PLoS ONE: Multi-Determinanter Analyse af Molecular Ændringer til Forudsigelse klinisk fordel for EGFR-målrettet monoklonale antistoffer i kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

KRAS

mutationer forekommer i 35-45% af metastatisk kolorektal kræft (FRK) og hinder lydhørhed over for EGFR-målrettet behandling med cetuximab eller panitumumab. Men mindre end 20% af patienterne viser vildtype

KRAS

tumorer opnår objektiv respons. Ændringer i andre effektorer nedstrøms for EGFR, såsom BRAF, og dereguleringen af ​​PIK3CA /PTEN pathway er uafhængigt vist sig at give anledning til modstand. Vi præsenterer en omfattende analyse af

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

mutationer, og PTEN udtryk i FRK patienter behandlet med cetuximab eller panitumumab, med henblik på at klarlægge den relative bidrag af disse molekylære ændringer til modstand.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi retrospektivt analyseret objektivt tumorrespons, progressionsfri (PFS) og samlet overlevelse (OS) sammen med det mutationsstatus af

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

og ekspressionen af ​​PTEN i 132 tumorer fra cetuximab eller panitumumab behandlet FRK patienter. Blandt de 106 ikke-responderende patienter, 74 (70%) havde tumorer med mindst en molekylær ændring i de fire markører. Sandsynligheden for respons var 51% (22/43) blandt patienter uden ændringer, 4% (2/47) hos patienter med en ændring, og 0% (0/24) for patienter med ≥ 2 ændringer (p 0,0001) . Derfor PFS og OS var stadigt værre for patienter med tumorer huser ingen, 1, eller ≥2 molekylær ændring (er) (p 0,001).

Konklusioner /Betydning

Når udtryk for PTEN og mutationer af

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

er samtidig konstateret, op til 70% af FRK patienterne usandsynligt at reagere på anti-EGFR terapier kan identificeres. Vi foreslår at definere som “

firedobbelt negativ

‘, den CRC’er mangler ændringer i

KRAS

,

BRAF

, PTEN og

PIK3CA

. Omfattende molekylær dissektion af EGFR signalveje bør overvejes at vælge FRK patienter cetuximab- eller panitumumab-baserede terapier

Henvisning:. Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, Nichelatti M, Molinari F, De Dosso S , Saletti P, et al. (2009) Multi-Determinanter Analyse af Molecular Ændringer til Forudsigelse klinisk fordel for EGFR-målrettet monoklonale antistoffer i kolorektal cancer. PLoS ONE 4 (10): e7287. doi: 10,1371 /journal.pone.0007287

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: Juni 5, 2009; Accepteret: September 2, 2009; Udgivet: 2 okt 2009

Copyright: © 2009 SartoreBianchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC), italienske sundhedsministerium, Regione Piemonte, italienske universiteter og forskning, Association for International Cancer Research (AICR-UK), EU FP6 MCSCs kontrakt 037.297, CRT Progetto Alfieri, Oncosuisse giver OCS-01921-08-2006 og OCS-02301-08-2008, Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro (Tessin Foundation for Cancer Research), og OCGO (Oncologia Ca Granda Onlus) Fondazione. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje årsag til kræft dødsfald i den vestlige verden [1]. Trods forbedringer i den terapeutiske udrustning for metastatisk CRC (mCRC), den 5-årige samlet overlevelse (OS) er fortsat dårlig, med en median overlevelse på 18 til 21 måneder [2]. Yderligere lægemidler, samt yderligere indsigt om resistensmekanismer, er der behov for at forbedre det kliniske resultat. Behandlingsformer for mCRC dag omfatter det kimære IgG1 monoklonalt antistof (moAb) cetuximab og den humane IgG2 moAb panitumumab [3], [4]. Begge molekyler binder til epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), hvilket fører til inhibering af dens nedstrøms signalering, hvilket giver en meningsfuld klinisk fordel. Objektive responsrater i umarkerede populationer af mCRC dog er begrænset til 8-12% for disse midler, når de anvendes som monoterapi i første [5] og efterfølgende linjer af behandling [4], [6], [7].

Vi og andre har tidligere vist, at somatiske

KRAS

mutationer (en central effektor af EGFR indledte signalering) kan uafhængigt nedsætte effekten af ​​panitumumab eller cetuximab [8] – [10]. Dette førte USA og europæiske sundhedsmyndigheder for at begrænse brugen af ​​disse midler til patienter med vildtype

KRAS

mCRC kun [11] – [13]. Selvom forventes denne afgørelse til forbedre det terapeutiske indeks i denne udvalgte population, den objektive responsrate er stadig meget begrænset. Faktisk er den begrænset til 17% (

vs

0% i

KRAS

muteret) for panitumumab monoterapi [10], til 12,8% (vs 1,2% i

KRAS

muteret) for cetuximab monoterapi [14] og til 59-61% (

vs

36-33% i

KRAS

muteret) for cetuximab plus enten irinotecan eller oxaliplatin kemoterapi, henholdsvis [15], [16]. Disse resultater tyder klart, at andre faktorer, såsom ændringer i andre EGFR effektorer, herunder medlemmer af RAS-MAPK eller PI3K veje kunne drive modstand mod anti-EGFR-behandling.

BRAF er den vigtigste nedstrøms effektor af KRAS [ ,,,0],17], [18] og dens onkogene V600E mutation er gensidigt udelukkende med

KRAS

mutationer i CRC’er [19]. Vi og andre har for nylig vist, at V600E mutationen også kan udelukke lydhørhed over for panitumumab eller cetuximab i FRK patienter og cellulære modeller af CRC [20].

PIK3CA

gen er muteret i ca. 20% af CRC’er [21].

PIK3CA

mutationer forekommer i de “hotspots” placeret i exon 9 (E542K, E545K) og exon 20 (H1047R) er onkogene i CRC cellulære modeller [22], [23].

PIK3CA

genet koder for et lipid kinase, der regulerer, sammen med KRAS, signalveje nedstrøms for EGFR. PI3K initieret signalering inhiberes normalt af PTEN (phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom ti). Vi og andre har tidligere vist, at tabet af PTEN ekspression, som forekommer hos 30% af sporadiske tilfælde, er forbundet med mangel på svar på cetuximab [24], og at

PIK3CA /PTEN

deregulering kan være en biomarkør for modstand i

KRAS

vildtype patienter [25], [26] og cellulære modeller af CRC [27].

samlet set data fra retrospektive analyser viser, at

BRAF

og

PIK3CA

/PTEN ændringer kunne repræsentere yderligere værktøjer til at vælge FRK patienter for EGFR-målrettet behandling [20], [24] – [26]. Ikke desto mindre er en klar identifikation af hvilke biomarkører bør anvendes sammen med

KRAS

i den kliniske indstilling forbliver at blive defineret. Dette skyldes i disse retrospektive analyser: a) forskellige determinanter blev evalueret i hver undersøgelse; og b), kan der opstå en overlappende blandt nogle af disse biomarkører i individuelle patienter. I den foreliggende undersøgelse, vi udførte den første omfattende mutationsanalyse af

KRAS, BRAF

, og

PIK3CA

sammen med evalueringen af ​​PTEN udtryk i en kohorte af 132 mCRC behandlede patienter.

Resultater

Distribution og overlapning af molekylære ændringer i de enkelte tumorer

Som vist i figur 1, analyse af tumorer fra en kohorte af 132 patienter (for klinisk-patologiske træk, se tabel 1) førte til identifikation af 104 molekylære forandringer. Konkret opdaget vi 35

KRAS

mutationer (26,5%), 11

BRAF

mutationer (8,3%), 17

PIK3CA

mutationer (12,3%), og 41 (ud af 114 evaluerbare) tab af PTEN ekspression (36,0%). Mutationer af

KRAS

fandt sted i codon 12 i 24 tilfælde (68,6%) og i codon 13 i 10 tilfælde (28,6%); en dobbelt punktmutation involverer begge kodoner blev påvist i et tilfælde (2,9%).

PIK3CA

mutationer blev fundet enten i exon 9 (4 tilfælde) eller i exon 20 (13 tilfælde). De 11 mutationer af

BRAF

var alle V600E udskiftninger.

Mutationer af

KRAS

BRAF

fandt sted i et gensidigt udelukkende måde, mens et overlappende mønster blev observeret blandt andre rettelser. De hyppigste overlappende fingeraftryk var PTEN tab og

KRAS

mutationer (co-forekommende i 13 patienter), og

BRAF

PIK3CA

mutationer (i 7 patienter) (figur 1)

Foreningen af ​​kliniske variable og objektivt tumorrespons

Blandt kliniske variable (se tabel 1), blev kun kutan toksicitet i forbindelse med objektiv respons (Wald test: p. = 0,002; retning svar = 0-1-≥2). Andre kliniske variabler, herunder køn, stedet primær tumor (colon, sigmoid-rektum krydset, endetarm, andre steder), og alder var ikke signifikant associeret med objektiv tumor respons (p = 0,491, 0,490 og 0,904 henholdsvis; p-værdier blev opnået ved Fishers eksakte test for stedet og køn og efter Wald test for alder). Da patienter udvalgt i denne kohorte blev behandlet med blandede linjer af tidligere kemoterapi (selvom størstedelen modtog 2-3 tidligere linjer af behandling, se tabel 1), undersøgte vi også sammenhængen mellem antallet af tidligere kemoterapi linjer og objektivt tumorrespons , der viser, at denne variabel ikke udøve nogen effekt (Wald test: p = 0,536)

Multivariate analyser af molekylære ændringer og objektiv respons

Multivariat analyse, herunder alle fire molekylære forandringer (justeret ved kutan. toksicitet og antallet af tidligere kemoterapi linjer) viste, at kun

KRAS

mutationer og tab af PTEN udtryk blev uafhængigt forbundet med mangel på objektiv respons (p = 0,001 og 0,001 henholdsvis) (tabel 2). Vigtigere er det, Bayesian informative kriterium ifølge Schwarz foreslået, at en model med

KRAS

mutationer og tab af PTEN udtryk generelt var den bedste strategi til at identificere ikke-responderende patienter i vores kohorte.

multivariate analyser af molekylære ændringer og overlevelse

den multivariate Cox-analyse til OS bekræftede, at den rolle,

KRAS

mutationer og tab af PTEN var signifikant i giver dårligere klinisk resultat (HR = 1,72, p = 0,043 og HR = 0,54, p = 0,012, henholdsvis), med også

BRAF

mutationer udøve en skadelig borderline effekt (HR = 2,31, p = 0,093). Som for PFS, kun

KRAS

mutationer var forbundet med nedsat overlevelse (HR = 1,65, p = 0,033), mens ingen af ​​de andre molekylære forandringer blev demonstreret til selvstændigt påvirke klinisk resultat (tabel 3).

Multivariate analyser af molekylære ændringer og klinisk resultat hos patienter med vildtype

KRAS

mCRC

Vores kohorte består af retrospektive tilfælde og af denne grund, også

KRAS

muterede patienter blev inkluderet i analysen. Efter beslutningen af ​​sundhedsmyndighederne til at begrænse brugen af ​​cetuximab og panitumumab til vildtype

KRAS

mCRC [11] – [13], [28], har denne undergruppe opnået allerstørste relevans. Derfor har vi fokuseret vores analyse på effekten af ​​

BRAF

PIK3CA

mutationer og tab af PTEN i de resterende 96 vildtype

KRAS

patienter. Ved multivariat analyse, tab af PTEN bekræftet en signifikant sammenhæng med manglende respons (p 0,001), mens

BRAF

PIK3CA

var ikke signifikant (p = 0,265, 0,075, henholdsvis) ( tabel 4).

Overlevelse analyser vist i tabel 5 viste, at

BRAF

mutationer (HR = 3,75, p = 0,015) og tab af PTEN (HR = 0,43, p = 0,009 ), men ikke

PIK3CA

mutationer (HR = 1,20, p = 0,672), var signifikant forbundet med nedsat OS, mens ingen af ​​disse ændringer var signifikant associeret med PFS.

Effect af antallet af molekylære ændringer på det kliniske resultat

i lyset af forekomsten af ​​multiple molekylære ændringer inden for samme tumor, undersøgte vi vores kohorte ved at adskille patienter i henhold til det faktiske antal molekylære anormaliteter i samme tumor, dvs. ingen

vs

en

vs

≥ 2 ændringer. Fordi den molekylære status én markør blandt PTEN,

PIK3CA

BRAF

blev ubestemt i 18 tumorer, besluttede vi at udføre denne analyse i de resterende 114 patienter.

sandsynlighed for respons var 51,1% (22/43) blandt patienter uden ændringer, 4,2% (2/47) med en ændring, og 0% (0/24) med ≥ 2 ændringer, og disse forskelle var statistisk signifikante (p 0,0001 ved Fishers eksakte test). Figur 2 viser fordelingen af ​​antallet af mutationer i kohorten og respons på EGFR-målrettet terapi efter antallet af molekylære anormaliteter i de enkelte tumorprøver. Den skadelige virkning af akkumulere ændringer blev også bekræftet ved den logistiske model, der viser, at i gennemsnit en enhedsstat stigning i antallet af ændringer (r), ville betyde en nedgang i odds for reaktion med 96% (odds ratio = 0,04; p 0.00001). Samlet set viser disse resultater, at en nødvendig, men ikke tilstrækkelig betingelse for at nå målet reaktion er at have mere end en af ​​de fire molekylære ændringer. Tilsvarende overlevelse analyser viste, at patienter viste forskellige PFS og OS afhængigt af antallet af molekylære ændringer i deres tumorer. Figur 3 og 4 viser, at PFS og OS var stadigt værre for ingen, 1 eller ≥ 2 molekylære forandringer (p = 0,0002 for både PFS og OS, logrank test). De parvise test justeret for flere sammenligninger dokumenteret, at en dårligere klinisk resultat blev observeret for patienter med tumorer, der bærer ≥ 2 ændringer

vs

1 (p = 0,0198 og 0,0213 for PFS og OS henholdsvis) og ≥2

vs

ingen (p = 0,0002 for både PFS og OS), men ikke for patienter med en ændring

vs

ingen (p = 0,3852 og 0,3807 for PFS og OS henholdsvis). Median PFS var 2,8 måneder (5,0, 2,8 og 1,7 for patienter huser ingen, en eller ≥ 2 ændringer, henholdsvis); median OS var 9,4 måneder (14,6, 9,3 og 7,3 for patienter huser ingen, en eller ≥ 2 ændringer, henholdsvis).

Data fra kohorte af patienter med kendt molekylær status for alle fire markører.

data fra kohorte af patienter med en kendt molekylær status for alle fire markører.

diskussion

på trods af den seneste anbefaling fra ASCO [28] og af sundhedsmyndighederne i Europa [11], [12] og USA [13] af

KRAS

test som en diagnostisk forudsætning for EGFR-målrettede cetuximab- eller panitumumab-baserede terapier for mCRC, svarprocenten til enten af disse lægemidler er begrænset til mindre end 20% i vildtype

KRAS

patienter [10], [14]. De seneste data viser, at

BRAF

eller

PIK3CA

mutationer kan bidrage til yderligere 20-30% af resistens [20], [25], [26]. Derudover også PTEN er blevet foreslået som en selvstændig prædiktiv faktor cetuximab effekt [24], [25], [27]. Men den relative og samlede bidrag fra hver af disse molekylære ændringer klinisk beslutningstagning fortsat uklar. Endvidere, om og i hvilket omfang forekomsten af ​​flere molekylære ændringer påvirker, klinisk respons og patienternes overlevelse er i øjeblikket ukendt.

EGFR

kopi nummer vurderet af FISH er også blevet foreslået at være prædiktiv for kliniske resultater til EGFR-målrettede behandlinger [29] – [33]. Men

EGFR

FISH for mCRC gennemgår mellem laboratorier standardisering [30] og for at undgå indførelsen af ​​forstyrrende elementer, vi valgte ikke at gennemføre denne analyse. Her har vi udnyttet den omfattende molekylære analyse af EGFR nedstrømseffektorer at fastslå deres rolle i at forudsige respons /modstand mod cetuximab eller panitumumab i mCRC. Ved den samtidige vurdering af fire molekylære forandringer, var vi i stand til at identificere op til 70% af ikke-responderende patienter, et resultat, som aldrig er opnået før. Især kun tre patienter med tumorer, der bærer en enkelt ændring var i undergruppen af ​​respondenter, (to patienter med

KRAS

mutationer og én patient med tab af PTEN udtryk), mens ingen andre viste enhver ændring ( “firdoble negativ “tumorer). Dette antyder, at tidligere rapporterede outliers, dvs., meget sjældne tilfælde af mCRC med

KRAS

mutationer reagerer på behandlingen [9], [14], [29], [34] kan være patienter, der kun huser en af ​​disse molekylære ændringer, således ikke samtidig deregulering både MAPK og PI3K veje.

Vores data viser, at enkelte eller flere mutationer af

KRAS

,

BRAF

, eller

PIK3CA

ugunstig indvirkning kliniske resultat at cetuximab- eller panitumumab-baserede terapier; dog skal tages muligheden for, at disse molekylære ændringer kunne være negative prognostiske biomarkører uafhængigt af målrettede behandlinger i betragtning. Den RASCAL retrospektiv undersøgelse foretaget på 2721 CRC patienter viste, at tilstedeværelsen af ​​

KRAS

mutationer er associeret med en 26% øget risiko for dødelig udgang [35]. Imidlertid er for nylig blevet publiceret modstridende data om samme emne. I et fase III studie rapporteret af Karapetis et al. [14], klinisk fordel for patienter med vildtype

KRAS

mCRC blev fundet i Cetuximabs behandlede patienter, men ikke i kontrol patienter behandlet med kun bedste understøttende behandling, hvilket indikerer, at ydelsen ikke skyldtes en prognostisk effekt af

KRAS

. Desuden Roth et al. [Proc Am Soc Clin Oncol Mave Cancers Symposium 206, 2009; Abstr 288] testet den prognostiske værdi pr fase af

KRAS

BRAF

mutationer ved hjælp af CRC tumorprøver fra adjuvans PETACC3 forsøget, og de fandt ingen signifikante effekter på tilbagefald overlevelse for begge mutationer hverken i trin II eller i trin III. Undersøgelser til vurdering af virkningen af ​​andre molekylære forandringer snarere end

KRAS

mutationer er begrænsede. Som for den prognostiske rolle

PIK3CA

og

BRAF

, i et studie med 586 patienter med Barault et al., Nedsat satser for 3-års overlevelse var forbundet med mutationer af mindst et gen blandt

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

[36]. En nylig rapport fra Tol et al. fundet, at tilstedeværelsen af ​​BRAF V600E mutationen var en negativ prognostisk markør i 516 patienter med metastatisk colorectal cancer behandlet med capecitabin, oxaliplatin og bevacizumab baserede regimer [37]. Endelig Ogino et al. rapporterede, at i en serie af 450 patienter med trin I-III CRC som gennemgik helbredende kirurgi, tumor

PIK3CA

mutation var forbundet med kortere cancer-specifik overlevelse. En sådan negativ virkning af

PIK3CA

mutation på prognose var konsistent over det meste lag af kliniske og tumorale prædiktorer for patientens udfald. Interessant nok blev denne bivirkning hovedsageligt begrænset til patienter med

KRAS

vildtype-tumorer [38]

Som konklusion, vi dokumentere, at samtidig påvisning af

KRAS, BRAF

PIK3CA

mutationer og evaluering af tab af PTEN udtryk i FRK patienter har bemærkelsesværdige kliniske implikationer ved at øge evnen til at forudsige resultatet til EGFR-målrettede behandlinger. I lyset af arten af ​​vores patient serie, den mest pålidelige indikator for den prædiktive værdi af biomarkør (er) er objektiv tumor respons. Fortolkning af overlevelse analyser skal faktisk tage hensyn til en mulig begrænsning på grund af patienter behandlet med blandet foregående linje (r) med kemoterapi, herunder en 10% (13/132) af patienterne behandlet med første-line cetuximab monoterapi. På den anden side, studiet af sådanne patienter repræsenterer en enestående mulighed for at fastslå den prædiktive værdi af et givet biomarkør uden indflydelse af kemoterapi, enten sideløbende eller forrige, samt udvælgelse, der udøves af andre behandlinger. I lyset af disse overvejelser, vi foreslår her en ny algoritme til at afgøre den kliniske anvendelse af EGFR-målrettede monoklonale antistoffer, der er baseret på objektive responsrater (figur 5 og 6). Denne nye tilgang fortjener validering i prospektive studier med cetuximab- eller panitumumab-baserede behandlinger i mCRC før have en effekt som klinisk praksis skiftende. Vigtigt er det, fandt vi, at ca. 20% af FRK ikke responderede ikke harbor mutationer af

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

eller tab af PTEN udtryk og vi foreslår, at definere disse tumorer som “firdoble negativ”. Den manglende reaktion i firdoble negative patienter kan skyldes flere årsager, herunder, men ikke begrænset til: a) den begrænsede følsomhed nuværende sekventering metoder til at opdage punktmutationer i DNA ekstraheret fra FFPE tumorer [39]; b) den onkogene deregulering af de samme fire gener ved anden mekanisme derefter mutationer (såsom forstærkning som rapporteret for

PIK3CA

); c) forekomsten af ​​ændringer i andre centrale elementer i EGFR-afhængige signal kaskade (som fx AKT eller MAPK); og d) tilstedeværelsen af ​​genetiske ændringer i andre end EGFR tyrosinkinasereceptorer, giver en alternativ vej for overlevelse og /eller proliferation. Yderligere molekylære dissektioner af EGFR-initieret onkogen signalering kaskade sandsynligvis vil være nyttige i at forbedre skræddersy EGFR målrettede behandlinger. Samlet set vores resultater understrege relevansen af ​​at bruge molekylære-baserede algoritmer til at flytte behandling af solide tumorer i æra af personlig kræftmedicin.

Det område markeret med gråt i den stiplede linie boksen beskriver hypotese genereres i denne undersøgelse.

Vi foreslår at definere som “firdoble negative” den mCRCs mangler ændringer i

KRAS

,

BRAF

, PTEN og

PIK3CA

.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Prøverne blev indsamlet i henhold til de etiske krav og regler og opnå skriftlig tilladelse som godkendt af revisionen bestyrelsen for Ospedale Niguarda Ca ‘Granda, Milano, Italien og Ospedale San Giovanni, Bellinzona, Schweiz.

patientpopulation og behandlingsregimer

Vi retrospektivt analyseret 132 patienter med EGFR-positive mCRC på Ospedale Niguarda Ca ‘Granda (Milano, Italien), ved Oncogenomics center, Institut for Cancer Research og behandling, (Candiolo, Italien), eller ved Patologisk Institut (Locarno, Schweiz). Patienterne gav informeret samtykke og blev behandlet med panitumumab- eller Cetuximabs-baserede regimer på Ospedale Niguarda Ca ‘Granda eller ved Onkologisk Institute of Southern Schweiz (Bellinzona, Schweiz). Patienterne blev udvalgt på baggrund af dokumentation for, at behandlingen resultat kunne tilskrives kun administration af panitumumab eller cetuximab. Patienternes kliniske karakteristika er angivet i tabel 1. Med undtagelse af 13 patienter, som fik cetuximab som frontline monoterapi [5], havde de andre ikke mindst et tidligere kemoterapiregime. Tyve-tre (17,4%) modtog panitumumab monoterapi, femten (11,4%) patienter cetuximab monoterapi, og fire og halvfems (71,2%) cetuximab plus irinotecan-baseret kemoterapi. For patienter, der skred frem irinotecan-baseret kemoterapi, blev cetuximab administreres med irinotecan i samme dosis og tidsplan, som de var resistente. Behandlingen blev fortsat, indtil progressiv sygdom (PD) eller toksicitet forekom, som pr standard kriterier [40].

Klinisk evaluering og tumor respons kriterier

Klinisk respons blev vurderet hver 6-8 uger med radiologisk undersøgelse (CT eller MR) i henhold til RECIST kriterier. Objektiv tumorrespons blev klassificeret i partiel respons (PR), stabil sygdom (SD), og PD. Patienter med SD- eller PD blev også defineret som ikke-respondenter. Reaktion på terapi blev også evalueret efterfølgende af uafhængige radiologer.

Molekylær analyser

formalinfikseret paraffinindlejrede (FFPE) tumorblokke blev gennemgået for kvalitet og tumor indhold. En enkelt repræsentativ blok, fra enten den primære tumor eller levermetastaser, afhængigt af tilgængelighed, der indeholder mindst 70% af maligne celler, blev udvalgt til hvert enkelt tilfælde. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp Mini kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Molekylære analyser blev udført på vævsprøve fra primær tumor anvendt til indledende diagnose i 130 ud af 132 sager. I to tilfælde blev udført kun analysen på metastatiske steder (lever).

PTEN udtryk

PTEN proteinekspression blev evalueret ved immunhistokemi på 3 um FFPE vævssnit som rapporteret [24] med nogle modifikationer . Kort fortalt blev anti-PTEN AB4 (Thermo Fisher Scientific, CA, USA) med 1:200 fortynding og PTEN Ab2 (NeoMarkers, Fremont, CA) med 1:50 fortynding bruges på Niguarda Hospital og på Patologisk Institut for Locarno, henholdsvis. PTEN proteinekspression blev primært detekteret på cytoplasmatisk niveau, mens meget få tilfælde viste også nukleare positivitet. Tumorer blev betragtet negativt, dvs. med tab af PTEN ekspression, når fravær eller reduktion af immunfarvning blev set hos mere end 50% af cellerne i forhold til interne kontroller (dvs. vaskulære endotelceller og nerver). Normal endometrium blev anvendt som ekstern positiv kontrol. Vurderingerne blev udført af to uafhængige patologer uden kendskab til kliniske data eller resultater af molekylære analyser.

Mutationsanalyse af

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

i tumorprøver

Vi søgte efter

KRAS

(exon 2), for

BRAF

(exon 15) og for

PIK3CA

(exon 9 og 20) mutationer.

KRAS

exon 2 omfatter codon 12 og 13,

BRAF

exon 15 indbefatter codon 600,

PIK3CA

exon 9 omfatter codon 542 og 545 og

PIK3CA

exon 20 omfatter codon 1047, hvor det store flertal af mutationer forekommer i disse gener [29]. Listen over primere anvendt til mutationsanalyse er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning. Alle prøver blev underkastet automatiseret sekventering ved ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Alle muterede tilfælde blev bekræftet to gange med uafhængige PCR-reaktioner.

Statistiske analyser

Alle data blev analyseret med de egnede deskriptive statistiske metoder, efter kontrol deres fordelinger ved hjælp af Shapiro-Wilk test. Krydstabuleringer af kvalitative variabler blev analyseret med Fishers eksakte test, mens sammenligninger mellem kontinuerlige variabler blev udført med Students t eller Mann-Whitney U test. Logistisk regression med Wald test, og nøjagtige logistisk regression (afhjælpe en-vejs årsagssammenhæng, såsom det tilfælde, hvor alle patienter i en gruppe udviser en positiv eller negativt resultat), med nøjagtige p-værdi (som sandsynligheden for at observere en mere ekstrem værdi med hensyn til tilstrækkelige statistik for en given regression parameter) blev anvendt til at vurdere univariate og multivariate analyse med binær endpoint. Overlevelsen blev udført med Kaplan-Meier overlevende funktion efterfulgt af logrank test, og med Cox model; proportional hazard antagelse blev kontrolleret ved hjælp af de Schoenfeld residualerne. Statistisk signifikans blev antaget for p 0,05. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Stata /SE 10.1 (den StataCorp, College Station, TX-USA).

Tak

Vi takker Salvatore Artale til klinisk pleje, Federico Pozzi for data management, Carlo Zanon og Silvia Benvenuti for sekvensanalyse og datastyring, og Roberta Schiavo for tilsynet med tumorprøver indkøb.