PLoS ONE: telomer protein TPP1 modulerer telomer Homeostase og giver Radioresistance Human Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Strålebehandling er en af ​​de vigtigste terapeutiske strategier i kræftbehandling. Den telomer-bindende protein TPP1 er en vigtig komponent i shelterin kompleks ved pattedyr telomerer. Vores tidligere rapporter viste, at TPP1 ekspression blev forhøjet i radioresistente celler, men de nøjagtige effekter og mekanismer i TPP1 på radiosensitivitet er uklar.

vigtigste resultater

I denne undersøgelse fandt vi, at forhøjet TPP1 udtryk signifikant korreleret med radioresistance og længere telomer længde i humane kolorektale cancer cellelinjer. Desuden viste TPP1 overekspression forlænget telomer længde og et signifikant fald i radiosensitivitet for røntgenstråler. TPP1 medieret radioresistance var korreleret med en nedsat apoptose sats efter IR eksponering. Desuden viste TPP1 overekspression langvarig G2 /M anholdelse medieret af ATM /ATR-Chk1 signalvej efter IR eksponering. Desuden TPP1 overekspression accelereret reparation kinetik samlede DNA-skader og telomer dysfunktion fremkaldt af ioniserende stråling.

Konklusioner

Vi viste, at forhøjede udtryk for TPP1 i humane kolorektal kræftceller kunne beskytte telomere fra DNA skader og giver radioresistance. Disse resultater antydede, at TPP1 kan være et potentielt mål i radioterapi af colorektal cancer

Henvisning:. Yang L, Wang W, Hu L, Yang X, Zhong J, Li Z, et al. (2013) telomer protein TPP1 modulerer telomer Homeostase og giver Radioresistance Human Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 8 (11): e81034. doi: 10,1371 /journal.pone.0081034

Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA

Modtaget: Juli 2, 2013; Accepteret: 8 oktober 2013; Udgivet: November 19, 2013 |

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (No.81071825), ph.d. fonden af ​​Undervisningsministeriets Kina (No.20120141130010) og grundforskning Midler til de centrale universiteter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC), med over 1,2 millioner nye tilfælde og 608,700 dødsfald i 2008, er en væsentlig årsag til kræft dødsfald i mange lande [1]. Strålebehandling er en af ​​de vigtigste terapeutiske strategier i kolorektal cancer behandling med en effektiv lokal styring, beskyttelse af normalt væv og færre systemiske virkninger [2,3]. Men mange patienter stadig opleve tilbagefald eller metastase efter strålebehandling. Den vigtigste årsag til strålebehandling fiasko er cellulære radioresistance. Så identificere nye faktorer, der forudsiger radioresistance er et område med intens forskning og kunne være af stor værdi i behandlingen af ​​kræft.

Telomerer er specialiserede DNA-protein-komplekser ved enderne af eukaryote kromosomer består af et variabelt antal tandem gentagne TTAGGG sekvenser og associerede proteiner [4]. Telomerer spiller afgørende roller i at sikre genomisk stabilitet og integritet [5-8]. Desuden har undersøgelser klart, at telomer homeostase fungerer som et potentielt mål i kræftbehandlingen, især i strålebehandling [9-12]. Vores tidligere forskning viste også, at der var en betydelig negativ korrelation mellem telomer længde og radiosensitivitet og telomer længde kan anvendes som et lovende redskab til at forudsige radiosensitivitet af menneskelige karcinomer [13].

telomer homeostase påvirkes af flere elementer, og en af ​​de store regulatorer er shelterin. Den shelterin Komplekset består af seks telomer-associerede proteiner: TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 og POT1 [8]. Forstyrrelser i shelterin ville føre til telomer dysfunktion og potentielt kromosomal ustabilitet [14]. TPP1 (også kendt som TINT1 /Ptop /PIP1) er en kritisk medlem af shelterin og associerede virksomheder med andre telomer proteiner til at danne kernen shelterin [8]. TPP1 heterodimeriserer med POT1 og forbedrer dets affinitet med telomer ssDNA [15,16]. Den POT1-TPP1 kompleks er i stand til at rekruttere og stimulerende telomerase-aktivitet, og derved regulerer telomer længde gennem TPP1-telomerase-interaktion [17-19]. Tidligere undersøgelser viste, at TPP1 knockdown aktiverer en ATM-afhængige DNA skade responset præget af dannelsen af ​​telomer dysfunktion-induceret foci (TIF) ved telomerer [20]. Desuden har vi observeret, at TPP1 ekspression blev forhøjet i radioresistente celler og TPP1 kan involvere i kræft radioresistance [21]. Men de nøjagtige virkninger og mekanisme af TPP1 på radiosensitivitet er uklar.

For yderligere at klarlægge funktioner TPP1, undersøgte vi rollen som TPP1 overekspression på radiosensitivitet og telomer homeostase i humane kolorektale cancerceller i denne undersøgelse.

Materialer og metoder

Cell Kultur og behandling

Humane kolorektale cancer cellelinjer (HCT116, SW480, LoVo, HT29 og DLD-1) blev købt fra Cell Bank of Chinese Academy of Science, Shanghai, Kina. Alle celler, der anvendes i denne undersøgelse blev dyrket i 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. HCT116-celler blev transficeret med pcDNA6-flag-hTPP1 (en venlig gave fra Dr. Joachim Lingner) [19] eller pcDNA6 tom vektor (Invitrogen) under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). TPP1 overudtrykker celler blev selekteret med 5 ug /ml blasticidin (Sigma) i 4 uger. De stabile transfektion cellelinjer blev navngivet som HCT116-TPP1 og HCT116-Mock hhv.

røntgenstråler bestråling blev udført med en røntgenstråler generator (Primus High-Energy Siemens), emitterer ved en fast dosis på 2 Gy /min, energi af røntgenstrålerne bruges til at bestråle cellerne er 0 -10 Gy.

Klonogen Assay

cellerne blev udsået i 6-brønds plade dyrkningskolber. Efter 24 timer blev celler bestrålet med graduerede doser (0, 2, 4, 6, 8, 10 Gy) under anvendelse X-ray generator (Primus High-Energy Siemens) i en dosis på 2 Gy /min. Cellerne blev derefter dyrket i en inkubator indeholdende 5% CO2 ved 37 ° C i 14 dage. De efterfølgende trin og beregning af overlevende fraktion blev udført som tidligere beskrevet [13] .Alle forsøg blev udført mindst tre gange.

flowcytometrianalyse af cellecyklus

Kort fortalt celler blev udsat for 6 Gy IR og derefter inkuberet i de angivne tidspunkter (0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, og 42 h), derefter cellecyklus analyser blev udført som tidligere beskrevet [21]. DNA histogrammer blev analyseret under anvendelse Modifit software. Eksperimenter blev udført tre gange.

flowcytometrianalyse af apoptose

Apoptose assay blev udført under anvendelse af et annexinV-FITC apoptosis afsløring kit (Beyotime, Kina) ifølge producentens anvisninger. Fluorescens blev målt under anvendelse af et flowcytometer (Beckman Coulter, Brea, CA), og dataene blev analyseret med Cell Quest-software. Alle prøver blev analyseret tredobbelt.

Antistoffer og Western blot-analyse

Western blot blev udført som tidligere beskrevet [21]. Følgende antistoffer anvendes i denne undersøgelse: TPP1 (Abcam), ATR, phospho-Ser345-Chk1 /Chk1 og ATM (Cell Signaling Technology). En β-actin-antistof (Santa Cruz) blev anvendt til at normalisere loading forskelle mellem prøverne. Salg

telomeraseaktivitet Assay

Målingen af ​​telomeraseaktivitet blev udført under anvendelse af TRAP PCR ELISA-kit (Roche) ifølge producentens instruktioner. Den detaljerede fremgangsmåde blev udført som tidligere beskrevet [22] .Sample absorbansen blev målt med en mikropladelæser (Bio-Rad) ved en bølgelængde på 450/690 nm.

Måling af telomerlængde ved Southern blotting

Terminal restriktionsfragment bestemmelsen blev udført under anvendelse af TeloTAGGG telomerlængde Assay kit (Roche) ifølge producentens instruktion. Gennemsnitlig telomerlængde (gennemsnitlig terminal restriktionsfragmenter længde, TRF) blev bestemt under anvendelse af billedanalysesoftware (Bio-Rad).

Immunofluorescens

Efter angivne behandling blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd i 15 minutter og permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter blokeret med blokerende opløsning blev celler inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C, derefter vasket og inkuberet med det sekundære antistof. Kerner blev farvet med DAPI (Sigma) i 5 minutter ved stuetemperatur. Fluorescenssignaler blev taget under anvendelse af et konfokalt mikroskop (Carl Zeiss LSM710).

telomer ChIP Assay og Dot blot-analyse

telomer ChIP Assay og Dot blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [19]. Efter udfældning med TRF2 antistof blev DNA oprenset fra immunpræcipiteret kromatin og blottet på en Hybond-N membran (Amersham), og telomer repeat-sekvenser blev påvist med et TeloTAGGG telomerlængde assaykit (Roche Diagnostics). En ikke-specifik probe (Alu) blev anvendt som kontrol. Signalerne blev målt under anvendelse af billedanalyse-software (Bio-Rad).

Statistical Analysis

Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM. T-test blev anvendt til at teste statistisk signifikans. P 0,05 blev anset for at være betydelig. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Californien) software blev brugt som en statistisk analyse værktøj.

Resultater

Sammenhæng mellem TPP1 Protein Expression, telomer længde og Intrinsic radiosensitivitet

For det første vi undersøgte TPP1 protein udtryk og telomer længder i fem kolorektal cancer celler (figur 1A og B). Som vist i figur 1 D, blev TPP1 proteinekspression signifikant korreleret med telomer længde (R = 0,9783, P 0,05). celleoverlevelse blev derefter målt ved en klongenicitetsassayet og SF2 blev anvendt som et indeks for intrinsisk radiosensitivitet (figur 1C). TPP1 udtryk var negativt korreleret med iboende radiosensitivitet (R = 0,9792, P 0,05, figur 1E). Sammenfattende radioresistente celler har længere telomerer og højere produktion af TPP1 end den radiosensitive celler. Disse resultat viste, at der var en signifikant sammenhæng mellem TPP1 udtryk, telomer længde og celle iboende radiosensitivitet.

(A) TPP1 produktion blev opdaget af western blotting ..

(B) telomer længde var undersøgt ved Southern blot-analyse.

(C) Relativ TPP1 produktion, radiosensitivitet (SF2) og telomer længde (TRF) i humane kolorektale cancer cellelinjer.

(D) Sammenhæng mellem TPP1 produktion og radiosensitivitet (SF2) i kolorektal kræftceller blev undersøgt.

(E) Korrelation mellem TPP1 produktion og TRF længde i kolorektal cancer celler blev undersøgt.

TPP1 Overekspression Fald følsomhed HCT116 celler til Stråling

for at undersøge indflydelsen af ​​TPP1 overekspression på cellulær radiosensitivitet, HCT116-TPP1 og HCT116-Mock celler blev oprettet (figur 2A) og celle overlevelse blev målt ved en klongenicitetsassayet. HCT116-TPP1 celler viste signifikant radioresistance sammenlignet med HCT116-Mock celler efter IR eksponering (figur 2B).

(A) Verifikation af TPP1 overekspression af western blotting.

(B) HCT116-Mock og-TPP1 celler blev bestrålet med røntgenstråler og derefter celle overlevelse blev bestemt ved anvendelse klongenicitetsassayet.

(C) HCT116-Mock og-TPP1 celler blev bestrålet med 6 Gy røntgen og genvindes til angivne tider. Cell cyklus blev analyseret ved FACS.

(D) Den population af celler i G2 /M faser over tid i HCT116- Mock og -TPP1 celler.

TPP1 Overekspression i HCT116 Cancer Celler Årsager Langvarig G2 /M Arrest efter IR Eksponering

Som vist i figur 2C, TPP1 overekspression havde ingen signifikant effekt på cellecyklus udlodninger i fravær af DNA-skader. Efter stråling, observerede vi, at G2 /M arrest nåede en top ved 18 timer efter IR eksponering i både HCT116-Mock og -TPP1 celler. Vigtigere, kinetikken for reaktionen af ​​cellelinierne var forskellige. I HCT116-Mock celler, G2 /M peak gradvist faldet fra 18h efter ioniserende stråling og vendte tilbage til normale niveauer på omkring 42 timer. Men den G2 /M højdepunkt i HCT116-TPP1 cellerne ikke falde, men stadig fastholdt på et højt niveau indtil 30-36 timer efter IR. Disse resultater tyder på, at TPP1 overekspression i HCT116 celler forlænget G2 /M anholdelse efter IR eksponering.

TPP1-induceret G2 /M Arrest Forlængelse medieres af ATM /ATR-Chk1 Pathway

For at identificere molekylære mekanismer i forlænget G2 /M anholdelse efter IR eksponering i TPP1-overekspression celler, målte vi produktionen af ​​ATM, ATR og Chk1. Vi fandt, at udtrykkene for ATM og ATR blev begge forhøjet i HCT116-TPP1 celler (figur 3A). Derefter undersøgte vi aktiveringer af Chk1, et vigtigt substrat af ATR og ATM. Vi fandt, at phosphorylering niveauer af Chk1 på Ser345 var højere indtil 36 timer efter IR eksponering i HCT116-TPP1 celler. I modsætning hertil havde niveauerne i HCT116-Mock celler vendte tilbage til normale niveauer på omkring 30h efter IR eksponering (figur 3B). Disse resultater indikerer, at langvarig G2 /M standsning af TPP1 overekspression skyldes sandsynligvis ATM /ATR-Chk1 signalvejen.

(A) Western blot-analyse afslørede, at TPP1 overekspression øgede ekspression af ATM og ATR.

(B) HCT116-Mock og-TPP1 celler blev bestrålet med 6 Gy røntgen og inkuberet i angivne tidspunkter. Western blots blev preformed at påvise ekspressionen af ​​Chk1 og p-Ser

345-Chk1.

TPP1 Overekspression inhiberer apoptose induceret af ioniserende stråling

Vi evaluerede effekten af ​​TPP1 på strålingsinduceret apoptose ved hjælp af flow cytometrisk analyse. Som vist i figur 4, fandt vi, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem HCT116-Mock og HCT116-TPP1 celler (5,72 ± 0,15% til 5,55 ± 0,12%, p 0,05), men TPP1 overekspression kunne dæmpe stråling (5Gy) induceret apoptose niveauer, fra 26,89% ± 0,75 i kontrol- celler til 17,47 ± 0,45% i HCT116-TPP1 celler (p 0,05). Disse data viste, at den forøgede radioresistance ved TPP1 overekspression kan skyldes et fald i strålingsinduceret apoptose.

HCT116-Mock og-TPP1 celler blev bestrålet med 5 Gy røntgen og inkuberet i 24 timer. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev målt ved flowcytometri.

(A) Repræsentative resultater af diffrerent grupper er vist.

(B) viste data er middelværdier ± SEM fra tre uafhængige forsøg.

*, P 0.05.

TPP1 Overekspression Øger telomer længde i HCT116 Celler

For yderligere at undersøge den rolle, TPP1 i telomer længde kontrol, HCT116-TPP1 og -Mock celler blev dyrket i 20 PD og telomerlængde blev målt ved Southern blotting. Vi viste, at den gennemsnitlige telomer længde HCT116-TPP1 celler gradvist blev forlænget end den kontrolcellerne (figur 5A). Disse resultater antyder, at TPP1 overekspression kunne øge telomer længde i HCT116-celler.

(A) Mean TRF længder på forskellige PD blev påvist ved Southern-blot. PD, befolkning fordobling. Positionen af ​​MW (kb) er angivet til venstre.

(B) TRAP PCR ELISA-assay blev anvendt i analysen af ​​telomerase-aktivitet ved forskellige PD.

(C) Western blot-analyse afslørede, at TPP1 overekspression havde ingen signifikant indflydelse på ekspressionen af ​​hTERT.

(D) telomer-chip assays blev udført under anvendelse af et TRF2 antistof til at undersøge telomere DNA bundet til ved TRF2. Input, supernatant før immunpræcipitation; ppt, protein-DNA immunpræcipitat-kompleks. Specifik (telomert) og ikke-specifikke (ALU) prober blev anvendt.

telomert DNA i chip (%) = telomere DNA signaler af ppt /telomere DNA signaler af input * 100%.

TPP1 Overekspression ikke Impact telomerase aktivitet

for at undersøge om de aflange telomerer i HCT116-TPP1 celler var et resultat af øget telomerase-aktivitet, blev telomerase aktivitet og hTERT protein niveauer i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med HCT116-Mock celler. Der var ingen påviselig stigning i hTERT proteinniveauer eller i telomeraseaktivitet i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med mock celler eller parentale celler (figur 5B og C). Dette resultat indikerer, at telomer forlængelse af TPP1 skyldes ikke en samlet stigning i telomerase-aktivitet.

TPP1 Overekspression Accelereret de Reparation Kinetik af DNA er beskadiget af IR

Vi brugte TIF assay at fastslå, om TPP1 overekspression indvirkning reparation kinetik DNA-skader på telomerer. Telomer-chip-analysen viste, at TPP1 overekspression ikke havde nogen indvirkning på sammenhængen mellem TRF2 og telomerer (figur 5D), så TIF blev overvåget ved co-lokalisering af TRF2 og γ-H2AX i denne undersøgelse (figur 6A). Vi observerede signifikant lavere frekvenser af spontane TIF i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med kontrolcellerne (p 0,05) (figur 6B) .Derefter HCT116-TPP1 og -Mock celler blev udsat for 1 Gy IR og farvet for at identificere TIF foci 0.5, 6 og 12 timer efter IR eksponering. Vores forskning underforstået, at TPP1 overekspression kunne celler reparere TIF mere effektivt end kontrolcellerne. For eksempel frekvenser af IR inducerede TIF var ens i HCT116-TPP1 og HCT116-Mock celler 0,5 time efter IR, hvilket indikerer, at TPP1 ikke reducerede antallet af TIF induceret af IR. Så TPP1 overekspression celler havde cirka 0,53 TIF /celle 12 timer efter IR, mens de mock celler havde 1,04 TIF /celle 12 timer efter IR (figur 6C). Viste således HCT116-TPP1 celler øget kapacitet til at reparere skader på telomerer. TIF assay identificerede γ-H2AX foci på telomerer, samt total γ-H2AX foci i kernen. Derefter kvantificeret vi dannelsen af ​​samlede γ-H2AX foci, en markør for DSBs, for yderligere at undersøge den underliggende mekanisme for radioresistance. Lignende med resultaterne af TIF assay blev hastigheden af ​​den samlede DNA dobbelt-strenget pause reparation fremskyndet af TPP1 overekspression. Disse data tyder på, at TPP1 overekspression kunne accelerere DNA-reparation efter stråling.

HCT116-Mock og -TPP1 blev udsat for en Gy IR og inkuberet ved angivne tidspunkter .. Resultaterne er baseret på tre uafhængige forsøg med i gennemsnit 100 cellekerner analyseret pr eksperiment per point. Barer repræsenterer middelværdien ± SEM af 3 uafhængige forsøg.

(A) Repræsentative billeder for TIF vises.

(B) Hyppigheden af ​​spontane γ-H2AX positive foci og TIF i HCT116-Mock og -TPP1 celler.

(C) Reparation kinetik IR-induceret TIF i HCT116-Mock og -TPP1 kolorektal celler. Gennemsnitlige TIF per celle på forskellige tidspunkter efter IR eksponering blev kvantificeret.

(D) Reparation kinetik IR-induceret DNA-skader i HCT116-Mock og -TPP1 kolorektal celler. Averageγ-H2AX positive foci per celle på forskellige tidspunkter efter IR eksponering blev kvantificeret.

Diskussion

Vi har vist for første gang, at vi ved, at TPP1 overekspression er associeret med radioresistance i kolorektal cancer celler i dette arbejde.

TPP1 spiller afgørende roller i reguleringen telomer længde og DNA-skade responset. I denne undersøgelse, vi viste, at TPP1 udtryk var tæt korreleret med telomer længde og radiosensitivitet i kolorektal cancer celler. Endvidere fandt vi, at ektopisk overekspression af TPP1 førte til radioresistance og telomer forlængelse i HCT116-celler. Tidligere undersøgelser bekræftet, at der var en betydelig negativ korrelation mellem telomer længde og radiosensitivitet [10,11,13]. Vores undersøgelse viste, at TPP1 involveret i radioresistance gennem regulering af telomer længde. Telomerer spiller en central rolle i opretholdelsen af ​​kromosom integritet og stabilitet, og afkortet telomer længde er forbundet med øget risiko for cancer [23]. POT1 protein niveauer er forbundet med telomer længde i gastrisk cancer [24,25]. TPP1 heterodimeriserer med POT1 men der er ingen resultater om sammenhængen mellem TPP1 niveauer og telomer længde i prøver kræft. Vi mener, at sammenhængen mellem TPP1 niveauer og telomer længde i kolorektale cancer prøver er af stor betydning. Faktisk, i vores undersøgelse, vi har forsøgt at gøre dette arbejde ved hjælp af paraffin prøver, men fandt, at friske kræft væv er mere egnet til den sydlige blotting eksperiment. I vores følgende undersøgelse, vil vi indsamle flere friske kræft vævsprøver og kontrollere forholdet mellem TPP1 og telomer længde i kolorektal cancer ved hjælp af friske kræft væv.

Vi fandt, at TPP1 overekspression forlænget stråling-induceret G2 /M anholdelse efter IR eksponering. Celler arresteret i G2 /M fase give mere tid til at reparere skader dermed give radioresistance. Aktivering af checkpoints regulerer anholdelsen af ​​cellecyklus i respons på DNA-skade. Ataksi telangiectasia (AT) muteret (ATM) og ATM og rad3-relaterede (ATR) proteinkinaser er større opstrøms checkpoint kinaser for DNA skade responset [26]. Vi viste, at TPP1 overekspression ophøjet udtryk for både ATM og ATR protein. Tidligere undersøgelse viste, at forhøjede ATM proteinniveauer korreleret med iboende radioresistance i GBM tumorer [27]. Kim og kolleger fandt, at ATR overekspression førte til længerevarende G2 /M anholdelse og radioresistance i HCT116 celler [28]. Mange undersøgelser viste også, at hæmning af aktiviteten af ​​ATM eller ATR kan resultere i øget radiosensitivitet [29,30]. Chk1 er et vigtigt substrat af ATM og ATR. Desuden Chk1 er en effektiv mål for radiosensibilisering i humane cancerceller [31,32]. Phosphorylering af Chk1 på S345 betragtes som en indikator for Chk1 aktivering. I dette papir, fandt vi, at Chk1 phosphorylering blev ophøjet og opretholdt indtil senere tidspunkter efter IR eksponering TPP1-overekspression celler sammenlignet med mock celler. Vores undersøgelse kan angive, at langvarig G2-standsning af TPP1 skyldes sandsynligvis højere niveauer af ATM /ATR-Chk1 signalvej.

Mange undersøgelser har vist, at telomer homeostase tjener som et potentielt mål ved cancerbehandling, især i stråleterapi . Telomer homeostase kan opretholdes ved telomerase samt deres associerede proteiner (betegnet som shelterin). Telomerlængde, telomeraseaktivitet og telomer dysfunktion er de vigtigste markører for telomer homeostase. For det første viste telomerlængde analyse signifikant telomer forlængelse i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med kontrolceller, hvilket indikerer, at TPP1 kan virke som en positiv regulator af telomer længde. Det blev dog bemærket, at ekspressionen af ​​TPP1 havde ingen virkning på telomer længde i humane fibrosarkom HTC75 celler [16]. Forskellen mellem disse resultater kan skyldes den særskilte valgt i cellelinier. Interessant var der ingen påviselig forøgelse i telomeraseaktivitet eller hTERT proteinniveauer i HCT116-TPP1 celler sammenlignet med kontrolceller. Dette resultat indikerer, at telomer forlængelse ved TPP1 ikke skyldes en generel ændring i telomeraseaktivitet, men kan skyldes hTERT cellekernetranslokering eller lokaliseret aktivering af telomerase i telomer.

Co-lokalisering af telomerer og aktiveret DDR markører (såsom 53BP1 andγ-H2AX), såkaldte telomer dysfunktion-induceret foci (TIF), er en typisk tegn på telomer dysfunktion. TIF indebærer DDR af ikke-reducerede telomerer [33] .Recent studier viste, at TPP1 indebærer i DNA skade responset og undertrykkelse af TPP1 udtryk i mus embryo fibroblaster (MEF) eller humane cancerceller kunne indlede telomer dysfunktion [19,20]. I denne undersøgelse fandt vi, at TPP1 overekspression hæmmede de spontane TIF i HCT116 kolorektal celler. Så TPP1 kan beskytte telomere struktur og opretholde en normal telomer funktion.

Vi fandt, at TPP1 overekspression fremskyndet reparation kinetik total DNA dobbeltstrengsbrud induceret af IR eksponering. Endnu vigtigere, afslørede TIF assay, at reparationen på DNA-skader på telomerer efter stråling også blev fremskyndet af TPP1 overekspression. Telomer homeostase var blevet identificeret til at fungere som et potentielt mål ved radioterapi. Undersøgelser havde vist, at telomerase-hæmning kan resultere i telomer dysfunktion og dermed øget radiosensitivitet [22,34]. Det blev også bekræftet, at afbrydelse af shelterin kan resultere i telomer dysfunktion [14,20]. David Soler og kolleger viste, at dysfunktionelle telomerer i humane epitelceller var sandsynligvis påvirke den effektive reparation af stråling-induceret DSBs og derefter ført til øget radiosensitivitet [35]. Vores undersøgelse viste, at TPP1 kan deltage i telomer homeostase og kunne beskytte telomer mod stråling i humane kolorektale cancerceller.

Som konklusion, denne undersøgelse viser, at forhøjede TPP1 niveauer beskytter telomer fra DNA-skader og giver radioresistance i human kolorektal cancer celler. Derudover giver vi dokumentation for sammenhængen mellem TPP1expression, telomer længde og iboende radiosensitivitet. Desuden har denne undersøgelse fremmet forståelsen af ​​forholdet mellem telomer homeostase og radiosensibilisering. Disse resultater antydede, at TPP1 niveauer kan være en nyttig indikator for modtagelighed over for strålebehandling. Sammenfattende vores undersøgelse for første gang viser, at TPP1 kan være et potentielt mål i radioterapi af colorektal cancer. Desuden kan TPP1 hæmning TPP1 hæmning give en funktionel hjælpestof i strålebehandling, en mulighed vi i øjeblikket undersøger.

Tak

Vi takker Dr. Joachim Lingner ((ISREC, Epalinges, Schweiz)) for hans slags gave pcDNA6-flag-hTPP1 plasmid.