PLoS ONE: Kava Komponenter nedregulere Angivelse af AR og AR Splice Varianter og Reducer Vækst i Patient-Afledt prostatakræft Xenografter i mus

Abstrakte

Mænd, der bor i Fiji og drikke kava har lav forekomst af prostatakræft (PCA). Men PCA forekomsten blandt Fiji mænd, der havde migreret til Australien steg med 5,1 gange. Vi har derfor undersøgt de potentielle virkninger af kava rod ekstrakter og dets aktive komponenter (kavalactones og flavokawains) på PCa vækst og androgen receptor (AR) udtryk. PCA cellelinjer (LNCaP, LAPC-4, 22Rv1, C4-2B, DU145 og PC-3) med forskellig AR udtryk, og en transformeret prostata myofibroblastdifferentiering cellelinje (WPMY-1), blev behandlet med en kommerciel kava ekstrakt, kavalactones ( kawain, 5’6′-dehydrokawain, yangonin, methysticin) og flavokawain B. Angivelse af AR og dets målgener (

PSA

TMPRSS2

) blev undersøgt. To nye patient-afledte PCA xenograftmodeller fra høj kvalitet PCA prøver blev etableret ved at implantere prøverne i nøgne mus og passerer tumor stykker gennem subkutan injektion i nøgne mus, og derefter behandlet med kava ekstrakt og flavokawain B for at undersøge deres virkninger på tumorvækst, AR ekspression og serum PSA niveauer. Kava ekstrakt og flavokawain B effektivt nedreguleret ekspression af både fuldlængde AR og AR splejsningsvarianter. Den kava ekstrakt og kavalactones accelereret AR protein nedbrydning, mens flavokawain B hæmmede

AR

mRNA transskription via faldende Sp1 udtryk og bindingen af ​​Sp1 til AR promotoren. Den kava rod ekstrakt og flavokawain B reducere tumorvækst, AR udtryk i tumorvæv og niveauer af serum-PSA i patient-afledte PCA xenograftmodeller. Disse resultater tyder på en potentiel nytte af en sikker kava produkt eller dets aktive komponenter til forebyggelse og behandling af fremskreden PCa ved at målrette AR

Henvisning:. Li X, Liu Z, Xu X, Blair CA, Sun Z, Xie J et al. (2012) Kava Komponenter nedregulere ekspression af AR og AR Splice Varianter og Reducer Vækst i Patient-Afledt prostatakræft Xenografter i mus. PLoS ONE 7 (2): e31213. doi: 10,1371 /journal.pone.0031213

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: November 22, 2011; Accepteret: 4 januar 2012; Publiceret: 9 feb 2012

Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver CA129793 og CA122558 (https://www.cancer.gov/)and American Institute for Cancer Research giver 41.493 (https://www.aicr.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sydøstasien /Stillehavsområdet mænd, der indtager en fedtfattig og plantebaseret kost har de laveste priser på klinisk PCa i verden [1], [2]. Men når asiatiske mænd migrere til USA, satserne for klinisk PCa øge [3]. Disse observationer implicerer både miljøfaktorer og kostvaner (såsom indtagelse af fedtfattig og plantebaseret kost) i PCa udvikling. Derfor er et af strategier til forebyggelse og behandling af PCa har fokuseret på anvendelsen af ​​naturlige og syntetiske bioaktive fødevarer komponenter.

Kava (

Piper methysticum Forst

) er en flerårig plante hjemmehørende i Stillehavet Islands. Kava rod og rhizom anvendes til at udarbejde en ikke-fermenteret og ceremoniel drik med relakserende effekter i Stillehavsøerne i tusinder af år [4]. Usædvanlig lav forekomst af flere kræftformer, herunder lunge- og prostatakræft, er rapporteret i Stillehavsøstaterne nationer trods en høj andel af rygere i disse populationer [2], [5]. Desuden Steiner [6] rapporterede, at alder-standardiserede kræftforekomst for de tre højeste kava-drikke lande (Vanuatu, Fiji og Western Samoa) var en fjerdedel eller en tredjedel, at af ikke-kava-drikke lande, såsom New Sjælland og USA (Hawaii og Los Angeles), og ikke-kava-drikke polynesiere (maorierne). Unikt, drikker i disse tre kava-drikke lande flere mænd kava og røg end kvinder, men der er en lavere forekomst af kræft for mænd end for kvinder [6]. Desuden Cancer Råds Kræft i New South Wales (NSW) Migranter 1991-2001 rapport fundet [7], at PCA incidens i Fiji mænd, der udvandrede til og var bosat i NSW, Australien, er steget med 5,1 gange i forhold til dem, der bor i Fiji . Denne rapport har fået os til at undersøge de potentielle fordele ved kava ekstrakter og dets aktive komponenter til PCa forebyggelse.

Vi rapporterer for første gang, at en kommerciel kava ekstrakt og dets aktive komponenter (kavalactones og flavokawain B) down- regulere AR ekspression. Udtømning af AR protein sket gennem to forskellige mekanismer: 1) øget AR proteinnedbrydning, og 2) reducerede Specificitet protein 1 (Sp1) -medieret AR transkription. Kava udtrække og flavokawain B behandling af mus med patient-afledte xenografter reducerede tumorvækst og udtryk af AR og sit mål gener i tumorvæv, og sænkede serum PSA niveauer.

Metoder

Etik redegørelse

Brug af mus og deres omsorg for denne undersøgelse blev specifikt er godkendt af University of California, Irvine Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC; protokol nummer 2007-2741).

cellelinjer, forbindelser og reagenser

LNCaP, LAPC4, 22Rv1, PC3, opnåedes DU145 og WPMY-1 cellelinier fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA), og C4-2B cellelinie var fra Urocor Inc. (Oklahoma City, OK). Disse celler blev dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS). Alle cellelinier anvendt i dette studie var inden 20 passager efter modtagelsen. Cellelinierne blev testet og bekræftet af ATCC eller Urocor Inc. Alle celler linjer blev også testet for kendte arter af forurening med mycoplasma under anvendelse af et kit fra LONZA Inc. (Walkersville, MD). Pure kawain, 5 ‘, 6’-dehydrokawain, yangonin, methysticin, og flavokawain B (99%) blev isoleret fra kava ekstrakter ved LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Kava rod ekstrakt i en koncentration på 150 mg /ml kavalactones i 50% ethanol blev opnået fra Gaia Urter (Brevard, NC). Antistoffer mod AR og tubulin var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). PSA og Sp1 antistoffer blev indkøbt fra Thermo Scientific (Fremont, CA). 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) var fra Sigma. RNAzol B blev indkøbt fra Tel-Test (Friendswood, TX.). Revers transkription System kit og var fra Promega (Mandison, WI). En kvantitativ RT-PCR-kit var fra Bio-Rad (Hercules, CA).

Måling af kavalactones og flavokawains i kava rod ekstrakt

kava ekstrakt blev fortyndet 400 gange af acetonitril, og derefter filtreret med 0,45 um modstandsdygtige over for opløsningsmidler filtre og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere analyse. Kromatografi blev udført på en Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) systemet (Waters Corp., Milford, MA, USA) med en autosampler ved 8 ° C. Separation af forbindelserne blev udført ved 50 ° C under anvendelse af en Waters Acquity UPLC ®BEH C18 1.7 um (2,1 x 50 mm) søjle med en gradient eluering: (a) vand: acetonitril: eddikesyre (97.8:2:0.2 volumen /volumen /v), og (B) acetonitril:. eddikesyre 99.8:0.2 (vol /vol) som den mobile fase

elueringen programmet blev som følger: 10% B (indledende), 90% B (1,0 min), 90% B (2,0 minutter), 10% B (2,05 min) og 10% (3 min). Strømningshastigheden var 0,3 ml /minut og injektionsvolumenet var 10 pi. Den UPLC blev koblet til Micromass Quattro Micro væskekromatografi-massespektrometri (LC /MS /MS) tripel kvadrupol massespektrometer (Mass Range: 2~2000 m /z) med elektrospray (ESI) interface i positiv modus. Instrumentet blev betjent i en positiv ion-mode med en ESI spænding på 3,8 kV, og en desolvation gasstrøm på 700 l /time. Argon blev anvendt som kollisionen dissociation gas ved et tryk på 7,1

e-3 mbar med en valgt reaktion overvågning overgang for flavokawain A i m /z 315 m /z 181, flavokawain B 284 181, kawain af 231 115, 5 ‘, 6’-dehydrokawain af 229 131, mythysticin af 275 159, Yangonin på 259 . 161

MTT assay

Celler udpladedes ved en tæthed på 2 × 10

4 per brønd i 24-brønds dyrkningsplader i 24 timer og derefter behandlet som anført i figurerne. Efter behandling i 72 timer, 1 mg /ml MTT blev tilsat til hver brønd i 2 timer, og absorbansen blev bestemt ved 570 nm. Dosis-respons-kurverne for vækstinhibering blev genereret som en procentdel af vehikelbehandlede kontroller.

Western blot-analyse

Klarede proteinlysater (20-100 ug) blev denatureret og løst ved 8-16 % SDS-PAGE. Proteiner blev overført til nitrocellulose membraner, og probes med angivne antistoffer og visualiseret ved et forbedret kemiluminescensdetektion system.

Kvantitativ RT-PCR

Real-time kvantitativ PCR-amplifikation reaktioner for

AR

, prostataspecifikt antigen (

PSA

) og transmembrane protease, serin 2 (

TMPRSS2

) mRNA niveauer blev udført ved anvendelse MyiQ systemet (Bio-Rad) som tidligere beskrevet [8], [9]. Sekvenserne af primere til

AR

,

PSA

TMPRSS2

er til rådighed efter anmodning. Data blev analyseret ved anvendelse af den sammenlignende Ct-metoden, hvor Ct er cyklussen telefonnummer, hvor fluorescens først overstiger tærsklen. Ct-værdier fra hver prøve blev opnået ved at subtrahere værdierne for beta-actin Ct fra målgenet Ct-værdi. Variationen af ​​

beta actin

Ct-værdier er 0,5 blandt forskellige prøver. En én cyklus forskel af Ct-værdi betegner en 2-fold forskel i niveauet af mRNA. Specificitet af resulterende PCR-produkter blev bekræftet ved smeltning kurver og agarosegel.

Transfektion, promoter aktivitet og luciferaseanalyse

PSA-Luc og Plars-Luc plasmider er en venlig gave fra Dr. Wang Longgui (New York University Cancer Institute). Humant Sp1-HA mærkede plasmid blev venligst stillet til rådighed af Macus Tien Kuo (The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). C4-2B og LNCaP-celler blev co-transficeret med PSA-Luc eller Plars-Luc og Renilla luciferase plasmid PGL 4,71 (Promega) eller med Sp1-HA plasmidet ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter 48 timer blev flavokawain B tilsat som indikeret med tredobbelt gentagelser. Så celler blev høstet og luciferaseaktiviteten blev målt med Dual-Glo Luiferase analysesystem (Promega). Renilla luminescens blev anvendt som en indre kontrol for celleantal og transfektionseffektivitet. Det relative forhold mellem luminescens fra interesserede gen promoter til Renilla luminescens blev vist i figurerne som promotor-aktivitet. For Sp1 transfektion blev celler høst en immunoblotting assay.

chromatin Immunfældning (chip) [10]

LNCaP og C4-2B celler blev tværbundet med formaldehyd. Protein /DNA-komplekset blev klippet til 500-1500 bp fragmenter ved lydbehandling. Lige store mængder protein (4 mg) blev inkuberet med Sp1 antistof eller med et muse anti-GFP-antistof. Protein G sepharose-perler (Sigma) blev anvendt til at trække ned i komplekset, efterfulgt af vask med High Salt Wash Buffer, LiCI, og TE buffere). De DNA-protein-immunpræcipitater blev elueret fra perlerne, og DNA’et blev ekstraheret og oprenset. Expand High-Fidelity PCR System (Roche) blev anvendt til at amplificere sekvensen fra +248 til 487 nukleotider af AR 5′-UTR region, der indeholder to Sp1 bindingssteder. Primer sekvenser er tilgængelige efter anmodning.

Behandling af patient-afledt PCA tumor xenograftmodeller

prostatektomi væv blev opnået gennem en IRB-godkendt protokol på UCI Medical Center. Små fragmenter af histologisk gennemprøvet tumor blev implanteret i 8 uger gamle mandlige alvorlig kombineret immundefekt (SCID) mus ved anvendelse af en subrenal xeongraft teknik [11]. Tumorer, der er udpeget som GM0308 og RC0309 ved 3 og 13 murine passager henholdsvis blev re-implanteret i subkutane lommer af SCID-mus. En uge senere, når tumorerne voksede til ca. 100 mm

3, mus blev randomiseret i behandlingsgrupper. For kava ekstrakt behandling blev mus fodret med en standard diæt suppleret med enten vehikel kontrol eller 6 g /kg kava ekstrakt i kosten. For flavokawain B behandling blev mus injiceret intraperitonealt hver dag med vehikelkontrol (10% DMSO, 20% ethanol og 70% Cremophor) eller 200 mg flavokawain B /kilogram musenes kropsvægt. Behandling blev fortsat fra dag 0 til dag 17 for kava ekstrakt og til dag 27 for flavokawain B. Tumorvækst blev overvåget ved både serum PSA og caliper måling af tumorstørrelse ugentligt. Kropsvægt og fødevareindtag blev registreret under forsøgene. Ved slutningen af ​​eksperimenterne blev tumorvæv vejet og skåret i halve for mRNA isolation og immunhistokemi farvning hhv. Tumorvolumenet blev beregnet ved formlen: 0,5236 × L

1 × (L

2)

2, hvor L

1 er den lange akse og L

2 er den korte akse af tumoren. Serum PSA koncentrationen blev bestemt ved PSA enzymmaerket assay kit (Bio-Quant, San Diego, CA) efter sættet instruktion.

Immunhistokemi

Antigen blev hentet anvendelse af 0,05 M glycin-HCL puffer, pH 3,5, indeholdende 0,01% (vægt /volumen) EDTA, ved 95 ° C i 20 minutter og farvet med anti-humant AR (1:100). Farvning blev visualiseret med diaminobenzadin hjælp af Cell og Tissue Farvning kit (R barer, SD. Hver prøve blev talt i to eksemplarer. IC

50 s blev estimeret ved dosis-respons-kurver.

Kava rod ekstrakt og kavalactones formindske ekspressionen af ​​PSA og TMPRSS2 gennem acceleration af AR proteinnedbrydning

Figur 3A viser, at kava ekstrakt og kavalactones (dvs. kawain, 5’6′-dehydrokawain, yangonin, og methysticin) markant ned-regulere mRNA ekspressionen af ​​AR målgener (

PSA

TMRSS2

), men ikke mRNA udtryk for AR i C4-2B celler. Figur 3B og C viser, at både kava ekstrakt og individuelle kavalactones mindske AR og PSA proteinekspression så godt. Den væksthæmmende virkning af kavalactones korrelerede dårligt med deres virkninger på AR protein nedregulering. C4-2B celler, en androgen-uafhængig LNCaP-derivat, var mere følsomme over for AR nedregulering virkning af kavalactones og kava ekstrakt end var LNCaP-celler.

(A). C4-2B celler blev behandlet med 0,1% DMSO, kava rod ekstrakt, dehydrokawain, kawain, yangonin og methysticin i 8 timer. mRNA-niveauer af AR og AR målgener (

PSA

TMPRSS2

) blev bestemt ved real-time RT-PCR. Barer er middelværdier ± SD af tre uafhængige kvantitative foranstaltninger. Kava rod ekstrakt og kavalactones signifikant fald mRNA ekspressionen af ​​AR målgener (Student

t

test, P 0,01), men ikke fra AR (P 0,05). (B) og (C). Proteinet ekspression af AR og PSA i LNCaP og C4-2B celler efter indikeret behandlinger i en koncentration på deres IC

50 s i 16 timer blev analyseret ved Western blot. a-tubulin blev detekteret som en loading kontrol. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg. Y = yangonin; M = methysticin; D = 5’6; -dehydrokawain; K = kawain, KRE = kava rod ekstrakt. (D). C4-2B celler blev forbehandlet med 10 pg /ml cycloheximid i 2 timer og derefter suppleret med kava rod ekstrakt eller 5’6; -dehydrokawain i en koncentration på deres IC

50 s for forskellige tidsrum. Efter behandlingerne blev AR proteinniveauer analyseret ved Western blotting og semi-kvantificeres ved densitometri måling. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg.

Vi undersøgte dernæst stabilitet AR protein ved behandling af cellerne med cycloheximid for at inhibere ny proteinsyntese. Figur 3D viser, at AR protein udviser en accelereret nedbrydning i C4-2B celler behandlet med enten kava ekstrakt eller 5’6′-dehydrokawain, sammenlignet med dets stabilitet i vehikelbehandlede celler. Ved 16 og 24 timer efter behandlingerne, kava ekstrakt og 5’6′-dehydrokawain behandlinger sænke AR proteinniveauer med omkring 80% og 70%, hvorimod det AR proteinniveauet i vehikelkontrol kun falde med ca. 20% og 37% henholdsvis (figur 3D).

Flavokawain B nedregulerer ekspressionen af ​​AR og dets målgener (PSA og TMPRSS2)

Flavokawain B er den mest potente middel til inhibering af cellevækst blandt undersøgte bioaktive komponenter af kava-ekstrakt. Vi undersøgte derfor effekten af ​​flavokawain B på AR udtryk. Figur 4A viser, at flavokawain B signifikant fald AR proteinekspression i alle AR udtrykke cellelinier (LAPC4, C4-2B, WPMY-1, LNCaP og 22Rv1). Interessant, AR proteinniveauet i WPMY-1-celler er de mest følsomme over flavokawain B behandling. Siden WPMY-1 betegner en transformeret prostata myofibroblastdifferentiering linje [12], dette resultat antyder, at flavokawain B kan være et hidtil ukendt middel til målretning PCa stromal AR. Flavokawain B også reducerede proteinniveauer af PSA (figur 4A). Figur 4B viser, at flavokawain B inhiberer ekspressionen af ​​AR og PSA-proteiner induceret af et syntetisk androgen analog, R1881. Forbehandling med en proteasominhibitor, MG132, ikke inddrive flavokawain B nedreguleret-AR proteinniveau (figur 4C). I modsætning til den kava ekstrakt og kavalactones behandlinger, behandling af LNCaP og C4-2B celler med 5 pg /ml flavokawain B 4 og 8 timer resulterede i et markant fald i mRNA-niveauerne af

AR

og dets mål gener

(PSA og TMPRSS2) Hotel (figur 4D). Disse resultater antyder, flavokawain B-medieret AR nedregulering er gennem sin transkriptionel regulering.

(A) .Den protein ekspression af AR og PSA efter anførte behandlinger i 16 timer eller 5 ug /ml FKB for angivne periode gange blev analyseret ved Western blot. a-tubulin blev detekteret som en loading kontrol. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg. (B) .Western blotting analyse viser, at FKB nedsætter både konstitutiv og et syntetisk androgen, R1881, stimuleret AR og PSA-ekspression i LNCaP-celle. LNCaP-celler blev dyrket i trækul strippet FBS-medium. FKB og R1881 ved angivne koncentrationer behandlede celler i 16 timer. α-tubulin blev detekteret som en loading kontrol. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg. (C). Proteasominhibitor, MG132, påvirker ikke FKB medieret nedregulering af AR protein udtryk. LNCaP-celler blev behandlet med MG132 i 2 timer og derefter tilsat FKB i yderligere 16 timer. a-tubulin blev detekteret som en loading kontrol. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg. (D). LNCaP og C4-2B celler blev behandlet med 5 ug /ml FKB i 4 og 8 timer. Real-time RT-PCR blev udført for at analysere mRNA-ekspression af AR og AR målgener (

PSA

TMPRSS2

). Søjler er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. FKB signifikant nedsætter mRNA ekspressionen af ​​AR målgener (Student

t

test, P 0,01).

Den transkriptionelle undertrykkelse af AR ved flavokawain B kræver udtryk for transkriptionel faktor Sp1

Vi næste undersøgt potentiel mekanisme af flavokawain B medieret AR transskription. Sp1 er en formodet transkriptionel faktor for AR regulering. Sp1 binder direkte til GC-boksen i AR-promotoren gennem en zink-finger-protein-motivet [13], [14]. Derfor blev en AR promotor luciferase reporter, som indeholder fire Sp1 bindingssteder anvendes til assay AR promotoraktivitet i PCA-cellelinier. Figur 5A viser, at flavokawain B behandlinger markant nedsætte AR promotoraktivitet i en dosis-afhængig måde. Faldet i AR promotoraktivitet ved flavokawain B var forbundet med en reduktion af Sp1 proteinniveauer (figur 5B). Følgelig chipanalyse afslørede, at flavokawain B behandling af C4-2B og LNCaP-celler markant inhiberede bindingen af ​​Sp1 til AR promotorsekvenser (Figur 5C). For at undersøge om Sp1 er påkrævet for flavokawain B-medieret AR nedregulering blev C4-2B celler transient transficeret med SP1 og derefter behandlet med flavokawain B. Figur 5D viser, at overekspression af Sp1 forøgede AR proteinniveauer og dæmpede flavokawain B-induceret AR nedregulering. Tilsammen vores resultater viser klart, at flavokawain B nedsætter Sp1 proteinekspression fører til AR transkriptionel nedregulering.

(A) .C4-2B celler blev co-transficeret med PSA-Luc eller Plars-Luc, sammen med en Renilla luciferase plasmid PGL 4.71 og Luciferaseaktiviteter blev målt. FKB signifikant nedsætter promoter aktiviteter

AR

og

PSA

gener (Student

t

test, P 0,01). Søjler er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. (B) .Western blotting analyse af Sp1 proteinekspression. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg. α-tubulin blev detekteret som en loading kontrol. (C). Chipanalyse af bindingen af ​​Sp1 til AR promotorsekvensen viser, at 16 timer FKB behandling resulterer i et signifikant fald i bindingen af ​​Sp1 til AR promotorsekvens, der indeholder to Sp1 bindingssteder. Muse-IgG blev anvendt som en blank kontrol. (D). Overekspression af Sp1 i C4-2B celler dæmper FKB induceret AR protein nedregulering. Efter 48 timers Sp1-HA plasmid transfektion blev C4-2B celler behandlet med FKB i 16 timer. Sp1 og AR proteinniveauer blev undersøgt. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg. α-tubulin blev detekteret som en belastning kontrol.

kavalactones og flavokawain B kombinationen resulterer i en forbedret hæmmende effekt på væksten af ​​C4-2B celler og på ekspressionen af ​​AR protein

Figur 6A og B viser, at 7,5 ug /ml yangonin og 1 ug /ml flavokawain B alene hæmmede væksten af ​​C4-2B celler med 15% og 20%, hvorimod deres kombination reducerede væksten med mere end 70%. Tilsvarende 5’6′-dehydrokawain i en dosis på 7,5 ug /ml faldt væksten af ​​C4-2B celler med mindre end 5%, mens dens kombination med 1 ug /ml flavokwain B hæmmede væksten med omkring 60%. I overensstemmelse med dette resultat, flavokawain B i kombination med andre kavalactones (dvs. kawain og methysticin) resulterede også i en synergistisk hæmmende virkning på væksten af ​​C4-2B celler (figur 6C og D). Desuden kombination af 5’6′-dehydrokawain eller yagonin med flavokawain B behandlinger resulterede i en forbedret nedregulering af AR proteinekspression i både C4-2B og 22Rv1 celler (figur 6 E og F). Især 22Rv1 huser en AR splejsningsvariant med en molekylvægt på ca. 80 KD [15]. Flavokawain B og 5’6′-dehydrokawain er mere effektive til at reducere ekspressionen af ​​AR splejsningsvariant end den AR fuld længde (figur 6F). Disse resultater indikerer, at kavalactones og flavokawain B virker synergistisk eller additivt til at inhibere væksten af ​​PCA-celler og at nedregulere protein ekspression af AR og AR splejsningsvariant.

væksthæmmende af FKB og yagonin (A), eller 5’6; -dehydrokawain (B), eller kawain (C), eller methysticin (D) alene og i kombination på C4-2B celler. Hvert punkt er gennemsnittet af fire uafhængige forsøg; barer, SD. Hver prøve blev talt i to eksemplarer. IC

50 s blev estimeret ved dosis-respons kurver, IC

50 s af kombinationerne er betydeligt lavere end alene behandlinger (Student

t

test, P 0,01). (E) og (F) Western blotting-analyse af ekspression af fuldlængde-AR (110 kDa), AR splejsningsvariant (83 kDa) og PSA i C4-2B og 22Rv1 celler. En repræsentativ blot blev vist fra tre uafhængige forsøg. α-tubulin blev detekteret som en belastning kontrol.

Kava udtrække og flavokawain B mindske væksten af ​​patient-afledt PCA xenografter i SCID-mus, AR udtryk i tumorvæv og serum PSA niveauer

for at bestemme

in vivo

anti-PCa effekt af kava ekstrakt og flavokawain B, udviklede vi to mere klinisk relevante, patient-afledte PCA xenograftmodeller, GM0308 og RC0309. Den GM0308 patient-afledte PCa xengrafts linje blev afledt af en høj kvalitet (Gleason score sum = 5 + 5) PCA prostatektomi prøve opnået fra en patient, som tidligere blev behandlet med androgen deprivation terapi (ADT), docetaxel plus carboplatin og etoposid plus cisplatin. Xenotransplantatet tumorvækst blev oprindeligt indført ved anvendelse af en subrenal xenograft teknik, og ledes derefter gennem subkutan injektion af tumorstykker. Den RC0309 linje blev afledt af en høj kvalitet (Gleason score sum = 5 + 4) PCa prostatektomi prøve opnået fra en patient, som havde ingen tidligere behandling. Disse humane cancer-xenotransplantater trofast bevare histopatologiske karakteristika oprindelige prøvemateriale. Begge linjer udskiller PSA i værten museserum (figur 6A). Den GM0308 linje udtrykker et trunkeret AR omkring 80 KDa, uden missense mutationer i exon 3, 4, eller 5 (data ikke vist). I modsætning hertil RC0309 holder fuldlængde AR (data ikke vist).

Mus bærer GM0308 tumorer ved passage 3 blev behandlet med vehikelkontrol eller 200 mg /kg flavokawain B dagligt ved IP-injektion i 28 dage. Figur 6A viser en progressiv tumor xenograft vækst og serum PSA stigning under hele undersøgelsen i bilen kontrolgruppen. Den flavokawain B behandling resulterede imidlertid i en nedsat sats af tumorvækst i sammenligning med kontrolgruppen hele undersøgelsen (figur 7A). De våde tumor vægte eller serum PSA i kontrol og flavokawain B-behandlede gruppe indspillet ved afslutningen af ​​behandlingen er 0,43 ± 0,27 g og 0,097 ± 0,048 g, eller 66,6 ± 12,8 ng /mL og 18,4 ± 4,8 ng /ml ( middelværdi ± SD, n = 13 for kontrol og n = 6 for FKB behandlingsgrupper; P 0,001, Students t-test). Flavokawain B behandling svækket tumorvækst 77,3% og reducerede serum PSA-niveauer med 68% ved udgangen af ​​behandlingen.

(A) og (B). De mus med patient-afledt PCA tumorer blev tilfældigt opdelt i behandlings- og kontrolgrupper med lignende forbehandling serum PSA-niveauer i hver gruppe. Tumorvolumener og serum PSA blev registreret, og præsenteres som gennemsnit ± SD. Vådvægt af tumorer er repræsenteret som gennemsnittet af tumorer fra individuelle mus i hver gruppe. Barer, betyder ± SD. De tumor volumen (gentagne-foranstaltninger variansanalyse (ANOVA), s 0,01) og tumor vægte (Student

t

test, P 0,01) i FKB og KRE behandlede mus var væsentligt lavere end for køretøjer kontrol behandlede mus. (C). Immunhistologi farvning af AR udtryk i tumorvæv. Kontrol immunfarvning blev udført med IgG isotype alene; Objektglas blev modfarvet med hematoxylin og fotograferet under anvendelse af et lysmikroskop. Original forstørrelse: × 200. (D). AR-positive celler blev talt i 12 felter i hver gruppe. Procentdelen af ​​AR-positive celler blev beregnet og præsenteret som gennemsnit ± SD (de venstre to paneler). MRNA-niveauer af

AR

,

PSA

TMPRSS2

i tumorvæv behandlet med vehikel eller FKB blev analyseret ved RT realtids-PCR (højre panel). Barer, betyder ± SD. Procentdelen af ​​AR positive celler er betydeligt lavere i KRE og FKB behandlede grupper end dem i køretøjskontrolsystemer behandlede grupper (Student

t

test, P 0,01). De mRNA niveauer af

AR

,

PSA

TMPRSS2

er lavere i KRE og FKB behandlede grupper end i kontrolgruppen (Student

t

test, P . 0,01)

Mus bærer RC0309 tumorer ved passage 13 blev fodret med mad suppleret med køretøjets styring eller 6 g /kg kava ekstrakt i 18 dage. Tilsvarende kava rod ekstrakt tilskud resulterede i et signifikant fald i vækstraten af ​​tumorer sammenlignet med vehikelkontrol (figur 7B, ANOVA, P 0,01). De våde tumorvægte var 1,83 ± 0,79 g i kontrolgruppen og 0,73 ± 0,34 g i kava rod ekstrakt gruppe (figur 7B, n = 5, middelværdi ± SD; P 0,05, Student t-test). (B). (C).