PLoS ONE: ATRA Hæmmer spredning af DU145 prostatacancerceller gennem Reduktion methylering Niveau af HOXB13 Gene

Abstrakt

All-trans retinsyre (ATRA) er blevet bredt undersøgt for behandlinger af mange kræftformer, herunder prostatakræft .

HOXB13

, tavshed i androgen receptor-negative (AR

-) prostata kræftceller, spiller en rolle i AR

– prostatakræft cellevækst anholdelse. I denne undersøgelse er beregnet vi at belyse de mekanismer, der er involveret i spredning hæmning af AR

– prostatacancerceller udløst af ATRA. Vi opdagede, at ATRA var i stand til at inducere vækst anholdelse og for at øge

HOXB13

udtryk i AR

– prostata kræftceller. Både EZH2 og DNMT3b deltog i undertrykkelsen af ​​

HOXB13

udtryk gennem en epigenetisk mekanisme, der involverer DNA og histon methylering modifikationer. Konkret EZH2 rekrutteret DNMT3b til

HOXB13

promotor til at danne en repression kompleks. Desuden ATRA kunne opregulere

HOXB13

gennem faldende EZH2 og DNMT3b udtryk og reducere deres interaktion med

HOXB13

promotor. Samtidig blev methylering niveau

HOXB13

promotor reduceres ved behandling af ATRA. Resultater fra dette studie impliceret en roman effekt af ATRA i hæmning af væksten af ​​AR

-. Resistente humane prostata kræftceller gennem ændring af

HOXB13

udtryk som følge af epigenetiske modifikationer

Henvisning: Liu Z, Ren G, Shangguan C, Guo L, Dong Z, Li Y, et al. (2012) ATRA Hæmmer spredning af DU145 prostatacancerceller gennem Reduktion methylering Level of HOXB13 Gene. PLoS ONE 7 (7): e40943. doi: 10,1371 /journal.pone.0040943

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 20. april, 2012; Accepteret: 15 juni 2012; Udgivet: 13 Jul 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra The National Natural Science Foundation of China (30971613, 31071149, 91019011, 30800557), og grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter (09ZDQD01). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige malignitet hos mænd i Europa, Nordamerika og i en række afrikanske lande [1], [2]. Forekomsten af ​​prostatakræft er steget efter den aldrende befolkning på verdensplan [3]. På nuværende konventionelle behandlinger såsom kirurgi og hormonbehandling ofte ikke opnår tilfredsstillende effekt. Endvidere kan kræftceller erhverve hormon og lægemiddelresistente funktioner under disse behandlingsmetoder belastninger [4]. Indtil videre har bestræbelserne på at erobre denne ondartet sygdom opnået begrænset succes [5]. Således undersøgelser rettet mod udviklingen af ​​nye og mere effektive terapeutiske strategier for prostatakræft forblive et åbent lejlighed.

HOXB13

gen tilhører en stor homeobox superfamilie, hvoraf mange er transkriptionsfaktorer, som regulere aksial regional specifikation under fosterudviklingen [6], [7]. Begrænset ekspression af

HOXB13

blev observeret ved den caudale udstrækning af rygmarven, urogenital sinus, og tyktarm og endetarm celler i en androgen-uafhængig måde; men det udtrykkes i prostata med bemærkelsesværdig vævsspecificitet at opretholde sin normale fysiologiske funktion og til at inducere terminal differentiering [8], [9].

HOXB13

er bragt til tavshed i androgen receptor-negative (AR

-) prostata kræftceller. Jung

et al

. [5] viste, at ektopisk udtryk for

HOXB13

i en prostatakræft cellelinje induceret G1 cellecyklusstop gennem negativ regulering af T-celle faktor-4, men førte ikke til ændringer i apoptotisk sats. Overekspression af

HOXB13

i AR

– prostatacancerceller resulterede i signifikant inhibering af cellevækst [10]. Imidlertid er den mekanisme, der ligger bag denne gendæmpning ikke fuldt forstået. For nylig undersøgte vi funktioner Polycomb gruppe (PCG) proteiner og deres epigenetiske handlinger i nedregulering af

HOXB13

i prostata kræftceller, og fandt, at der var en krydstale mellem histonacetylering og medlemmer af PCG proteiner på at undertrykke den

HOXB13

udtryk [11]. I denne undersøgelse, vi forudsat yderligere beviser for, at DNA-methyltransferaser (DNMTs) og PCG proteiner synergistisk hæmmet

HOXB13

promotor-aktivitet.

All-trans retinoid syre (ATRA), vitamin A metabolit, skuespil en vigtig rolle i udviklingen ved at regulere cellulære processer, såsom proliferation, differentiering og migration [12]. ATRA implementerer sin virkning ved at binde specifikke nukleare receptor superfamilien, retinoinsyrereceptorerne (RAR). RAR’erne danner en heterodimer med retinoid X-receptor [13]. Tidligere undersøgelser afslørede, at behandling af leukæmiceller med ATRA resulterede i apoptose, formentlig sekundært til differentieringsprocessen [14], [15]. Da ATRA kan afhjælpe aberrerende cellevækst og inducerer apoptose, er det blevet almindeligt undersøgt i prækliniske og kliniske forsøg til behandling af mange cancertyper, herunder tidlig gastrisk cancer og prostatacancer [16], [17]. I AR

– og lægemiddelresistente DU145 prostatacancerceller, ATRA blev påvist at forøge følsomheden af ​​celler til anticancermiddel docetaxel; men de mekanismer hvordan ATRA alene fremkalder celle vækststandsning fortsat uklare [18].

PCG-proteiner er globale repressorer af genekspression gennem dannelse af Polycomb undertrykkende kompleks (PRC), såsom PRC1 og PRC2 [19]. Adskillige PCG-proteiner er blevet impliceret i onkogene aktiviteter [20]. Der har været tegn på, at PcG repressoraktivitet forøges under prostatakræft progression [21]. Desuden er nogle

PcG

genprodukter viste sig også at være behov for stabil dæmpning af

Hox

gener i hele

Drosophila

udvikling [22]. Enhancer af Zeste Homolog 2 (EZH2), den katalytiske subunit af PRC2, besidder en histon methyltransferase aktivitet for histon 3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3), som fastsætter et stærkt undertrykkende signal for genekspression [19]. Det blev vist, at ektopisk overekspression af

EZH2

ikke blot stimulerede celleproliferation, men også fremmet forankringsuafhængig vækst og celleinvasion

in vitro

[20]. I modsætning, udtømning af

EZH2

af små interfererende RNA (siRNA) hæmmede celledeling og induceret apoptose i prostata, bryst, og tyktarmskræft celler [23], [24], [25].

Methylering af DNA er en væsentlig epigenetiske modifikation, der påvirker gentransskription. DNA methylering i pattedyrceller etableres og vedligeholdes af DNMTs. Methylering initieres af meget homologe DNMT3a og DNMT3b og heritably formeres ved DNMT1 [26]. Blandt disse tre enzymer, opregulering af

DNMT3b

er karakteristisk for mange kræftceller, og DNMT3b kan spille en kausal rolle i tumorigenese [27]. Studier i en musemodel har vist, at overekspression af

DNMT3b

, men ikke

DNMT3a

, fremmet kolon tumorigenese i

ApcMin /+

mus [28]. En tidligere undersøgelse viste, at ekspressionen af ​​

HOXB13

blev styret i en methylering-afhængig måde, og dens methylering blev korreleret positivt med tumor kvalitet og mikrokar invasion [29]. I kolon kræftceller,

HOXB13

, som et mål for DNMT3b, blev methyleret ved en opstrøms CpG ø, og fungerede som en tumor suppressor i primære kolorektale tumorer [26].

Siden DNMT3b gør ikke har DNA-bindende domæner, det har brug for transskription co-faktorer for at interagere med specifikke gensekvenser [30]. Det har været kendt, at mange medlemmer af PcG, såsom EZH2, besidder de bindende domæner for

HOXB13

promotor, og de undertrykker

HOXB13

udtryk gennem histon methylering [31]. Betydeligt, EZH2 har været impliceret at spille en central rolle i at mediere både histon methylering og DNA methylering af

HOXB13

gen i nogle kræftceller [21], [32]. Også, vi tidligere rapporteret, at YY1 og histon deacetylase 4 (HDAC4) påvirkede prostatakræft cellevækst ved at undertrykke

HOXB13

transskription gennem histon modifikation [11]. Disse tilgængelige data fascineret os at spekulere, at EZH2 kunne være i stand til at rekruttere DNMT3b til

HOXB13

promotor at undertrykke sit udtryk gennem særlige epigenetiske modifikationer.

Formålet med denne undersøgelse var at belyse de mekanismer, der er involveret i inhibering af proliferation i AR

– prostatacancerceller udløst af ATRA. Vores resultater viste, at ATRA hæmmede væksten af ​​DU145 prostatacancerceller gennem opregulering

HOXB13

ekspression ved at reducere dets methylering niveau. Dette blev opnået ved ATRA at svække virkningen af ​​EZH2 og DNMT3b, der er ansvarlige for methylering af

HOXB13

promotor. Data, bragt i orden fra denne undersøgelse kan give nyttige fingerpeg til udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier for AR

– prostatakræft, der indebærer brug af ATRA og epigenetiske modifikatorer

Resultater

HOXB13 var involveret. i ATRA-induceret DU145 Cell Growth arrest

ATRA blev rapporteret at være i stand til at inducere cellevækst anholdelse, men mekanismen er ikke helt klar. Overekspression af HOXB13 i AR

– prostatacancerceller kan også resultere i signifikant inhibering af cellevækst. For at afklare, om HOXB13 spiller en rolle i ATRA-induceret vækststandsning i prostata kræftceller, vi først testet den relative celle overlevelse efter behandling af ATRA. DU145 celler blev udsat for stigende koncentrationer af ATRA (fra 20 til 120 uM) i 24, 48 og 72 timer. Som det fremgår af fig. 1A og 1B, ATRA faktisk induceret celle vækststandsning i DU145-celler på en dosis-afhængig måde. Høj cytotoksicitet blev observeret ved 72 timer. I mellemtiden blev både HOXB13 mRNA og protein niveauer forhøjede i DU145 celler efter ATRA behandling (fig. 1C). Vi yderligere bekræftet virkningen af ​​ATRA i en anden AR

– prostatacancer-cellelinie PC-3, og vi observerede lignende dosisafhængig effekt af ATRA på cellevækst arrest, som afsløret ved MTT-assays (fig S1.). I mellemtiden blev både HOXB13 mRNA og protein niveauer også forhøjet ved ATRA behandling (fig. S2).

(A) Dosisafhængig effekt af ATRA på DU145 cellevækst anholdelse. DU145-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af ATRA i 72 timer. *

P

0,05, **

P

0,01 (n = 6). (B) Tidsforløb af vækststandsning effekt af ATRA i DU145-celler. *

P

0,05, **

P

0,01 (n = 6). (C) ATRA steg HOXB13 ekspression i DU145-celler. DU145-celler blev behandlet med 80 pM af ATRA i 72 timer. Totalt RNA blev ekstraheret for RT-PCR (

uppe

r), og hele cellelysater blev fremstillet for western blotting (

lavere

). (D) Den ATRA-induceret DU145 cellevækst anholdelse blev delvist vendes ved undertrykkelse af HOXB13 udtryk. Cellevæksten potent blev målt ved MTT-assays. *

P

0,05, **

P

0,01 (n = 6)

Næste, for at teste rolle HOXB13 i ATRA-. medieret DU145 cellevækst anholdelse, vi forbigående transficeret

HOXB13

siRNA plasmidet i DU145 celler behandlet med ATRA. Konstruktionen og forstyrrende effektivitet HOXB13 siRNA blev beskrevet i vores tidligere rapport [11]. Vi fandt, at knockdown af HOXB13 af siRNA tilsyneladende vendt cellen vækststandsning induceret af ATRA (fig. 1D). Dette impliceret, at ATRA-induceret DU145 cellevækst anholdelse var forbundet, i det mindste delvist, med ekspressionen af ​​HOXB13.

DNMT3b Deltaget i HOXB13 Transkriptionel Undertrykkelse

HOXB13

gen stumme i AR

– prostatacancerceller og overekspression af HOXB13 i AR

– prostatacancerceller resulterede i signifikant inhibering af cellevækst [10]. Vi derefter undersøgte de molekylære begivenheder, der er involveret i

HOXB13

gendæmpning i AR

– prostata kræftceller. Initiativtageren til

HOXB13

er ofte blevet rapporteret at være hypermethyleret i forskellige kræftformer [33]. For at afklare, om tavshed af

HOXB13

gen medieres af DNA hypermethylering i AR

– prostatacancerceller, vi vurderede status methylering af

HOXB13

promotor ved hjælp af bisulfit-sekventering af PCR (BSP), og vi fandt, at

HOXB13

promotor blev mere intensivt methyleret i DU145 celler i sammenligning med, at i de ydmyge maligne LNCap celler (fig. 2A, B).

BSP analyser viste methylering af CpG øer på HOXB13 promotor i stærkt maligne DU145 celler (A) og i ydmyge maligne LNCap celler (B). (C) HOXB13 blev opreguleret i DU145-celler transficeret med DNMT3b siRNA plasmid, sammenlignet med cellerne transficeret med kontrol siRNA vektor. (D) BSP analyser viste det reducerede methylering niveau HOXB13 promotor i DU145 celler transficeret med DNMT3b siRNA (

lavere

), sammenlignet med kontrol siRNA (

øvre

).

Da DNA methyltransferase DNMT3b spiller en vigtig rolle i methylering af cancerrelaterede gener, og

HOXB13

blev rapporteret at være et målgen af ​​DNMT3b i primære colorektale tumorer [26], [27], vi spekuleret på, at DNMT3b også kan være involveret i

HOXB13

transkriptionel repression i DU145 celler. For at verificere denne antagelse, vi bankede ned DNMT3b udtryk med en specifik siRNA, og vi fandt, at HOXB13 udtryk tilsyneladende blev øget i DU145 celler og den forstyrrende effektivitet DNMT3b siRNA blev vist (fig. 2C). Resultaterne fra BSP-assays viste, at methylering på

HOXB13

promotoren i DU145 blev reduceret efter knockdown af det endogene DNMT3b (fig. 2D, lavere), sammenlignet med de kontrol celler (fig. 2D øvre). Disse resultater tydede på, at DNA-methylering modifikation medieret af DNMT3b var ansvarlig for lyddæmpning af

HOXB13

i DU145 celler.

PCG Proteiner EZH2 og BMI1 Deltaget i HOXB13 Transkriptionel Undertrykkelse

Næste, vi har til formål at bestemme transskription faktor (er), som kan deltage i reguleringen af ​​

HOXB13

gen. PCG proteiner er blevet rapporteret at spille en rolle i progressionen af ​​prostata- og brystcancere, såvel som i nedregulering af

HOXs

[3], [21], [34], [35]. Vi først fastslået, at udtryk for PCG proteiner EZH2 og BMI1 var signifikant højere i stærkt maligne DU145 celler end i ydmyge maligne LNCap celler, og deres udtryk er negativt korreleret til HOXB13 udtryk, som afsløret af RT-PCR og western blotting (fig. 3A, B).

mRNA (A) og protein (B) niveauer af BMI1, EZH2 og HOXB13 i forskellige malignitet prostatacancerceller, LNCaP og DU145. (C) mRNA niveauer af HOXB13 og EZH2 i DU145-celler transficeret med EZH2 siRNA plasmid. (D) De mRNA niveauerne af HOXB13 og BMI1 i DU145 celler transficeret med BMI1 siRNA plasmid. (E) De proteinniveauer af HOXB13 og EZH2 i DU145-celler transficeret med EZH2 siRNA plasmid. (F) De protein niveauer af HOXB13 og BMI1 i DU145 celler transficeret med BMI1 siRNA plasmid.

For yderligere at afklare, om EZH2 og BMI1 deltog i

HOXB13

transkriptionel repression i DU145 prostatakræft celler, konstruerede vi EZH2 siRNA og BMI1 siRNA plasmider og transficeret dem i DU145-celler, hhv. Vi har detekteret at både HOXB13 mRNA (fig. 3C, E) og protein (fig. 3D, F) niveauer blev opreguleret når EZH2 og BMI1 blev slået ned. De inhibitoriske effektivitet af disse siRNA plasmider på endogen EZH2 og BMI1 på mRNA og protein niveauer blev vist (Fig.3C, D og E, F). Disse resultater viste, at EZH2 og BMI1 kan undertrykke HOXB13 udtryk ved at mediere histon methylering modifikation.

DNMT3b blev rekrutteret til HOXB13 Arrangøren af ​​EZH2

Som co-repressorer af transskription, DNMTs ikke besidder kanoniske DNA-bindende domæner og de er normalt rekrutteret til specifikke kromatin regioner ved transkriptionsfaktorer [26], [30]. Betydeligt, EZH2 er blevet rapporteret at spille en nøglerolle ved mediering både histon methylering og DNA-methylering af

HOXB13

gen i nogle cancerceller [21], [32]. Vi ønskede derefter at afgøre, om EZH2 rekrutterer DNMT3b til

HOXB13

promotor. Vi udførte chip assays at påvise ændringer i sammenslutning af EZH2 på de tre definerede regioner (P1-P3) af

HOXB13

promotor på knockdown af endogene EZH2. Den langt opstrøms P4 region blev valgt som en negativ kontrol (fig. 4A). Chippen Resultaterne viste, at den overflod af EZH2 på P1-P3 af

HOXB13

promotor blev reduceret, når endogene EZH2 blev undertrykt af

EZH2

siRNA i DU145 celler. Samtidig blev H3K27me3 niveau er forbundet med EZH2 funktion på P1-P3 tilsyneladende reduceret (fig. 4B).

(A) Diagram af 5′-fl anking region HOXB13 gen. P1, P2 og P3 betegner de tre promotorområder HOXB13 genet analyseret i chip assays, og P4 er en distal negativ kontrol. (B) chip assays i DU145-celler transficeret med EZH2 siRNA og immunpræcipiteret med anti-EZH2-antistof og anti-H3K27me3 antistof hhv. (C) CoIP assays til påvisning af sammenslutningen af ​​DNMT3b med EZH2 i DU145 celler. Cell kerneekstrakter blev fremstillet og præcipiteret med anti-EZH2 eller anti-DNMT3b antistof og påvises ved immunoblotting med anti-DNMT3b eller anti-EZH2 antistof. (D) chip assays blev udført i DU145-celler transficeret med EZH2 siRNA og DNA blev immunfældet med anti-DNMT3b antistof. Mængderne af præcipiteret DNA blev bestemt ved PCR.

Desuden CoIP assays med DU145 celleekstrakter afslørede, at komplekser blev immunpræcipiteret af anti-DNMT3b eller anti-EZH2 antistoffer og kunne påvises i immunblotting med anti -EZH2 eller anti-DNMT3b antistoffer, (fig. 4C), hvilket antyder, at DNMT3b og EZH2 var til stede i det samme kompleks. Vores chip data i fig. 4D anførte endvidere, at den overflod af DNMT3b på de tre promotorregioner (P1-P3) blev reduceret på knockdown af endogene EZH2. Således er disse resultater er beviser for, at DNMT3b blev rekrutteret til

HOXB13

promotor af EZH2.

ATRA Nedsat EZH2 og DNMT3b Expression og svækket deres Interaktioner med HOXB13 Promotor

Vi har vist ovenfor, at HOXB13 blev nedreguleret af EZH2 og DNMT3b, og ATRA behandling resulterede i en stigning i

HOXB13

udtryk i DU145 celler. For at verificere vores antagelse, at ATRA kan lette HOXB13 udtryk gennem forringe de negative regulatoriske virkninger af EZH2 og DNMT3b på HOXB13, undersøgte vi EZH2 og DNMT3b udtryk i DU145 celler behandlet med 80 pM ATRA, og 5-aza-2′-deoxycytidin (5 aza-dc) blev anvendt som demethylering kontrol. Resultaterne viste, at udtryk for både EZH2 og DNMT3b blev nedreguleret ved ATRA behandling både mRNA og protein niveauer (fig. 5A, B). Lignende resultater blev opnået fra en parallel undersøgelse med en anden AR

-. Ondartet prostatakræft cellelinje PC-3 (. Fig S2)

Behandling af 80 uM ATRA opreguleres HOXB13 og nedreguleret EZH2 og DNMT3b udtryk på mRNA-niveau (A) og proteinniveau (B) i DU145-celler. 5-aza-dc blev anvendt som en positiv demethylering kontrol. Kontrol 1 var isopyknisk absolut ethanol og kontrol 2 var isopyknisk eddikesyre (C) ATRA forringet bindingerne af EZH2 og DNMT3b, og reducerede H3K27me3 niveau HOXB13 promotor. Chip assays blev udført i DU145 celler behandlet med 80 pM ATRA og immunpræcipiteret med anti-H3K27me3, anti-DNMT3b eller anti-EZH2 antistof. Mængden af ​​udfældet endogene HOXB13 promoter DNA blev bestemt ved PCR. (D) BSP analyser viste den reducerede methylering af HOXB13 promotor i DU145 celler efter behandling på 80 uM ATRA, sammenlignet med den ubehandlede kontrol.

Vores chip assays endvidere dokumenteret, at bindinger af endogene EZH2 og DNMT3b på

HOXB13

promotor blev reduceret efter ATRA behandling, og imens H3K27me3 niveauer på P1-P3 regioner tilsyneladende faldet (fig. 5C).

Desuden afslørede BSP analyser, at behandling med ATRA resulterede ved reduktion af methylering niveau af CpG-øer på

HOXB13

promotor i modsætning til den for ubehandlede DU145 celler (fig. 5D). Tilsyneladende EZH2 rekrutteret DNMT3b til

HOXB13

promotor og udløste genet stilhed ved at inducere H3K27me3 og ved at øge methylering af CpG øer. I mellemtiden, både DNA methylering og H3K27me3 af

HOXB13

promotor kunne reduceres med ATRA.

Diskussion

ATRA spiller en væsentlig rolle i udviklingen ved at regulere forskellige cellulære processer og det er blevet bredt undersøgt i prækliniske og kliniske undersøgelser som et middel til behandling af mange cancertyper, herunder tidlig gastrisk cancer og prostatacancer [16], [17]. Også HOXB13 viste sig at spille en rolle i vækst anholdelse i AR

– prostata [10], kolorektal cancer [26] og renalcellecarcinom [29]. I overensstemmelse med disse tidligere data, resultater fra denne undersøgelse viste, at ATRA var i stand til at fremkalde vækst anholdelse af to AR

– (.. Figur 1A og figur S1) prostata kræftceller DU145 og PC-3 i en dosisafhængig måde , og denne effekt blev delvist opnået gennem fremme HOXB13 mRNA og protein produktion (fig. 1C og S2, S3). Modsat, beskrev en nylig rapport, at knockdown af endogen HOXB13 ved RNA-interferens i humane ovarie cancer cellelinjer var forbundet med reduceret celledeling [36]. Disse modstridende beskrivelser kan være resultaterne fra den tilsyneladende forskel mellem æggestok og andre organer, da HOXB13 er uudtalt i normal æggestok [36], mens det er udtrykt på et højt niveau i normal prostata og nyrer [5], [29]. Ikke desto mindre er data præsenteret i denne rapport dokumenterer, at ATRA behandling hæmmede væksten af ​​DU145 prostatacancerceller, gennem en mekanisme, der er involveret opregulering af HOXB13 ved at reducere methylering niveau ved genets promotor.

DNA methylering katalyseres og vedligeholdes af DNMTs. Visse DNMTs, udtrykt ved relativt lave niveauer i somatiske celler, ofte opreguleret i kræftceller. Gain-of-funktion undersøgelser viste, at DNMT3b men ikke DNMT3a forfremmet kolon tumorigenese i APC

Min /+ mus ved at inducere

de novo

methylering af flere gener huser CpG øer [26]. Der var også indikation af, at udtømning af DNMT3b resulterede i øget apoptose og nedsat vandring af PC-3 prostatacancerceller [37]. I denne undersøgelse viste vi, at HOXB13 ekspression blev stille i DU145 (Fig. S4), og BSP assays viste, at dens tavshed kan være relateret til hypermethyleringen af ​​genet promotoren (fig. 2A). Det blev rapporteret, at

HOXB13

gen var et mål på DNMT3b i tyktarmskræft celler [26]. Det bliver derfor vigtigt at forstå funktionen af ​​DNMT3b i dæmpning af

HOXB13

gen i DU145 prostata kræftceller. Vores resultater viste, at DNMT3b kunne regulere

HOXB13

transkription gennem at ændre modifikation DNA methylering ved genets promotor, skønt knockdown af DNMT3b ikke reducerede methylering af CpG i

HOXB13

promotor som forventet (fig. 2C, D). Tilsyneladende kan andre mekanismer eksisterer ligger til grund for DNMT3b-medierede

HOXB13

undertrykkelse.

I særdeleshed, normal og afvigende methylering mønstre kan medieres af kromatin proteiner vejledende DNA methyltransferaser til deres målgener [38] . Senest blev PCG protein EZH2 rapporteret at rekruttere DNA methyltransferaser, især DNMT1 og DNMT3b, at gennemføre lyddæmpning af

MYT1

WNT1

loci gennem DNA methylering [21], [32 ]. Overekspression af EZH2 forekommer normalt i et mangfoldigt af maligniteter, herunder prostata, bryst og leverkræft, især i avancerede tilfælde [39]. Varambally

et al

[40] konkluderede, at dereguleret udtryk for EZH2 kan være en årsag til prostatakræft progression, samt at det er en markør, der adskiller ugidelig prostatakræft fra personer, der risikerer dødelig progression. Vores resultater antydede, at PCGS deltaget i udvikling af prostatacancer. Vi viste, at ekspressionen af ​​EZH2 og BMI1 var meget højere i DU145-celler end i LNCaP-celler (fig. 3A, B). Mere interessant, fandt vi, at PCGS undertrykt HOXB13 udtryk i DU145 celler. RT-PCR og Western blotting assays viste, at HOXB13 ekspression blev opreguleret når EZH2 og BMI1 blev slået ned (fig. 3C, D, E og F). Endvidere vores chip assays viste, at EZH2 var i stand til direkte at binde på

HOXB13

promotoren (fig. 4B), og dette kan være en lyddæmpende mekanisme

HOXB13

i DU145 malign prostatacancer celler.

det er blevet foreslået, at EZH2 undertrykker transkriptionen af ​​målgener hovedsagelig gennem to forskellige mekanismer. Den første omfatter bindingen af ​​EZH2 til target genets promotor for at inducere H3K27me3 modifikation og derved mindske promotoraktiviteten [39], [41]. Den anden mekanisme tyder på, at EZH2 rekrutterer en co-repressor eller kompleks, såsom DNMT1 og DNMT3b, til promotoren og denne co-repressor enten negativ virkning på andre faktorer, som er til stede, eller ændrer den lokale kromatin struktur for at lette repression [30], [35]. Tilsyneladende Resultaterne fra denne undersøgelse er generelt enighed med begge de to modeller. Konkret viste vores data, at EZH2 var i stand til direkte at binde til

HOXB13

promotor at inducere H3K27me3 modifikation (fig. 4B). I mellemtiden er vores data også foreslået, at EZH2 kan rekruttere DNMT3b til

HOXB13

promotor for at påvirke status promotoren methylering og dermed undertrykke gentransskription (fig. 4C, D). Disse resultater giver yderligere bevis for en krydstale mellem de to forskellige epigenetiske mekanismer i gen stilhed.

ATRA er normalt anvendes i kombination med andre lægemidler, såsom docetaxel, TSA og zoledronsyre i prostatakræft behandling [18], [42], [43], men den molekylære mekanisme af ATRA Virkningsmekanismen er uklar. Det faktum, at EZH2 rekrutterer DNMT3b til

HOXB13

promotor at undertrykke genekspression, og at behandling med ATRA resultater i opregulering af HOXB13 udtryk, fascineret os til at foreslå en hypotese om, at ATRA kunne opregulere HOXB13 gennem faldende methylering af genet induceres af EZH2 og DNMT3b. Resultaterne fra dette studie valideret, at de udtryk for

EZH2

DNMT3b

blev nedsat efter ATRA behandling i både DU145 og PC-3 cellelinier (Fig.5A, B og fig. S2, S3 ). Også, bindingerne af EZH2 og DNMT3b over på

HOXB13

promotoren og H3K27me3 niveau, hvor blev reduceret i DU145 celler behandlet med ATRA (fig. 5C). Interessant, afslørede BSP analyser, at DNA-methylering niveau

HOXB13

promotor blev også reduceret i DU145 celler på ATRA behandling (fig. 5D).

Der er tre

RAR

gener, dvs.

RARa, β

γ

i celler, og de er alle nødvendige for ATRA funktion. Da

RARp

er stumme i DU145-celler, følsomhed af DU145 celler til ATRA er lavere end den for LNCaP-celler [44]. I mellemtiden undersøgte vi også virkningen af ​​ATRA i 293 og 293T celler, de to normale humane embryonale nyre cellelinier. Som forventet følsomhed af disse celler til ATRA var højere end i DU145-celler (fig. S5A). Mærkbart, behandling af AR

– prostatacancerceller med ATRA ændrede ikke udtryk for HOXB13, EZH2 og DNMT3b på mRNA-niveau (Fig S5B.), Implicerer en anden mekanisme af ATRA indsats på dette bestemt celle baggrund. Formentlig de epigenetiske ændringer medieret af ATRA er beskrevet i denne rapport kan sandsynligvis være begrænset til bestemte cancer celletyper som AR

– prostatacancerceller, da der har været nogen rapporter om ATRA-medierede epigenetiske modifikationer i normale celler til dato. Ligeledes mere ondartede og lægemiddelresistente PC-3 celler udviste en endnu højere følsomhed til ATRA end DU145 celler (Fig. S1).

En tidligere rapport unraveled at reduceret DNMT3b udtryk resulterede i hypometylering af

retinoblastoma (Rb)

,

RARa

, og

adenomatøs polypose coli (APC)

genpromotorer [37]. Formentlig kan nedregulering af DNMT3b dels forstærke følsomhed DU145 celler til ATRA, og dette kan skabe en positiv feedback mellem ATRA behandling og nedregulering af DNMT3b at lette HOXB13 udtryk, og dermed at inducere væksten anholdelsen af ​​DU145 celler. I denne undersøgelse fandt vi, at ATRA kunne opregulere ekspressionen af ​​HOXB13 og fremkalde DU145-celler vækststandsning som følge af den reducerede methylering på

HOXB13

. Dette rejser et spørgsmål om, hvorvidt en synergistisk effekt mellem ATRA og DNMTs hæmmere, f.eks 5-aza-dc, eksisterer. Resultater fra vores MTT og real-time PCR-forsøg støttede denne antagelse, eftersom samtidig behandling af både ATRA og 5-aza-dc udviste en meget stærkere inhiberende virkninger til DU145 celler end hvert af de to lægemidler alene (fig. S6). I mellemtiden var udtryk for HOXB13 opreguleres, men både EZH2 og DNMT3b blev nedreguleret markant på behandlingen af ​​de to lægemidler (fig. S7).

I alt data præsenteret i denne rapport støtte en arbejdsgruppe model, hvor HOXB13 , EZH2 og DNMT3b er involveret i ATRA-induceret celle vækststandsning i DU145-celler (fig. 6). Konkret ATRA hæmmer spredning af DU145 prostata kræftceller ved at reducere methylering niveau af

HOXB13

promotor induceret af EZH2 og DNMT3b. Perspektivisk, kan data, der følger af denne undersøgelse give nyttige fingerpeg til udvikling af nye terapeutiske strategier for AR

-. Prostatakræft, der involverer brugen af ​​ATRA og epigenetiske modifikatorer

EZH2 binder direkte på HOXB13 promotoren og inducerer trimethylation af H3K27 at undertrykke den HOXB13 udtryk. DNMT3b rekrutteres til HOXB13 promotoren ved EZH2 at inducere DNA hypermethylering resulterer i yderligere undertrykkelse af genet. I mellemtiden ATRA undertrykker EZH2 og DNMT3b ekspression, og hæmmer deres binding ved HOXB13 promotor for at mindske methylering niveau af HOXB13 promotor, hvilket resulterer i aktiveringen af ​​HOXB13, hvilket igen hæmmer væksten af ​​DU145 celler. Desuden undertrykkelse af DNMT3b opregulerer også

RARp

udtryk, der kan forbedre sensibilitet af DU145 celler til ATRA. En kombineret behandling af både ATRA og 5-aza-dc medfører øget virkning på HOXB13 opregulering og hæmning af væksten af ​​DU145 celler.

Materialer og metoder

Cell Kultur og Reagenser

DU145, PC-3, LNCaP, 293 og 293T celler blev indkøbt fra Institut for Cellebiologi (Shanghai, Kina).