PLoS ONE: En Multistep High-Content Screening Approach at identificere nye Funktionelt Relevante målgener i kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

For at fremme den systematiske identifikation af nye gener med vigtige funktionelle roller i bugspytkirtelkræft, har vi udtænkt en etapevis screening strategi for at give et rationelt grundlag for udvælgelsen af ​​yderst relevant roman kandidat gener baseret på resultaterne af funktionelle højinformativ analyser. Arbejdsgangen bestod af tre på hinanden følgende faser: 1) seriel genekspression profilering analyser af primære humane pancreas væv samt en række

in vivo

og

in vitro

modeller af tumor-relevant karakteristika for at identificere gener med iøjnefaldende ekspressionsmønstre; 2) anvendelse af “omvendt transfektion vifte ‘teknologi for storstilet paralleliseret funktionelle analyser af potentielle kandidatgener i cellebaserede assays; og 3) udvælgelse af de enkelte kandidatgener for yderligere tilbundsgående undersøgelse af deres cellulære roller. I alt 14 gener, deriblandt 8 fra “druggable” gen familier, blev klassificeret som højt prioriterede kandidater til individuel funktionel karakterisering. Som et eksempel for at demonstrere gyldigheden af ​​den fremgangsmåde, der er omfattende funktionelle data om kandidat gen ADRBK1 /GRK2, som ikke tidligere har været impliceret i kræft i bugspytkirtlen, præsenteret

Henvisning:. Buchholz M, Honstein T, Kirchhoff S , Kreider R, Schmidt H, Sipos B, et al. (2015) En Multistep High-Content Screening Approach at identificere nye Funktionelt Relevante målgener i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 10 (4): e0122946. doi: 10,1371 /journal.pone.0122946

Academic Redaktør: Chunhong Yan, Georgia Regents University, UNITED STATES

Modtaget: 23, 2014 Accepteret: December 30, 2014; Udgivet: April 7, 2015

Copyright: © 2015 Buchholz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data har været deponeret til databasen ArrayExpress på det Europæiske center for Bioinformatik (EBI). Data kan tilgås på ArrayExpress databasen (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) under følgende deponeringsnumre: Datasæt på SUIT2 metastase model: E-mtab-3344; Datasæt på SPC treatmentof PaTuII celler: E-mtab-3363; Datasæt på primære humane pancreas væv: E-mtab-3365; Datasæt på PATU-8988s og -t differentiering model: E-mtab-3366; Datasæt på indflydelsen af ​​RAS mutanter på TGFB1-induceret fænotype af PANC-1 celler: E-mtab-3364; Datasæt på bugspytkirtlen udvikling: E-mtab-3368; Datasæt på ATRA behandling af NB4 celler: E-mtab-3369; Datasæt på apoptose modstand i Capan-1 celler: E-mtab-3370; Datasæt på 2D vs 3D kultur:. E-mtab-3372

Finansiering: Dette arbejde blev finansieret delvist af EU FP6 tilskud LSHB-CT-2006 til 018.771 (Integrated Project “MolDiag-Paca”), det tyske ministerium for uddannelse og forskning (BMBF) inden for rammerne af programmet for medicinsk genomforskning (PaCa-Net; -projektet ID PKB-01GS08 og 01GS08178), den tyske Research Foundation (DFG, give Bu 1536 /3-1 til MB), og EU FP7 give no. 602.783 (store integrerede projekt “CAM-Pac”). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

INDLEDNING

PDAC er en dødelig sygdom, der har en fem-års overlevelse under 6%, hvilket er det laveste for alle solide tumorer [1]. Tidlige symptomer er sjældne og ukarakteristiske, så at kun 8% af PDAC tilfælde vil være i en lokaliseret og resektabel etape på tidspunktet for diagnosen, mens hovedparten af ​​patienterne vil blive diagnosticeret i en avanceret, regional (27%) eller fjernt (53 %) scene. Da avanceret PDAC er naturligt resistente over for de fleste tilgængelige behandlinger, de fleste patienter dør fire til seks måneder efter diagnosen [1].

Patienter med metastatisk sygdom modtager systemisk palliativ kemoterapi, med gemcitabin er standarden for pleje [2]. Talrige forgæves forsøg er udført for at forbedre resultatet i patienter med metastatisk sygdom ved hjælp af kombinationer med en gemcitabin-backbone. Først for nylig, nye kombination med kemoterapi, såsom FOLFIRNOX [3] opnået en betydelig forøget overlevelse, selv på bekostning af signifikant forøget toksicitet. Flere forsøg med nye målrettede behandlinger ikke kunne påvise overlegenhed over gemcitabin alene [4], med tyrosin kinase inhibitor erlotinib er den eneste målrettede middel til at vise en mindre men signifikant overlevelse gavn for 14 dage [5]. Nye tilgange til at forbedre drug delivery, såsom albumin-bundne paclitaxel [6], er blevet udviklet og viser lovende resultater i de første forsøg, men vil ave at blive underbygget. Der er således et fortsat og presserende behov for at identificere nye koncepter og mål, som kan give nye veje til at kæmpe denne sygdom.

Som for mange andre sygdomme, storstilet genomiske, transkriptomisk og, i noget mindre grad, proteomikanalyser har været med til at etablere omfattende kataloger af molekyler, der er ændret i deres struktur og /eller overflod i pancreas tumorer (f.eks [7-21]. Langt mindre udviklede er begreber og metoder til at afhøre gen funktioner i stor skala med henblik på at differentiere “driver” ændringer, som direkte bidrager til malign transformation og tumorprogression, fra “passager” ændringer, som har minimal eller ingen indflydelse på tumor biologi. som følge heraf eksempler på vellykket oversættelse af viden genereret fra “omics” tilgange i romanen kliniske koncepter og applikationer er få og sjældne.

Vi beskriver her en flertrins strategi til formål at omgå dette problem ved at give et rationelt grundlag for udvælgelsen af ​​yderst relevante nye kandidatgener baseret på resultaterne af funktionelle højt indhold analyser . Til dette formål arbejdsgangen af ​​undersøgelsen omfattede tre forskellige faser: 1) seriel genekspression profilering analyser af primære humane pancreas væv samt en række

in vivo

og

in vitro

modeller af pancreas udvikling, celledifferentiering, invasion, metastase, apoptose modstand osv bruger tilpassede arrays af målrettede cDNA samlinger for at identificere gener med iøjnefaldende ekspressionsmønstre; 2) anvendelse af “omvendt transfektion vifte ‘teknologi [22,23] for storstilet paralleliseret funktionelle analyser af kandidatgener udvalgt fra fase 1 i cellebaserede assays udført i mikroskop slide-array-format; og 3) udvælgelse af de enkelte kandidatgener viser relevante funktionelle effekter i paralleliserede analyser til mere dybtgående undersøgelse af deres cellulære roller. Som et eksempel for at demonstrere gyldigheden af ​​denne fremgangsmåde, omfattende data om hidtil ukendte funktioner af en kandidat gen udvalgt gennem denne proces (ADRBK1 /GRK2) i bugspytkirtelkræftceller præsenteres.

Den komplette workflow af flertrins gen udvælgelse /karakterisering proces er skematisk skitseret i figur 1.

Materiale og metoder

cDNA-array produktion og hybridisering

produktion af cDNA arrays, udvinding og radioaktiv mærkning af total RNA, samt hybridisering og kvantificering af hybridiseringssignaler blev udført som beskrevet tidligere [24,25]. Kort fortalt cDNA’er PCR-amplificeret og klædt i to eksemplarer på nylonmembraner bruger robot-enheder.

Total RNA revers transkriberet og radiactively mærket med 33P-dATP ved hjælp af StripEZ-RT Kit (Ambion) og hybridiseret natten til nylon membran arrays i ULTRArray hybridiseringsbuffer (Ambion) ved 50 ° C. Radioaktive signaler blev opdaget ved hjælp af en STORM fosfor imaging system (Amersham Biosciences, Feiburg, Tyskland) og kvantificeret med ArrayVision software (Interfocus, Haverhill, Storbritannien). Signal intensiteter blev normaliseret til den gennemsnitlige signal intensitet alle funktioner på en enkelt række

Gener blev defineret som differentielt udtrykt mellem to sæt prøver, hvis: (1). Den gennemsnitlige normaliserede udtryk værdi oversteg 0,5 i mindst én af de to prøvesæt, (2) forskellen mellem de gennemsnitlige normaliserede ekspressionsniveauer værdier var mindst dobbelt mellem prøvesæt og (3) et tosidet t-test viste ap-værdi på mindre end 0,05.

Raw data af alle eksperimenter kan tilgås på https://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/

følgende genekspression profilering eksperimenter af væv og

in vivo /in vitro Salg modeller for seriel karakterisering af kandidatgener blev gennemført:.

Primære humane væv

i alt 16 kliniske prøver fra duktalt adenokarcinom, 6 prøver fra kronisk betændelse i bugspytkirtlen, og 4 prøver fra morfologisk normale resektionsrandene fra kronisk pancreatitis resectates blev analyseret. Prøverne blev tilvejebragt af kirurgiske afdeling på universitetet i Ulm (Tyskland), samt patologi afdeling af universitetet i Kiel (Tyskland). Informeret samtykke skriftligt blev opnået fra alle patienter forud for brug af vævsprøver. Undersøgelsen blev godkendt af de lokale etiske komiteer ved universiteterne i Ulm og Kiel (Ethikkommission der Universität Ulm, Ethikkommission der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel)

Pancreas udvikling

Total RNA.. fra normale voksne humane pancreas og føtal human pancreas blev erhvervet fra Clontech. Hver samleprøve blev uafhængigt mærket og hybridiseret 3 gange.

ATRA behandling af NB4 leukæmiceller.

Den akutte promyelocytleukæmi-afledt cellelinje, NB4 [26], blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO2 i en RPMI-medium suppleret med 2 mM L-glutamin og 10% decomplemented føtalt kalveserum. Celler blev dyrket i 48 timer med eller uden 1 pM All-trans-retinsyre (ATRA; Sigma-Aldrich). Dubletter af 3 uafhængige forsøg blev analyseret.

SPC behandling af Patu II-celler.

Sphingosylphosphorylcholine (SPC) er en bioaktiv lipid med flere biologiske roller, herunder reguleringen af ​​differentiering i embryonale og kræftceller. Patu II bugspytkirtelkræftceller blev holdt i DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (PAA, Pasching, Østrig) i en befugtet atmosfære og 5% CO2, 95% luft ved 37 ° C. Celler blev inkuberet med 15 pM SPC i serumfrit Medium fpr 2 h eller venstre ubehandlet. Dubletter af 3 uafhængige forsøg blev analyseret.

2D vs 3D cellekulturer.

pancreascancer cellelinje A818-1 blev dyrket enten i 2D monolag eller i 3-dimensionelle “hule kugler” som beskrevet [27]. Total RNA blev ekstraheret fra 3 uafhængige forsøg og analyseret i dubletter.

Patu-8988s og-t differentiering model.

Patu-8988s og PATU-8988t er to cellelinjer, som blev afledt af samme levermetastaser af en human primær pancreas adenocarcinom, men afviger i deres differentiering status og metastatisk kapacitet [28]. Den dårligt differentieret cellelinje PATU-8988t blev transficeret med en E-Cadherin ekspressionskonstruktet eller vektor kontrol, henholdsvis og individuelle kloner analyseret ved ekspression profilering. Derudover blev analyseret 3 uafhængige præparater af vildtype PATU-8988s celler.

SUIT2 metastase model.

S2-007 og S2-028 er cellelinjer afledt fra den samme primære pancreasadenocarcinom , men displying store forskelle i deres invasive og metastatiske potentiale både in vitro og in vivo [29]. Tre uafhængige præparater hver af de meget metastatiske S2-007 og den lave metastatisk S2-028 cellelinie dyrket i 2D cellekultur (DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (PAA , Pasching, Østrig) i en befugtet atmosfære og 5% CO2, 95% luft ved 37 ° C) blev analyseret ved ekspression profilering.

Apoptose-resistens i Capan-1-celler.

Pancreas cancerceller er i sagens natur meget resistente over for spontan eller kemoterapi-induceret apoptose. Den humane pancreas tumorcellelinie Capan-1 (pRB + /p16-) blev stabilt transficeret med p16 ekspressionskonstruktioner eller kontrol plasmider som beskrevet [30] til funktionelt at inaktivere pRB. Tre uafhængige forsøg blev udført og analyseret in duplo.

Indflydelse af RAS-mutanter på TGFB1-induceret fænotype af PANC-1-celler.

Vi har tidligere beskrevet ekspression profilering af indflydelsen af ​​RAS-mutanter på TGFB1-induceret fænotype af pancreas cancercellelinie PANC-1 [24]. Kort fortalt, PANC-1-celler stabilt transficeret med en dominant negativ HRAS (S17N) mutant, et konstitutivt aktiv KRAS2 (G12V) mutant eller mock transficeret med en EGFP ekspressionskonstruktion blev behandlet med TGFB1 eller venstre ubehandlet, henholdsvis. Tre uafhængige forsøg med hver blev analyseret in duplo.

cellelinier til paralleliserede og individuelle funktionelle assays

Panc-1 [31] og HEK-293 [32] celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, USA). S2-007 og S2-028 var fra T. Iwamura [33] (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). IMIM-PC1 celler blev venligst stillet til rådighed af F.X. Fast [34] (CNIO, Madrid, Spanien).

Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10% FBS og 0,05 mg /ml gentamicin ved 37 ° C og 5% (volumen /volumen ) CO2.

Reverse transfektion arrays

Fuld længde åbne læserammer (ORF’er) af alle kandidatlande og kontrol gener blev købt som cDNA kloner fra Open Biosystems (Lafayette, CO, USA), PCR- amplificeret under anvendelse af specifikke primere og klonet ind i pENTR vektoren (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Tyskland). ORF’er blev derefter sendt ind i pdECFP og pdEYFP ekspressionsvektorer [35] ved hjælp af Gateway kloning systemet (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Tyskland). Hver ORF var derfor tilgængelig som en N-terminal fusion konstruere med cyan fluorescerende protein (CFP) samt en C-terminal fusion konstruere med gult fluorescerende protein (YFP).

Til produktion af ‘reverse transfektion microarrays’ blev ekspressionskonstruktioner plettet på objektglas ifølge en protokol modificeret fra [22]. 4 ug af hvert plasmid-DNA blev blandet med 11 pi PBS og 2 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) i en 96-brønds celledyrkningsplade. Efter 20 minutters inkubation ved stuetemperatur blev 15 pi gelatine (0,1% i PBS) tilsat til hver brønd. Transfektion blandinger blev klædt på Superfrost Plus objektglas (Menzel GmbH, Braunschweig, Tyskland) ved hjælp af en Tecan Miniprep 75 automatiseret prøve processor (Tecan, Männedorf, Schweiz), genererer spot størrelser af mm i diameter 0,5-1,5. Objektglas blev tørret og opbevaret i op til 3 uger i en tør atmosfære ved 4 ° C. Til generering af levende celle microarrays blev objektglassene anbragt i quadriPERM plader (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland), podet med 4,5 x 10

5 HEK-293, 4 x 10

5 Panc-1, eller S2-007: 5 x 10

4 S2-007 i DMEM /10% FCS og inkuberet i 48 timer ved 37 ° C.

Immuncytokemi

levende celler mikroarrays blev fikseret i 15-30 minutter ved stuetemperatur med 4% paraformaldehyd i PBS og modfarvet og monteres ved hjælp af DAPI-holdige monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, USA). Ekspression af fusionskonstruktioner og subcellulær lokalisering af genprodukterne blev dokumenteret under anvendelse af et Zeiss Axiovert 200 fluorescensmikroskop (Carl Zeiss GmbH, Gottingen, Tyskland). Eventuelt optiske sektioner af fluorescerende prøver blev fremstillet ved 630x forstørrelse under anvendelse af Zeiss ApoTome teknologi (https://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/apotome-2-for-biology.html).

Antibody inkubering og påvisning blev udført ifølge producentens instruktioner for de individuelle antistoffer, henholdsvis. Følgende antistoffer blev anvendt:

anti-Ki67: 1: 400, polyklonale kanin, ab833, Abcam, Cambridge, UK

anti-cyclin B1: 1: 100, monoklonalt muse-, kat. # 4135, Cell Signaling Technology, Danvers, USA

anti-ACTIVE-Casapse-3: 1: 150, polyklonale kanin, kat. # G7481, Promega, Madison, USA

anti-vimentin: 1: 200, monoklonalt muse-, ab28028, Abcam, Cambridge, UK

anti-E-cadherin: 1: 100, monoklonalt muse- , kat. # 610.181, BD Biosciences, Sparks, USA

anti-kanin IgG (Cy3) 1: 500, polyklonale ged, ab6939, Abcam, Cambridge, UK

anti-muse-IgG (Cy3) 1 : 500, polyklonale ged, ab97035, Abcam, Cambridge, UK

mRNA isolation og protein udvinding

RNA isolation blev udført ved hjælp af peqGOLD Total RNA Kit (peqlab Bioteknologi GmbH, Erlangen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Koncentrationer blev kvantificeret med NanoDrop ND-1000 (peqlab Biotechnology GmbH) efterfulgt af syntese af første-streng cDNA fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af Omniscript Kit og protokol (Qiagen, Hilden, Tyskland).

For total protein ekstrakter blev celler centrifugeret i dyrkningsmedium (13 000 rpm, stuetemperatur, 5 min). Pellets blev resuspenderet i PBS suppleret med proteinase inhibitor (G-Biosciences, Maryland Heights, USA) og sonikeret med en Labsonic U (B. Braun, Melsungen, Tyskland). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse Bradford proteinassay og målt med Multiskan FC fotometer (Thermo Scientific, Langenselbold, Tyskland).

QRT-PCR og immunoblotting

første streng cDNA’er blev amplificeret i 7500 Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems, Warrington, USA) ved hjælp af Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) og specifikke primerpar designet med PrimerExpress programmet (Applied Biosystems, for sekvenser se supplerende materiale).

for Western blot blev 10 ng af total proteinekstrakter indlæst og adskilt af 10 eller 15% SDS-PAGE. Adskilte proteiner blev overført til en nitrocellulosemembran (Whatman GmbH, Dassel, Tyskland) og blokeret i 4-6 timer ved 4 ° C i 1xTBS, 0,1% Tween 20 og 5% mælkepulver. Primære antistoffer blev fortyndet 1: 1 000 i blokeringspuffer og inkuberet natten over ved 4 ° C. TBS-T (0,1%) blev anvendt som vaskebuffer. HRP-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof blev fortyndet til 1:10 000 og inkuberet i 1-2 timer ved 4 ° C i blokeringspuffer. blev påvist Proteiner ved hjælp af ECL immunoblot kit (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Tyskland).

Konstruktion og analyse af væv microarrays

Til konstruktion af væv microarrays (TMAS), 1 mm ( tumor) og 1,5 mm (normalt væv) størrelse vævsbiopsier blev ekstraheret fra paraffin donorblokke og overført til forhullede huller på modtagerens paraffinblokke med et væv microarrayer (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, USA) udstyret med en TMA booster (Alphelys, Plaisir, Frankrig). Grid layout til tumor og normal pancreas væv TMA’er designet med TMA Designer 2 software (Alphelys). Modtagerblokkene blev forseglet i 10 minutter ved 56 ° C og 30 minutter ved 4 ° C. Denne procedure blev gentaget to gange. TMA blokke blev skåret i 3,5 um snit og placeret på SuperFrost Plus dias til immunhistokemisk farvning. Brugen af ​​humane væv til forskning formål blev godkendt af de lokale etiske komité på University Hospital, Tübingen (470 /201BO1), og Klinik for Kirurgi, University Heidelberg, Tyskland (301/2001).

immunhistokemisk farvning var udført med et monoklonalt muse-anti-ADRBK1 antistof (Thermo Fischer, # MA5-15840; 1: 1000 fortynding) på Ventana BenchMark XT-system (Ventana Medical Systems, Tucson, USA) herunder afparaffinering af formalin-fikserede paraffin-indlejrede vævssnit og varmeinduceret antigen-hentning.

Analyse af farvning intensiteter blev udført af en patologer med ekspertise i bugspytkirtlen tumorer (BS) i en blindet måde om tumor parametre. Andelen af ​​de positive celler, der viser en betydelig farvning i tumor områder blev anslået i procent og opdelt i scoringer (1-10% -Svage, 11-50% -moderate, 50% -massivt

Transfektion. af siRNA’er Salg

i RNAi-medieret inaktivering af ADRBK1 ekspression, præ-designet Lyddæmper siRNA’er (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, USA) blev transficeret i en koncentration på 40 nmol vha siLentFect Lipid Reagent (Bio- Rad, München, Tyskland). Accell ikke-targeting siRNA # 1 (Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products, Lafayette, LA, USA) blev anvendt som ikke-lyddæmpende kontrol.

spredning og levedygtighed analyser

i BrdU-inkorporering assays under anvendelse af celleproliferation ELISA Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), 5 000 til 7 500 celler blev podet 24 timer efter transfektion i en ViewPlate-96 Black cellekultur plade (Perkin Elmer, Waltham, MA , USA). efter natten over dyrkning blev celler inkuberet 4-6 timer med BrdU holdigt medium. efter fiksering i 1 time blev cellerne farvet i 1,5 time med peroxidasekonjugeret anti-BrdU-antistof, kemiluminescens-substrat tilsat, og den udsendte lys kvantificeret med en Centro LB 960 luminometer (Berthold Technologies GmbH, Stuttgart, Tyskland).

For MTT assays, 20 000 til 25 000 celler blev reseeded 24 timer efter transfektion i 24-brønds cellekultur plader. Efter yderligere dyrkning i 24 timer eller 48 timer blev supernatanten erstattet med MTT-holdige medium (thiazolyl blå, Carl Roth GmbH) og pladerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Medium blev udskiftet ved solubilisering opløsning (10% Triton-100, 0,1 M saltsyre i 2-propanol). Ekstinktion blev målt ved 570 nm med Multiskan FC fotometer (Thermo Scientific, Schwerte, Tyskland).

Flowcytometri

trypsinerede celler blev centrifugeret ved 1.200 rpm i 3 min. Efter vask med PBS blev pellets grundigt resuspenderet i 50-100 pi PBS, og cellesuspensionen overført dråbevis i iskoldt ethanol (70%) under kontinuert hvirvelbehandling. Efter centrifugering ved 1 000 g i 5 minutter, supernatanten blev forsigtigt kasseret, pelleten vasket med 500 pi iskold PBS og resuspenderet i 500 pi propidium-iodid blanding (1 mg /ml Propidium-iodid (Sigma-Aldrich) + 500 ug /ml DNAse-free RNAse (Roche Diagnostics) i PBS). Prøver blev inkuberet i 30-45 minutter ved stuetemperatur i mørke og derefter målt med flowcytometer LSR II (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). For evaluering af data, blev softwaren ModFit LT (Verity Software House, Topsham, USA), der anvendes.

RESULTATER

Serial karakterisering af PDAC kandidatgener ved ekspression profilering hjælp cDNA array-hybridiseringer, dataanalyse og udvælgelse af kandidatgener

Som et første skridt i den systematiske identifikation af nye funktionelt relevante kandidatgener i bugspytkirtelkræft, vi producerede brugerdefinerede cDNA arrays med kræft i bugspytkirtlen-specifikke cDNA klon samlinger (n = 468 fra [7] og [36]), som desuden blev udvidet med store samlinger af cDNA kloner (n = 1492) fra potentielt relevante gen familier såsom kinaser, fosfataser, serum respons gener etc. (se datasæt i supplerende oplysninger for nærmere oplysninger om array kompositioner ). Disse arrays blev derefter anvendt til genekspression analyser af primære humane pancreas væv samt en række

in vivo

og

in vitro Salg modeller af pancreas udvikling, celledifferentiering, invasion, metastase, apoptose modstand etc. (bemærk, at da cDNA-klonen samlinger til generering af arrays blev løbende udvidet i løbet af disse undersøgelser, ikke alle cDNA’er blev hybridiseret med alle forsøgsmodeller). For at blive udvalgt til yderligere funktionel karakterisering, kandidatgener måtte betydeligt dereguleret i bugspytkirtelkræft (overudtrykt eller nedreguleret i primære pancreas cancer væv i forhold til kronisk pancreatitis og normal bugspytkirtel prøver), samt vise betydelig regulering i mindst én af de funktionelle modelsystemer (se Materialer Metoder sektion for detaljer om hybridisering signal kvantificering og definition af differentieret udtryk).

Denne rå liste over potentielle kandidatgener blev manuelt kurateret at udelukke gener, som tidligere havde været intensivt undersøgt i pancreascancer, samt udelukker udtrykte sekvens-tags (EST’er) fra pancreascancer-specifikke cDNA samling som viste utilstrækkelig homologi med annoteret humane gener. Under anvendelse af disse kriterier, blev udvalgt i alt 50 gener for paralleliseret funktionel karakterisering (se nedenfor). Denne liste blev udvidet med 17 kandidatgener, der havde vist Panin-specifikke ekspressionsmønstre i vores tidligere analyser af Mikrodissekterede prøver af normale kanaler samt forstadier til kræft og kræft fra humant pancreata [11]. Endelig blev et udvalg af 14 kendte gener med forskellige cellulære funktioner tilføjet som positive kontroller for de funktionelle analyser. Den komplette liste over udvalgte kandidat og kontrol gener er givet i S1 Table (supplerende oplysninger).

paralleliseret cellebaserede assays

For hurtigt screene for funktionelle effekter af alle 67 kandidatgener i parallelle, ekspressionskonstruktioner af kandidatgener samt 14 kontrol-gener med kendte funktioner blev klonet i form af N-terminale fusioner med cyan fluorescerende protein (CFP) samt C-terminale fusioner med gult fluorescerende protein (YFP). Plasmid-DNA’et, kompleksdannet med transfektionsreagenser, var klædt på standard mikroskopi objektglas og overlagt med suspensioner af bugspytkirtelkræftceller (Panc-1, S2-007) eller ikke-transformerede kontrolceller (HEK-293). Under et fluorescensmikroskop blev pletter af transficerede celler let identificeres på grund af de specifikke fluorescerende signaler i den fælles fiskeripolitik eller YFP fusionsproteiner, som også tilladt direkte sammenligning med nabolande ikke-transficerede celler.

De omvendte transfektion arrays blev derefter anvendes til paralleliseret funktionsanalyser for at identificere hidtil ukendte kandidatgener med potentielt vigtige funktioner i bugspytkirtelkræftceller. I en første runde af evalueringen, subcellulær lokalisering af genprodukter (samt den samlede morfologi sammenlignet med ikke-transficerede celler), både i nærvær og fravær af serum, blev registreret og sammenlignet mellem cancer og kontrolceller (se fig 2 for eksempler på forskellige lokaliseringer). I efterfølgende analyser blev arrays af fikserede celler inkuberet med antistoffer mod veldefinerede markører for apoptose (spaltet caspase-3), proliferation (Ki-67, cyklin B) og epithelial-mesenchymal transdifferentiering (EMT; mesenchymal markør vimentin, epitelial markør E -cadherin). Eksempler på farvningsresultater vises i figur 3. Frekvens og intensiteten af ​​farvning blev registreret, visuelt scorede og sammenlignet mellem transfekterede og ikke-transfekterede celler. Tilbagevendende forskelle mellem transfekterede og ikke-transfekterede celler blev klassificeret som “++” (stærke virkninger), “+” (moderat, men reproducerbare virkninger) og “(+)” (svage og /eller variable effekter). Tabel 1 angiver alle generne for hvilke mindst én score på “++” eller mindst tre snesevis af “+” blev registreret i uafhængige replikat eksperimenter, og som således er defineret som egnet til individuel dybdegående analyser. De udvalgte kandidater bestod 3 kinaser (ADRBK1, FASTK, PRKCZ), 3 fosfataser (PPM1G, PPP2R1A, PPP2R4), 2 transkriptionsfaktorer (FRA-2, GTF2F2), 2 actin-interagerende proteiner (CFL1, RRAS), en transmembrane protein ( TM4SF1), 1 histon methyltransferase (SUV39H1), 1 G-protein-koblede receptorer (EBI2) og 1 interferoner-inducerbart protein med ukendt cellulær funktion (IFI27). Ingen af ​​dem havde været forbundet med kræft i bugspytkirtlen på det tidspunkt, de blev medtaget i den omvendte transfektion arrays.

Vist er fælles fiskeripolitik (A) eller YFP (B-C) fusionskonstrukter. Efter transfektion og fiksering af celler på reverse transfektion microarrays blev dækglas anvendt ved hjælp af DAPI-holdige montering medium. For den fælles fiskeripolitik fusionsproteiner, er DAPI signaler vist i brun (falsk farve) for at give passende kontrast (A). Vist er eksempler på rent cytoplasmatisk (A), ensartet nuklear-cytoplasmatisk (B), og rent nukleare lokalisering (C) samt lokalisering til endosomet-lignende strukturer (D). Originale forstørrelser er angivet i billederne

A:. Caspase-3-farvning (Cy-3, red), HEK-293-celler transficeret med H1F0-YFP (grøn); B: Ki-67-farvning (Cy-3, red), HEK-293 transficeret med NKX2-5-YFP (grøn); C: cyclin B-farvning (Cy-3, red), PANC-1 transficeret med PRKCZ-YFP (grøn); D: vimentin farvning (Cy-3, red), PANC-1 transficeret med FASTK-YFP (grøn); E: E-cadherin-farvning (Cy-3, red), PANC-1 transficeret med PPP2R1A-YFP (grøn). Originale forstørrelser er angivet i billederne.

Functional validering /dybdegående individuelle karakterisering af kandidat-gen ADRBK1

Som en proof-of-concept for at bekræfte gyldigheden af funktionelle data opnået via paralleliserede cellebaserede assays, viser vi eksemplarisk detaljeret

in vitro

funktionelle karakterisering data for et gen, ADRBK1, som var det første gen (i alfabetisk rækkefølge) på listen over højt prioriterede kandidater (tabel 1). Detaljeret

in vivo

in vitro

karakterisering af andre kandidatgener op til generering af genetiske manipuleret musemodeller er enten i pressen eller under udarbejdelse og vil blive rapporteret andetsteds.

subcellulære lokalisering af ADRBK1 /CRK2 protein.

ADRBK1 (adrenerge, Beta, receptorkinase 1) også kendt som GRK2 (G-protein-koblet receptor-kinase 2) blev oprindeligt indeholdt i cDNA arrays som medlem af kinase gen familien, som repræsenterer ideelle druggable målgener. Det blev fundet at være overudtrykt i PDAC i de serielle ekspressionsprofil eksperimenter. I omvendt transfektion array-eksperimenter, havde ADRBK1 /CRK2 vist markante forskelle i subcellulære lokalisering afhængigt af tilstedeværelsen eller fraværet af serum (cytoplasmatisk lokalisering i nærvær, nukleare og cytoplasmiske lokalisering i fravær af serum). Traditionelle ( “fremad”) transfektion af ADRBK1 fusionskonstruktioner i Panc1 celler bekræftede denne iagttagelse, der viser de forventede fluorescerende signaler i kernen udelukkende i serum-berøvet celler 24 timer efter transfektion (Fig 4A og 4B). Interessant, efter lange inkuberingstider, var der en stærk tendens af signalet at gå over til kernen, uanset nærvær eller fravær af serum (figur 4C og 4D), hvilket muligvis indikerer en rolle ADRBK1 i cellernes reaktion på udtømning af næringsstoffer og /eller vækstfaktorer.

ADRBK1-YFP fusionskonstruktioner (grønne signaler) blev transficeret i dyrkede Panc-1-celler dyrket i fravær (A, C) eller nærvær (B, D) på 10% serum . Efter 24 eller 48 h inkubation blev celler fikseret og modfarvet med DAPI (blå signaler). Efter 24, ADRBK1-YFP signaler var påviselige i begge, cytoplasma og kerner, af celler dyrket uden serum (A), mens kernerne i celler dyrket med serum var blottet for YFP fluorescens (B). I modsætning hertil efter 48h inkubation celler dyrket under enten tilstand viste fremtrædende farvning af kerner (C, D). https://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/:

doi:10.1371/journal.pone.0122946.s001

(XLS)

S2 Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Kræft statistik. CA Cancer J Clin. N Engl J Med. J Clin Oncol. J Clin Oncol. Cancer Res. Am J Pathol. Cancer Res. Cancer Res. JAMA. Cancer Res. Ann N Y Acad Sci. Cancer Res. J Natl Cancer Inst. Int J Cancer. Cancer Res. Cancer Res. Cancer Res.