PLoS ONE: Behandling af kræft som en smitsom sygdom-virale antigener som nye mål for behandling og Potentiel Forebyggelse af tumorer i Viral Ætiologi

Abstrakt

Baggrund

Næsten 20% af de menneskelige kræftformer verdensplan har en smitsom ætiologi med de mest fremtrædende eksempler er hepatitis B og C virus-associeret hepatocellulært carcinom og human papillomavirus-associeret livmoderhalskræft kræft. Der er et presserende behov for at finde nye tilgange til behandling og forebyggelse af virus-associerede kræftformer.

Metodologi /vigtigste resultater

Virale antigener er ikke tidligere blevet betragtet som mål for behandling eller forebyggelse af virus associeret cancere. Vi antager, at det var muligt at behandle eksperimentel HPV16-associeret cervixcancer (CC) og Hepatitis B-associeret hepatocellulært carcinom (HCC) ved at målrette virale antigener udtrykt på cancerceller med radiomærkede antistoffer mod virale antigener. Behandling af eksperimentel CC og HCC tumorer med

188Re-mærkede mAb’er til E6 og HBX virale proteiner, henholdsvis resulterede i signifikant og dosisafhængig retardering af tumorvækst i sammenligning med ubehandlede mus eller mus behandlet med umærkede antistoffer.

konklusioner /betydning

Denne strategi er fundamentalt forskellig fra de tidligere anvendelser af radioimmunterapi i onkologi, som målrettet tumor-associerede humane antigener og løfter øget specificitet og minimal toksicitet af behandlingen. Det rejser også en spændende mulighed for at forhindre virus-associerede kræftformer i kronisk inficerede patienter ved at fjerne celler inficeret med onkogene virus, før de forvandle sig til kræft

Henvisning:. Wang XG, Revskaya E, Bryan RA, Strickler HD, Burk RD, Casadevall A, et al. (2007) Behandling af kræft som en smitsom sygdom-virale antigener som nye mål for behandling og Potentiel Forebyggelse af tumorer i Viral Ætiologi. PLoS ONE 2 (10): E1114. doi: 10,1371 /journal.pone.0001114

Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: Oktober 5, 2007; Accepteret: 10. oktober 2007; Udgivet 31. oktober, 2007

Copyright: © 2007 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. E. Dadachova er støttet af NIH tilskud AI60507; A. Casadevall – af NIH tilskud AI33774, AI33142, AI52733, HL59842, og U54 AI157158; R. D. Burk af NIH tilskud CA078527. Dette arbejde blev støttet delvist af Albert Einstein College of Medicine Comprehensive Cancer Center og Center for AIDS Research på Albert Einstein College of Medicine og Montefiore Medical Center finansieret af National Institutes of Health (NIH AI-51519).

Konkurrerende interesser: patentansøgning for denne teknologi er blevet indgivet til US PTO

Introduktion

Det er blevet anslået, at næsten 20% af de menneskelige kræftformer verdensplan har en smitsom ætiologi [1]. De fleste af disse tumorer er af viral oprindelse, og omfatter fast etablerede sammenslutninger af hepatitis B-virus (HBV) og hepatitis C-virus (HCV) med hepatocellulært carcinom; og af human papillomavirus (HPV) -med kræft i livmoderhalsen, anus, vulva, vagina; samt sammenslutninger af oropharynx Epstein-Barr virus (EBV) med lymfom og nasopharyngeal carcinoma; human T lymfotroft virus type 1 (HTLV-1) -med voksen T-celle leukæmi /lymfom og human herpesvirus 8 (HHV-8) -med Kaposi sarkom [2] – [7]. I kombination, disse virus-associeret tumorer udgør en byrde på ca. 1,3 millioner tilfælde af kræft hvert år, med HBV /HCV-associeret leverkræft tegner sig for 523,000 sager, og HPV-associerede tumorer tegner sig for 561.000 sager [8]. Behovet for at finde nye tilgange til behandling og forebyggelse af virus-associerede kræftformer er indlysende og presserende.

radioimmunterapi (RIT) udnytter antigen-antistof-binding til at levere cytotoksiske doser af partikler stråling til tumorceller [9], [10]. RIT, for eksempel, har været anvendt med succes behandle ildfaste og tilbagevendende lymfomer, med to radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer (mAb) rettet mod CD20 (Zevalin® og Bexxar®) har modtaget FDA godkendelse til dette formål. Det er sandsynligt, i virkeligheden, at RIT bliver en første linie behandling af follikulært lymfom [11]. Denne “traditionelle” kræft RIT mål “selv” antigener. Vi har for nylig påvist, at RIT har også bredt potentiale til behandling af svampe- og bakterieinfektioner gennem målretning af mikrobielle antigener med radiomærkede mAb’er i eksperimentelle modeller af svampe- og bakterieinfektioner [12], [revideret i 13]. Desuden fandt vi, at HIV-1-inficerede celler kunne elimineres in vitro og in vivo ved at målrette gp120 og gp41 virale glycoproteiner udtrykt på overfladen af ​​inficerede celler med radiomærkede virale protein-specifikke mAb’er [14].

vi antager, at RIT målrettet mod virale antigener kan anvendes i behandlingen af ​​en lang række virale infektionssygdomme og virus-associerede tumorer [15], [16]. Mange virus-associerede kræftformer udtrykker virale antigener enten internt eller på deres overflader. Det er vigtigt at bemærke, at selv virale antigener udtrykkes intracellulært er potentielle mål for RIT, da tumor celle omsætning vil sandsynligvis resultere i frigivelse af disse proteiner ind i det interstitielle rum af tumoren. Denne metode er grundlæggende forskellig fra de tidligere beskrevne anvendelser af RIT som målretter tumorassocierede antigener, der er “selv” (dvs. human) proteiner. Ved at målrette virale og ikke “selv” proteiner er det håbet, at radioaktivt mærkede mAbs kan være mere specifikt koncentreret inden for tumorvæv, hvilket resulterer i større effektivitet og mindre toksicitet. Her beskriver vi de proof-of-princippet eksperimenter der sigter mod at påvise, at behandling af eksperimentel HPV16-associeret livmoderhalskræft (CC) og Hepatitis B-associeret hepatocellulært carcinom (HCC) ved at målrette virale antigener udtrykt på cancerceller med radioaktivt mærkede antistoffer mod virale antigener .

Resultater

Valg af en celle kombination line-antigen til at fungere som en eksperimentel livmoderhalskræft (CC) model

for at evaluere potentialet i RIT at målrette virale antigener i cancere i viral ætiologi, vi har brug for at identificere tumorcellelinier, der udtrykte målantigenet og kunne også implanteres i nøgne mus. Vi valgte HPV16 og HPV18 cellelinjer, da disse to HPV-typer tegner sig for ca. 70% af livmoderhalskræft og en betydelig del af hoved og hals tumorer [17], [18]. E6- og E7-oncoproteiner blev betragtes som de bedste potentielle antigene mål, eftersom disse proteiner udtrykkes i det væsentlige alle cervicale cancerceller, mens andre virale gener kan gå tabt. Mutationsanalyse har vist, at E6 og E7 virale oncoproteiner er nødvendige og tilstrækkelige for immortalisering af humane celler ved HPV. Derfor har vi vurderet ved Western blot ekspressionen af ​​E6 og E7 i tre humane cervikale carcinomcellelinjer-HPV16-positive CaSki og SiHa cellelinjer og HPV18-positive HeLa S3 cellelinie. Mens CaSki celler udtrykte både E6 og E7-antigener (. Figur 1a, b), SiHa og HeLa S3 cellelinjer havde ingen målbar ekspression af E6 antigen (resultater ikke vist), men gjorde udtrykkelig E7-protein (figur 1d, e.); omend niveauet af E7-ekspression var lav i SiHa-celler

a) E6 fra proteinekstrakter af CaSki-celler behandlet med MG132 i 3 timer (Fig 1d.).; b) E7 fra proteinekstrakter af CaSki-celler behandlet med MG132 i 3 timer; c) E6 fra proteinekstrakter af CaSki-celler behandlet med MG132 i 6 timer; d) E7 fra proteinekstrakter af SiHa-celler behandlet med MG132 i 3 timer; e) E7 fra proteinekstrakter af HeLa S3-celler behandlet med MG132 i 3 timer; f) HBX fra protein ekstrakter af Hep 3B2.1-7 celler behandlet med MG132 i 3 timer.

proteasominhibitoren MG132 reducerer nedbrydningen af ​​ubiquitin-konjugerede proteiner i mammale celler uden at påvirke ATPase eller isopeptidase aktiviteter. MG132 er blevet rapporteret at resultere i forhøjede niveauer af E6 og E7 proteiner i livmoderhalskræft celler [19], [20]. Som højere mængder af målantigener potentielt kan forbedre RIT resultater, undersøgte vi indflydelsen af ​​forbehandling af CC-celler med proteasominhibitor MG132 på niveauerne af E6 og E7-ekspression. Fig. 1a og b viser, at forbehandling med MG132 i CaSki-celler medførte en stigning i ekspression af både E6 og E7, med det højeste niveau af ekspression opnået med anvendelse af 2 og 5 ug /ml MG132 som aftog når højere doser blev anvendt. Forlængelse af inkubationstiden for CaSki celler med MG132 resulterede ikke i større E6 ekspression. Faktisk observerede vi faldt E6 udtryk med langvarig CaSki celle udsættelse for MG132 (fig. 1c), som kunne afspejle en stigning af protein nedbrydning efter mere end tre timers inkubation. Lignende eksperimenter blev udført for E7-protein i SiHa og HeLa S3 cellelinjer (fig. 1d, e). SiHa celler viste ikke en mærkbar stigning i E7 niveauer (figur 2d.); henviser til, at E7 niveauer gjorde stigning lidt for HeLa S3 celler behandlet med en og 2 pg /mL MG132 (Fig. 1e). Givet pålidelig og høj ekspression af E6 i CaSki celler såvel som deres evne til at producere tumorer i nøgne mus-vi valgte CaSki-celler og E6-proteinet til yderligere in vitro- og in vivo forsøg.

a, b) immunofluorescens af faste og permeabiliserede tumorceller. Venstre paneler viser lysmikroskopi billeder af cellerne. Stærkt beskadigede celler er markeret med pile. Højre paneler viser immunfluorescerende billeder af de samme objektglas behandlet med virale protein-specifikke mAb’er efterfulgt af FTIC-konjugeret polyklonalt antistof mod muse IgG’er: a-CaSki-celler og E6-specifikke C1P5 mAb, b-Hep 3B2.1-7 celler og HBx- specifik 4H9 mAb; c) immunhistokemi af CaSki tumorer. Venstre panel viser binding af E6-specifik mAb C1P5. Højre panel viser fravær af binding af kontrol-mAb 18B7; d) western blot af Hep 3B2.1-7 tumor med HBx-specifikke mAb 4H9.

Valg af en cellelinje-antigen kombination til at fungere som en eksperimentel hepatitis B-associeret hepatocellulært carcinom (HCC) model

Vi evaluerede to Hepatitis B-associerede virale proteiner som potentielle mål for RIT-HBx og preS2. HBx er mistænkt for at have en rolle i hepatocarcinogenese og i modsætning til andre potentielle valg, HBx har ingen homologi med værtsproteiner. Endvidere det gen, der koder for HBx bevares, selv når HBV-genomet bliver integreret i HCC, mens andre HBV gener kan gå tabt [21], [22]. PreS2 er også mistænkt for at have en rolle i hepatocarcinogenese (dvs. gennem transaktivering af cellulære gener vigtige i vækstkontrol) [22]. HBx protein blev konsekvent påvist ved Western blot af HCC cellelinie Hep 3B2.1-7 hjælp 4H9 mAb og dets ekspression var uafhængig af forbehandling med MG132 proteasominhibitor (fig. 1f), hvorimod preS2 ikke blev påvist (resultater ikke vist ). Derfor valgte vi kombinationen Hep 3B2.1-7 cellelinje og HBx protein til yderligere forsøg.

Binding af antistoffer mod virale antigener i ikke-levedygtige celler

For at finde ud af, om antistoffer til virale proteiner, som blev identificeret som mål for RIT vil kunne binde til virale proteiner i ikke-levedygtige tumorceller, udførte vi immunfluorescens af faste og permeabiliseres CaSki og Hep 3B2.1-7 celler med mAb’er C1P5 til E6 og 4H9 til HBX proteiner henholdsvis efterfulgt af FITC-konjugeret polyklonalt antistof mod muse IgG. Mens bindingen af ​​C1P5 mAb til cellerne, som var næsten intakt var svag, de stærkt beskadigede celler med gennemtrængelige membraner viste lyse fluorescens peger på binding af C1P5 til E6 (fig. 2a). Fikseringen og permeabilisering også gjort muligt for mAb 4H9 til at binde til HBx protein (fig. 2b). Ingen binding af kontrol IgG1 mAb mod faste og permeabiliseres CaSki eller Hep 3B2. 1-7 celler blev observeret (resultater ikke vist).

Angivelse af virale proteiner i tumorerne

For at bekræfte, at CaSki og Hep 3B2.1-7 celler fortsatte med at udtrykke E6 og HBx viral antigener i henholdsvis de inducerede tumorer i nøgne mus, udførte vi immunhistokemi og immunoblot for E6 og HBx hhv. Western blot blev valgt til Hep 3B2.1-7-inducerede tumorer baseret på de rapporterende litteratur vanskeligheder i pålideligt at detektere HBx protein i organer ved immunhistokemi [23]. Der var intens farvning af E6 specifikke mAb C1P5 i CaSki tumorer (fig. 2c, venstre panel) med ingen farvning observeret med kontrol IgG1 mAb (fig. 2c, højre panel). Western blot af Hep 3B2.1-7-inducerede tumorer afslørede tilstedeværelsen af ​​HBx protein (fig. 2d). Tilstedeværelsen af ​​mål-virale proteiner i CC og HCC eksperimentelle tumorer billede muligheden for at målrette disse antigener in vivo med radiomærkede mAb’er til scintigrafisk billeddannelse og terapi.

Biofordeling af radiomærkede mAb’er mod virale proteiner i CaSki og Hep 3B2.1-7-tumor bærende nøgne mus

Vi udførte billedbehandling og biofordeling eksperimenter med

188Re-radioaktivt mærket C1P5 og 4H9 mAbs i CaSki og Hep 3B2.1-7-tumor bærende nøgne mus, henholdsvis at fastslå lokaliseringen af ​​mAb’er mod tumorerne. Ved 24 timer efter injektion CaSki tumoren var synlig på scintigrafisk billede af en mus injiceret med

188Re-C1P5 mAb (fig. 3a) i modsætning til billedet af en mus injiceret med irrelevant

188Re-18B7-mAb (fig. 3b). Vi beregnede også tumoren til muskel-forholdet fra 48 timer biofordeling resultater, som var 10:01 til

188Re-C1P5 versus 03:01 til

188Re-18B7. Den samlede optagelse af

188Re-C1P5 mAb i tumorerne efter 48 timer efter injektion var 2,0 (± 0,3)% af den injicerede dosis pr gram tumor. Andre organer som lever, milt og blod viste niveauerne af optagelse karakteristisk for IgG1 mAb’er. For Hep 3B2.1-7 udnyttet vi en anden tilgang til at bevise specificiteten af ​​mAb optagelse i tumoren ved hjælp af en model, når en mus bærer to forskellige tumorer-en af ​​tumor af interesse og en anden-irrelevant kontrol tumor. Nøgne mus udført A2058 human metastatisk melanom tumor på højre flanke og Hep 3B2.1-7 til venstre (fig. 3c). Musene blev injiceret med

188Re-4H9 mAb og afbildes scintigraphically ved 24 timer efter injektion. Antistoffet lokaliseret til Hep 3B2.1-7 tumoren i modsætning til det irrelevante kontrol melanom tumor (fig. 3d). Evnen af ​​radiomærkede mAbs til virale antigener at lokalisere disse tumorer hos mus berettigede en vurdering af RIT i disse in vivo kræftmodeller.

RIT af CaSki og Hep 3B2.1-7-tumor bærende nøgen mus

for at evaluere den terapeutiske effekt af

188Re-C1P5 mAb i CaSki tumor-bærende mus blev dyrene injiceret med enten 350 uCi

188Re-C1P5 mAb eller matchende mængder (30 ug pr mus) af umærket ( “kold”) C1P5 mAb eller venstre ubehandlet. Fig. 4a viser ændringen i tumorvolumen i de behandlede og kontrolgrupperne. RIT med 350 uCi

188Re-C1P5 mAb standset fuldstændigt tumorvækst og resulterede i reduktion af volumen (fig. 4a og b), medens ubehandlede tumorer voksede aggressivt (fig. 4a og c) og ubehandlede kontrolmus måtte aflivet på Dag 20 efterbehandling (P 0,01). Interessant administration af “kold” C1P5 mAb resulterede også i signifikant forsinkelse i tumorvækst, hvilket kan skyldes induktion af inflammation og supplere kaskader af mAb

a) ændringer i tumorvolumen.; b) mus behandles med 350 uCi

188Re-C1P5 mAb; c) kontrol mus (både mus vist på dag 20 efter behandling).

For RIT af Hep 3B2.1-7 tumorer i nøgne mus, vi oprindeligt ansat den samme eksperimentelle design som for CaSki tumorer ved hjælp 350 pCi

188Re-4H9 mAb, “kolde” mAb-behandlede kontroller og ubehandlede grupper. Administration af 350 uCi

188Re-4H9 mAb resulterede i langsommere tumorvækst men ikke arrestere det ligesom i tilfælde af CaSki tumorer. “Cold” 4H9 mAb ikke havde en virkning på tumorvækst. For at finde den mest effektive dosis af radioaktivt mærket mAb til at forsinke væksten af ​​meget aggressiv Hep 3B2.1-7 en dosis respons eksperiment blev udført. Den terapeutiske effekt af

188Re-4H9 mAb begyndte at manifestere sig i en dosis på 280 pCi og effekten øges med hver efterfølgende stigning i dosis (figur 5a.) (P 0,02). Ved afslutningen af ​​forsøget tumorerne fra kontrol- ubehandlede mus og mus i det højeste 600 uCi gruppe blev analyseret histologisk. Styringen tumor bestod af moderat differentierede hepatoid celler med spredte små foci af nekrose, fibrin trombose, og blødning. Neoplastiske celler havde rigelig eosinofil til fint vakuoliserede cytoplasma og mellemstore kerner til meget store og anaplastisk kerner indeholder flere store eosinofil nucleoli med flerkernede celler lejlighedsvis indlysende. Mitoseindekset var høj, og der blev spredt apoptotiske celler (Fig. 5b). I modsætning hertil RIT-behandlede tumorer havde signifikant mere nekrose og blødning end set i kontrollerne. Den morfologiske udseende af tumorcellerne havde ofte en mere vakuolefyldt cytoplasma tyder degeneration (figur 5c.)

a) ændringer i tumor volumen.; b) kontrollerer ubehandlet mus; c) mus behandlet med 600 uCi

188Re-4H9 mAb. Både mus vist på dag 18 efter behandling. I b og c lavere paneler viser H henviser til, at kan andre virale gener tabt under den etapevise proces med tumorigenese. Tilsvarende i HCC, er HBx ekspression menes at blive opretholdt. Der er imidlertid en vigtig bekymring målrette disse tre proteiner med radiomærkede mAb’er-deres subcellulære lokalisering. Både E6 og E7 er placeret i kernen, og HBx findes i kernen og lejlighedsvis i cytoplasmaet. Som følge heraf kan de radioaktivt mærkede mAb’er mod disse proteiner binder kun til deres respektive antigener, når de frigives fra de døde celler, eller når tumorceller permeabiliseres. For at gennemføre disse eksperimenter, vi valgte CaSki cellelinie som en CC-model, da vi fandt det udtrykte E6 og E7 på høje niveauer i vitro og tumorer voksede aggressivt i nøgne mus efter den latente periode. Den Hep 3B2.1-7 cellelinje blev valgt som en HCC model, efter vi observeret, at det udtrykte HBx på høje niveauer og vises hurtig tumorvækst i mus.

immunofluorescens af tumorcellerne og immunhistokemi og vestlige blot af tumorerne afslørede rigelige mængder af E6 og HBX antigene mål i CasKi- og Hep 3B2.1-7-inducerede tumorer, (fig. 2). Tilstedeværelsen af ​​tilgængelige antigen til de radiomærkede mAb’er er sandsynligvis et resultat af protein-frigivelse fra tumorceller undergår hurtig omsætning. Følgelig er de radiomærkede antistoffer akkumuleret i tumorvævet, således at de kunne blive afbildet scintigraphically (fig. 3). En af fordelene ved at målrette virale antigener i tumorerne, at de kun findes i maligne celler. I modsætning hertil Chen og kolleger ikke observeret nogen forskelle i tumoroptagelse for både specifikke og uspecifikke radiomærkede antistoffer i deres biofordeling eksperimenter når de målrettede intranucleær histoner [24].

Evnen af ​​radiomærkede mAb’er mod virale proteiner til levere cytotoksisk radionuklid 188-rhenium til tumorcellerne lettet vellykkede resultater af RIT med disse mAbs i tumor-bærende mus. Indgivelsen af ​​350 uCi dosis af E6-bindende

188Re-C1P5 mAb mod CaSki tumorbærende mus stoppet fuldstændigt tumorvækst og endog resulteret i regression (fig. 4). Det er også sandsynligt, at der var nogle tilføjet terapeutisk fordel fra antistoffet selv som umærkede antistoffer kan mediere inflammatoriske reaktioner og aktivere kompliment. I fremtiden vil det være værd at undersøge, om der kunne opnås øget cellulære niveauer af E6 og E7 oncoproteiner med forbehandling brug af MG132 in vivo, og om dette resulterer i en terapeutisk fordel. Dosis-respons-eksperimenter i mus, der bærer Hep 3B2.1-7 HCC-tumorer viste klart en dosisafhængighed for den terapeutiske virkning (fig. 5). Det faktum, at højere doser af radioaktivt mærket mAb var nødvendige for at frembringe en terapeutisk virkning i HCC end i cervikale tumor kan afspejle aggressivitet Hep 3B2.1-7 og den kendte radioresistance af levertumorer i sammenligning med de forholdsvis radiosensitive cervikale carcinomer [25] . Det er også bemærkelsesværdigt, at terapeutiske gevinster i både eksperimentelle tumorer blev opnået med doser af radioaktivitet, der er et godt stykke under den maksimalt tolererede dosis på ca. 800 uCi for

188Re-mærkede IgG1s i mus [26], og som sådan anvendte doser var forventes ikke at have nogen kort- eller langsigtede toksicitet.

det er vigtigt at understrege, at når behandling af virale-associerede kræftformer ved at målrette viralt antigen ikke hver celle i tumoren skal udtrykke virale antigener til en terapeutisk effekt . Langtrækkende emittere såsom

188Re (emission rækkevidde i væv 10 mm) udsender stråling i et 360 ° kugle og følgelig kan dræbe celler i nærheden af ​​antigenet placering. Endvidere en høj koncentration af det målrettede virale antigen sandsynligvis ikke nødvendig til afgivelse af en terapeutisk dosis til tumoren, ifølge vores nylige model af RIT for melanom (målrettet mod melanin, som også er en intracellulær antigen). Denne model viste, at strålingsdosis leveret til tumoren er stort set uafhængig af melanin (antigen) koncentration [27].

Denne fremgangsmåde også giver løfte at forhindre viral-associerede cancere i kronisk inficerede individer for eksempel, vedvarende HPV-infektion i HIV-inficerede individer sætter dem i betydelig risiko for at udvikle HPV-associerede kræftformer. Mens der er immunterapi for HBV og HCV, at mange patienter ikke opnår viral clearance og behandlingen er forbundet med betydelig morbiditet. Der er heller ingen vaccine til HCV, og mange millioner af mennesker verden over er smittet med HBV trods af tilgængeligheden af ​​en effektiv vaccine. Celler vedholdende inficeret med HPV, HBV, HCV eller andre vira potentielt kunne elimineres med RIT målrettet til virale antigener, før de transformeres til maligne fænotype.

Afslutningsvis udførte vi in ​​vitro og in vivo forsøg for at vurdere en hidtil ukendt strategi til behandling af virus associeret tumorer anvendelse af radioaktivt mærkede mAb’er rettet mod virale proteiner. Denne strategi er fundamentalt forskellig fra tidligere anvendelser af RIT i onkologi, der er målrettet tumor-associerede humane antigener dermed resulterer i væsentlig optagelse af radioaktivt antistof i normale væv, hvilket fører til toksicitet. Resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at ved at målrette stedet virale og ikke selvproteiner kan det være muligt for radiomærkede mAb’er at koncentrere sig mere specifikt inden for tumorvæv, hvilket resulterer i større effektivitet og mindre toksicitet. Denne strategi rejser også en spændende yderligere mulighed for at forhindre virus-associerede kræftformer i kronisk inficerede patienter ved at fjerne celler inficeret med onkogene virus, før de forvandle sig til kræft.

Metoder

Antistoffer

mus mAbs fra Abcam C1P5 til HPV16 E6 + HPV18 E6 og TVG 701Y til HPV 16 E7 blev brugt i CC eksperimenter. Muse-mAb 4H9 til HBV HBx (Aviva, Cat # AVAMM2005) og muse-mAb S26 til HBV-protein Hbs (Gene Tex Inc. Cat # GTX18797), som krydsreagerer med HBsAg preS2 antigen blev anvendt i HCC eksperimenter. Muse 18B7 mAb (IgG1) til

C. neoformans

[28] blev anvendt som et irrelevant kontrol for alle specifikke antistoffer. Kanin polyklonalt antistof konjugeret med alkalisk phosphatase til muse-IgG H & L blev indkøbt fra Abcam og anvendt som sekundært antistof i Western blot

cellelinier og celledyrkning Salg

Tre humane cervikale carcinoma cellelinier:. Hela S3, SiHa og CaSki blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). Celler blev dyrket rutinemæssigt i DMEM /HAM F-12K (Sigma, 01:01) indeholdende 10% FBS (Sigma) og 1% penicillin-streptomycin-opløsning (Sigma, penicillin 10.000 U og streptomycin 10 mg /ml) ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. Den cellelinie Hep 3B2.1-7 (

Homo sapiens

hepatatocellular karcinom) blev købt fra ATCC. Den indeholder et integreret hepatitis B-virus-genomet og blev afledt af hepatocellulært carcinom væv 8-årig sort dreng. Celler blev dyrket rutinemæssigt i Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC) indeholdende 10% FBS (Sigma) ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. Cellelag i 75 ml kolbe blev dispergeret ved tilsætning af 2 ml 1 × Trypsin-EDTA-opløsning (Sigma, 0,25% (vægt /volumen) trypsin-0,53 mM EDTA) ved stuetemperatur i 15 minutter. A2058 cellelinie afledt fra en lymfeknude-metastase fra patient med malignt melanom blev opnået fra ATCC. Cellerne blev holdt som monolag i Dulbeccos modificerede Eagles medium med 4 mM L-glutamin, 4,5 g /l glucose, 1,5 g /l natriumbicarbonat, suppleret med 10% føtalt bovint serum og 5% penicillin-streptomycin-opløsning ved 37 ° C og 5% CO

2, og høstet ved anvendelse af 0,25% (vægt /volumen) Trypsin-EDTA-opløsning. Løbende vedligeholdelse af alle cellelinier blev udført ifølge ATCC protokoller.

Western blots

Cellepellets blev suspenderet i lysisbuffer (4% SDS, 20% glycerol, 0,5 M Tris-HCI (pH 6.8), 0,002% bromphenolblåt og 10% β-mercaptoethanol). Proteinprøver blev kogt i vand i 15 min før kører SDS-PAGE. Tyve halv seks pi proteinopløsning blev fyldt i hver brønd på 12% præfabrikeret SDS-PAGE-gel (Bio-Rad). SDS-PAGE blev anvendt til at overvåge de relative proteinmængder i prøverne. Tolv procent SDS-PAGE-gel blev anvendt til at adskille proteiner, og elektroforese blev udført under anvendelse Mini-Protean® 3 Cell-system (Bio-Rad). Efter elektroforese blev gelen overført til PVDF transfer buffer (25 mM Tris, 190 mM glycin og 2,5% (v /v) methanol) i 5 min. Derefter blev proteiner overført fra gelen til Immun-Blot ™ PVDF-membran (Bio-Rad) på Semi-tør Elektroforetisk Transfer Cell (Bio-Rad) ved 15 V i 17 min. Membranen blev gennemvædet med blokerende buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA og 150 mM NaCl) i 5 minutter, og derefter overført til blokeringsopløsningen (5% fedtfri tørmælk i den blokerende buffer) , ryster blidt i en time. Membranen blev inkuberet i TBST-opløsning (0,1% Tween-20, 25 mM Tris-HCl (pH 7,6) og 500 mM NaCl) indeholdende 1:3000 fortyndet primært antistof ved stuetemperatur i 1 time med forsigtig rystning. Derefter blev membranen vasket med TBST tre gange (10 min per vask). Membranen blev hybridiseret med det sekundære antistof konjugeret med alkalisk phosphatase (Polyklonalt til muse-IgG H & L (alkalisk phosphatase)) i TBST med en 1:100,000 fortynding. Efter tre gange vask med TBST blev membranen inkuberet i CDP-Star ™ kemiluminescerende substrat-opløsning (Sigma) i 5 minutter, og derefter udsat for CL-XPosure ™ film (Pierce). Filmen blev udviklet som pr fabrikantens anvisninger.

MG132 behandling af celler

MG132 (Z-LLL-CHO, MW = 457,6) købt fra Calbiochem er en potent, reversibel og celle-permeable proteasom inhibitor (Ki = 4 nM). MG132 blev først opløst i en dråbe 100% ethanol efterfulgt af DMEM /HAM F-12K-medium uden tilsætning af FBS, og stamopløsningen blev opbevaret ved 4 ° C. Cellekulturen høstet og overført til 6 sterile reagensglas. Hvert rør indeholdt 0,5-1 ml cellekultur (cellekoncentration var ~ 10

6 celler /ml), og celler lodes vokse ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator natten over. Derefter blev MG132 opløsning tilsat til rørene for de endelige koncentrationer på 0, 1, 2, 5, 10 eller 25 ug /ml (0, 2,1, 4,2, 10,5, 21 eller 52 uM). Cellerne blev inkuberet under de samme betingelser i yderligere 3 eller 6 timer. Endelig blev cellerne høstet ved centrifugering og klares ved vask med PBS.

Radioisotopaffald og radioaktiv mærkning af antistofferne

Beta-emitter

188Re med en halveringstid på 16,9 timer blev elueret i i form af natrium perrhenat Na

188ReO

4 fra en

188W /

188Re generator (Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN). Antistoffer blev mærket med

188Re direkte gennem binding af reduceret

188Re til den genererede-SH gruppe på antistofferne som tidligere beskrevet [11].

Immunfluorescerende påvisning af virale antigener i tumorceller

tumorcellerne blev dyrket i slide kamre ved 37 ° C i 12 timer. Mediet blev fjernet, og cellerne blev vasket med PBS tre gange. Hele proceduren blev cellerne vasket 3 gange med PBS efter hver behandling. De blev fikseret med 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 20 minutter efterfulgt af permeabilisering med 0,3% Triton-X100 i PBS ved stuetemperatur i 10 min. Faste og permeabiliserede celler blev blokeret med 5% BSA plus 0,1% Triton X-100 i PBS ved stuetemperatur i 30 min. Virale antigener-specifikke mAb’er blev fortyndet 1:200 med ovenstående BSA og Triton X-100 opløsning og inkuberet med cellerne ved stuetemperatur i 60 min. FTIC-konjugeret kanin polyklonalt antistof mod muse IgG i 1:300 fortynding sattes til cellerne i 60 min inkubering ved stuetemperatur i mørke. Glassene blev set med et Olympus AX70 mikroskop (Melville, NY) udstyret med et FITC-filter.

Tumor modeller

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Institute for Animal Undersøgelser på Albert Einstein College of Medicine. Human cervical carcinoma CaSki og humant hepatocellulært carcinom Hep 3B2.1-7 cellelinier blev valgt som tumormodellerne baseret på dets ekspression af E6 og HBx henholdsvis og deres tumorigenecity i nøgne mus. Seks uger gamle hun nu /nu CD1 nøgne mus indkøbt fra Charles River blev injiceret i den højre flanke med 10

7 CaSki eller Hep 3B2.1-7 celler i 0,1 ml DMEM-medium indeholdende 10% føtalt kalveserum. CaSki tumorer begyndte at dukke omkring 60 dage efter injektion, Hep 3B2.1-7 tumorer-10 dage efter celle injektion. For biodistribution af HBx-specifik mAb, blev nøgne mus podet med 10

7 A2058 humane metastatiske melanomceller og 10

7 Hep 3B2.1-7 celler i højre og venstre flanker henholdsvis. Biofordeling og terapi eksperimenter blev initieret, når tumorerne nåede 0,3-0,7 cm i diameter.

Immunhistokemisk påvisning af HPV E6 protein i CaSki tumorer Salg

Tumorerne taget fra CaSki tumorbærende mus blev fikseret i