eksempel i MMR-dygtige CRCs, tilstedeværelsen af ​​BRAFV600E mutation medfører en ringere overlevelse, hvorimod i MMR-deficiente CRCs, BRAFV600E er en markør af methylator fænotype, en gruppe af CRCs som viser fremragende prognose [12], [19].

det er interessant, selv om MYC overekspression blev stærkt forbundet med den MMRd /BRAFV66E fænotype, deres mangel på interaktion i den fulde multivariable model viser, at MYC effekt på overlevelse ikke fuldt ud kan forklares blot ved sin tilknytning til MMR /BRAF-status . Dette antyder, at den prædiktive effekt af MYC overekspression på overlevelse medieres delvist af mekanismer uafhængige af MMR /BRAF-status.

En af de store ulemper ved vores undersøgelse er den over-forenkling, hvorved MYC løbet -expression bestemmes. Den semi-kvantitative natur IHC er sådan, at ændringer i IHC intensitet skal være betydelig (i logaritmisk skala, ellers kendt som Weber-Fechner ret), således at det menneskelige øje kunne påskønne en ændring. Denne metode til IHC scoring indeholder imidlertid egner sig til mere ligetil korrelativ analyse såsom binær logistisk regression, og er den fremherskende metode, hvorved de fleste IHC er scoret i den diagnostiske kliniske omgivelser. Betydeligt, trods denne ulempe var vi i stand til at demonstrere væsentlige overordnede overlevelse forskelle på univariable analyse af myc IHC status.

En anden væsentlig ulempe er manglen på sygdomsspecifikke resultater og kræft dødelighed i vores undersøgelse kohorte. Fremtidige undersøgelser beskæftiger disse effektmål vil give vigtige oplysninger, som kan have væsentlig informere om klinisk praksis.

Sammenfattende viser vores undersøgelse, at myc status som bestemt ved IHC hjælp af en simpel semikvantitativ scoring metode let indsat i den kliniske indstillingen kan bruges som indikator for prognose i CRC. Udbygningen af ​​denne prædiktiv nytte afventer yderligere udredning i kohorter med sygdomsspecifikke resultater.