PLoS ONE: Eksperimentel Behandling af kræft i æggestokkene med syntetisk Makaluvamine Analog: In vitro og in vivo Anticancer aktivitet og molekylære mekanismer i Action

Abstrakt

Den foreliggende undersøgelse er designet til at bestemme de biologiske virkninger af nye marine alkaloid analog 7- (4-fluorbenzylamino) -1,3,4,8-tetrahydropyrrolo [4,3,2-de] quinolin-8 (1H) -on (FBA-TPQ) på humane ovariecancerceller for sin anti-tumor potentiale og den underliggende mekanismer som et nyt kemoterapeutisk middel. Humane ovariecancerceller (A2780 og OVCAR-3), og Immortaliserede ikke-tumorigene humane Ovarian Surface epithelceller (IOSE-144), blev udsat for FBA-TPQ til indledende cytotoksicitet evaluering (via MTS-assay kit, Promega). Den detaljerede

in vitro

(celle niveau) og

in vivo

(dyremodel) undersøgelser af antitumor virkninger og mulige underliggende virkningsmekanismer af forbindelserne blev derefter udført. FBA-TPQ udøvede potent cytotoksicitet mod human ovariecancer A2780 og OVCAR-3 celler som en effektiv inhibitor af cellevækst og proliferation, mens udøver mindre effekt på ikke-tumorigene IOSE-144 celler. Yderligere studier i mere følsomme OVCAR-3 cellelinien viste, at det kraftigt kunne inducere celle apoptose (Annexin V-FITC assay), G2 /M-cellecyklusstandsnings (PI farvning analyse) og også dosisafhængigt inhiberer OVCAR-3 xenotransplantattumorer ‘ vækst på kvindelige athymiske nøgne mus (BALB /c, nu /nu). Mekanistiske undersøgelser (begge

in vitro

in vivo

) viste, at FBA-TPQ kunne udøve sin virksomhed gennem Reaktive Oxygen Species (ROS) associeret aktivering af død receptoren, p53-MDM2, og PI3K-Akt veje i OVCAR-3 celler, hvilket er i overensstemmelse med

in vitro

microarray (Human genome microarrays, Agilent) dataanalyse (GEO tiltrædelse nummer: GSE25317). Afslutningsvis FBA-TPQ udviser signifikant anticancer aktivitet mod ovariecancerceller, med minimal toksicitet for ikke-tumorigene humane IOSE-144 celler, hvilket indikerer, at det kan være et potentielt terapeutisk middel til ovariecancer

Henvisning:. Chen T, Xu Y, Guo H, Liu Y, Hu P, Yang X, et al. (2011) Eksperimentel Behandling af kræft i æggestokkene med syntetisk Makaluvamine Analog:

In vitro

In vivo

anticanceraktivitet og molekylære mekanismer i aktion. PLoS ONE 6 (6): e20729. doi: 10,1371 /journal.pone.0020729

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: November 16, 2010; Accepteret: 11 maj 2011; Udgivet: 6 juni 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra One Hundred Talents program af det kinesiske Academy of Sciences, National Nature Science Foundation (30870513, 31070680 og 91029715), Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina (2007CB947100), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune ( 08391910800, 10391902100), National Science og Technology Major Project “Key New Drug Creation and Manufacturing Program” (2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Xuhui i Shanghai kommune (RCT201001, CRC2010002), direktør Foundation of INS (20090101), Food Safety Research center og Key Laboratory of Nutrition and Metabolism af INS, SIBS, CAS. R.Z. blev støttet delvist af National Institutes of Health /National Cancer Institute giver R01 CA112029 og R01 CA121211. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene, der tegner sig for omkring 5 procent af kvinders kræft død, er nu den femte almindelige kræftform i USA kvinder [1]. Ca. 70% af alle patienter med ovariecancer er diagnosticeret på de mere fremskredne stadier af sygdommen, der fører til en dårlig prognose [2], [3]. I de seneste to årtier, selv om 5-årige overlevelsesrate for patienter med ovariecancer er blevet væsentligt forbedret som følge af anvendelsen af ​​vellykket operation og udvikling eller optimering af tumordræbende stoffer, overlevelse stadig lav, på ca. 30% [2] – [4]. Således er der et presserende behov for at udvikle hidtil ukendte terapeutiske midler, der kan anvendes til behandling af sygdommen.

Marine organismer er en rig kilde af potentielle blyforbindelser med unikke farmakologiske egenskaber [5], [6]. Talrige marine naturlige produkter med nye molekylære strukturer og forskellige biologiske funktioner er blevet rapporteret i løbet af de seneste årtier [7]. Makaluvamines, en klasse af marine pyrroloiminoquinone alkaloider isoleret fra svampe af slægterne

Zyzzya

, er blevet rapporteret at have potent

in vitro

in vivo

cytotoksicitet mod flere human cancer cellelinjer, og denne aktivitet blev tilskrevet deres aktivitet som topoisomerase II inhibitorer [8] – [14]. Flere andre makaluvamines har vist sig at forårsage direkte DNA-skader, der fører til antitumorvirkninger [6], [15].

Vi har syntetiseret mere end 40 hidtil ukendte makaluvamine analoger og systematisk evaluerede deres anticancer aktiviteter i brystcancer celle linjer. Vores data viser, at det potente makaluvamine analog, FBA-TPQ kunne inhibere tumorvækst ved aktivering af tumorsuppressorer, inhibering af onkogener, og aktivering af DNA beskadigelse respons [6], [16]. I nærværende rapport, vi udvidet vores undersøgelse at vurdere de anti-tumor aktiviteter FBA-TPQ mod kræft i æggestokkene celler og forsøgte at yderligere at belyse de mulige virkningsmekanismer.

Resultater

In vitro

cytotoksicitet FBA-TPQ til A2780 og OVCAR-3 celler blev først vurderet ved hjælp af MTS assay (Promega). A2780 og OVCAR-3 og human ovarie IOSE144 (Immortaliserede ikke-tumorigene æggestokkene Surface Epitelceller) celler blev udsat for FBA-TPQ (se fig. 1A) ved forskellige koncentrationer i 48 timer. Levedygtighed A2780 og OVCAR-3 celler blev signifikant reduceret, med IC

50 på 1780 nM (A2780) og 980 nM (OVCAR-3) (fig. 1B). Udsættelse for FBA-TPQ førte til dosis-afhængige virkninger på celle overlevelse, hæmme A2780 levedygtighed ved 25,2%, 45,7%, og 65,8%, mens hæmme OVCAR-3 celler levedygtighed ved 33,9%, 56,7%, og 73,7%, henholdsvis for den 0,5, 1,0 og 2,5 pM koncentrationer, henholdsvis (figur 1, s. 0,05). På den anden side, de IOSE144 celler var meget mindre følsomme over for FBA-TPQ behandling, med en IC

50 over 10 pM (Fig 1B, s. 0,01). Udsættelse for FBA-TPQ faldt levedygtighed IOSE-144 celler med 2,7%, 7,7% og 25,6%, henholdsvis for de 0,5, 1,0 og 2,5 uM koncentrationer (fig. 1B), hvilket indikerer, at FBA-TPQ har selektiv aktivitet mod ovariecancerceller. Desuden FBA-TPQ inhiberede A2780 og OVCAR-3 celler proliferation på en dosis-afhængig måde (Fig. 1C og 1D), mens dens anti-proliferative virkninger var meget mindre tydeligt i IOSE144 celler behandlet med de samme koncentrationer af FBA- TPQ (fig. 1E). Faktisk FBA-TPQ signifikant inhiberede A2780 og OVCAR-3 celler spredning begyndende ved den 0,5 uM koncentration (Fig 1C og 1D, s. 0,05), mens der ikke var nogen signifikant inhibering i IOSE-144-celler ved nogen af ​​koncentrationerne ( op til 1 uM;. figur 1E, p 0,05). Disse data tyder på, at FBA-TPQ selektivt kan hæmme A2780 og OVCAR-3 æggestokkene vækst kræftcellen og spredning samtidig udøve mindre potente virkninger på ikke-tumorigene IOSE144 celler.

A, Kemisk struktur og molekylformel FBA-TPQ ; B, Cellelevedygtighed (MTS) assay af humane ovarie carcinomaceller (A2780 og OVCAR-3) og ikke-tumorigene OSE celler (IOSE144) efter en 48 timers inkubation med FBA-TPQ; C 0,05 ). De pro-apoptotiske virkninger var mere udtalt i en koncentration på 2,5 uM (apoptotisk indekset steg til ca. 600% sammenlignet med kontrol) (fig 2B, s. 0,01). Afslutningsvis viste vores data, at FBA-TPQ kan fremkalde betydelig apoptose i OVCAR-3 celler i en dosisafhængig måde.

A, Apoptose af OVCAR-3 celler behandlet med serielle koncentrationer af FBA-TPQ for 24 timer; B, Data oversigt og analyse af det apoptotiske indeks (Q1 afspejler nekrose, Q2 afspejler sen apoptose, Q3 afspejler rask cellepopulation ikke påvirket af apoptose eller nekrose mens Q4 afspejler tidlig apoptose). C, Cell cyklus evaluering af OVCAR-3 celler behandlet med serielle koncentrationer af FBA-TPQ i 12 timer; D, Dataanalyse af celler præsenteres som procent fordelingen af ​​en specifik fase (*,

s

0,05 versus kontrol, **,

s

0,01 versus kontrol, henholdsvis ). Data er repræsentative for værdier fra mindst tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

Vi undersøgte også, om FBA-TPQ har nogen effekt på cellecyklusprogression i OVCAR-3 celler. Til dette assay, vi faldt FBA-TPQ inkuberingstid til 12 timer for at undgå den høje apoptose induktion. Som illustreret i fig. 2C og 2D, efter en 12-h behandling, FBA-TPQ inducerede signifikante stigninger i antallet af celler i G

2 /M-fase ved 1500 nM (21,6% stigning af kontrol, p 0,05) og 2,5 uM (30,0% stigning af kontrol, p 0,05) koncentrationer. Derudover også FBA-TPQ behandling førte til en betydelig stigning i antallet af celler i S-fasen ved 2,5 uM koncentration (Fig 2D, s. 0,05). Som opsummeret i fig. 2D, FBA-TPQ forårsagede en ledsagende, dosisafhængig, fald i antallet af celler i G0 /G1-fasen (p 0,01). Tilsammen vore data tyder på, at de inhiberende virkninger af FBA-TPQ på cellelevedygtighed og vækst kan være forbundet med dets induktion af apoptose og cellecyklusstop.

I vores tidligere arbejde, vi rapporterede, at FBA-TPQ kan udøve DNA-skader i brystcancerceller [6]; her, undersøgte vi, om FBA-TPQ kan inducere cellulær ROS stress og forårsage oxidativ beskadigelse af DNA i ovariecancerceller. I dette assay vi faldt inkubationstiden igen til 4 timer (for at undgå ROS dæmpning), mens øgede serielle koncentrationer på 0, 1,0, 2,0 og 3,0 uM (til fremstilling hurtig ROS induktion til fanger billedet). Som vist i fig. 3A og 3B, efter 4 timers inkubation, FBA-TPQ inducerede en signifikant (p 0,05) dosisafhængig stigning i cellulær ROS-produktion i OVCAR-3 celler (Fig 3B.). Baseret på vores observation, at FBA-TPQ kunne inducere apoptose, vi evaluerede mitokondrierne trans-membran potentiale (

A ^ m

) dissipation som en indikator for mitochondriemembran forstyrrelser og celler undergår apoptose. Brug af JC-1 farvestof, observerede vi, at FBA-TPQ behandling resulterede i en signifikant (p 0,05) dosisafhængig

^ m

dissipation (dosisafhængig reduktion af JC-1 aggregater er angivet med nedsat forhold mellem rød /grøn fluorescensintensitet) efter 24 timer eksponering (fig. 4A og 4B). Tilsammen disse resultater dokumenterer, at FBA-TPQ inducerer forhøjet cellulær ROS produktion og tab af mitokondrier membranpotentiale, indlede endogene ROS stress-udløst tidligt cellulære apoptose pathway

A . B, FBA-TPQ inducerer dosis -afhængig ROS stress i OVCAR-3 celler (A, den dosisafhængige stigning i ROS som angivet ved CM-H

2DCFDA, B, data samlet som procentdelen i forhold til kontrollen). C, Western blot-analyse af cellulære protein ekspressionsniveauer af det tilknyttede pathway, hvilket indikerer FBA-TPQ kan tage virkninger gennem ROS-ledsaget, og PI3K-Akt-medieret /p53-MDM2-relateret celleproliferation, apoptose og cellecyklusprogression associeret pathway på OVCAR-3 æggestokkene kræft cellelinier efter 24 timers eksponering (ved 250,750 og 1000 nm-koncentrationer).

A og B, Fluorescensintensitet (JC-1 producerer rød fluorescens i mitokondrierne som JC-1 -aggregates mens udsender grøn fluorescens, når lækager i cytoplasmaet som JC-1-monomerer, Fluorescensintensitet skift mellem grøn og rød er proportional med

A ^ m

ændring) værdier af JC-1 farvestof på bestemte excitationsbølgelængder og tilsvarende forhold for Red /Green ændring (% af kontrollen) efter udsættelse for FBA-TPQ i 24 timer (*,

s Restaurant 0,05 versus kontrol). C D, hæmning af tumorvækst i mus bærende OVCAR-3 xenotransplantattumorer (*,

s

0,05 versus kontrol **,

s

0,01 versus kontrol) , og de tilsvarende ændringer i kropsvægt i løbet af behandlinger (

s

0,05); E, Western-blot-analyse af proteiner (af musene xenotransplantattumorer efter FBA-TPQ behandling af 0, 1 eller 10 mg /kg dosis) involveret i FBA-TPQ-udløst, og PI3K-Akt medieret /p53-MDM2-relaterede pathway.

for yderligere at definere virkningerne af FBA-TPQ på celleapoptose, cellecyklusprogression og proliferation, undersøgte vi niveauet af ekspression af et panel af proteiner involveret i disse veje i OVCAR-3 celler (se fig. 3C). Efter en 24-h behandling af FBA-TPQ (med koncentrationer på 0, 0,25, 0,75 og 1,0 uM), observerede vi en dosisafhængig stigning i ekspressionen af ​​cleaved- Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og Caspase- 3, samt Bax, med en ledsagende dosis-afhængigt fald i Bcl-2. Vi undersøgte yderligere mulige mekanismer, der er ansvarlige for de anti-proliferative og cellecyklus regulerende virkninger af FBA-TPQ. Som ovenfor, vurderede vi ekspressionsniveauet af forskellige proteiner forbundet med proliferation og cellecyklusprogression, og observerede nedregulering af Cdc25C, CyclinB1 og cyclin-afhængig kinase (CDK) 1, der er ansvarlige for G2 /M faseovergang, og fundet en stigning i ekspressionen af ​​Rb, p21 og P27-proteiner, samt et fald i E2F1-protein, som alle er involveret i celleproliferation (fig. 3C). Desuden viste vores data, at FBA-TPQ kan formindske ekspressionen og aktivering (angivet ved phosphorylering) af Akt, samt dens opstrømskinase PI3K katalytiske subunit PI3K-110α. Vi evalueres yderligere de regulatoriske virkninger af FBA-TPQ på p53, og fandt, at FBA-TPQ aktiveret p53, med en ledsagende nedregulering i MDM2 udtryk (se fig. 3C), og øget spaltning af PARP og Caspaser-3. Disse fund indikerer apoptose og /eller anti-proliferative og cellecyklus inhiberende virkninger. Som vist i fig. 3C, vi også observeret en dosisafhængig opregulering af Fas, hvilket indikerer, at dødsfaldet receptor pathway, sammen med p53 kan spille en vigtig rolle i reaktionen på FBA-TPQ og dens stimulering af ROS stress. Tilsammen kan vi konkludere, at FBA-TPQ kan udøve sine

in vitro

effekter gennem ROS-associerede og PI3K-Akt-medieret /p53-MDM2-relaterede celleproliferation, apoptose og cellecyklus progression forbundet veje (fig. 5).

Vi etablerede OVCAR-3 tumor xenograftmodel at evaluere

in vivo

anti-tumor aktivitet af FBA-TPQ. Forbindelsen blev administreret 5 dage om ugen i.p. i en dosis på 1 mg /kg eller 10 mg /kg. Terapeutiske virkninger blev evalueret ved at undersøge tumorvækst. Som vist i fig. 4C, FBA-TPQ udviser signifikant (p 0,01) tumorinhibering på en dosis-afhængig måde. Den betydelige vækst tumor hæmmende effekt begyndte at være indlysende på den niende dag i behandling (p 0,05). Efter 18 dages behandling, FBA-TPQ resulterede i 20,5% tumorvækstinhibering (sammenlignet med kontrolgruppen) ved den nedre 1 mg /kg dosis, og 69,4% tumorvækstinhibering ved den højere 10 mg /kg dosis (fig. 4C , p 0,01). Selv de mus, der fik /kg dosis 10 mg oplevede et mindre tab i kropsvægt, var der ingen signifikante forskelle i vægttab (p 0,05) mellem de tre grupper, hvilket indikerer, at FBA-TPQ kan have en acceptabel sikkerhedsprofil (fig. 4D).

for at validere

in vitro

resultater om virkningsmekanismen af ​​FBA-TPQ, vi yderligere vurderede

in vivo

udtryk niveau proteiner undersøgt i de dyrkede celler (fig. 4E). Overensstemmelse med

in vitro

data, de protein ekspressionsmønstre i det behandlede xenotransplantat tumorvæv var i det væsentlige de samme som de cellulære observationer (se fig. 3C og Fig. 4E), bekræfter, at antitumorvirkninger af FBA-TPQ er, i det mindste delvist medieret gennem induktion af ROS stress og efterfølgende mitokondrie sammenbrud, der fører til ændringer i cellulære kaskader, der er involveret i apoptose, celledeling og cellecyklus progression.

diskussion

den foreliggende undersøgelse er den første til systematisk at undersøge den nye syntetiske makaluvamine analog FBA-TPQ s

in vitro

in vivo

anti-tumor effekt i æggestokkene cancerceller. Vi viste, at FBA-TPQ udøver sine anti-cancer aktiviteter på A2780 og OVCAR-3 celler ved inhibering af cellevækst og proliferation. Yderligere studier brug den mere følsom OVCAR-3 cellelinien viste, at det kunne inducere celle apoptose og cellecyklusstandsning. Sådanne funktionelle resultater opnås gennem en kaskade af reaktioner i disse veje, herunder induktion af cellulær ROS stress, død-receptor-aktivering og mitokondrie sammenbrud, og efterfølgende regulering af p53-MDM2 og PI3K-Akt tilhørende veje.

I vores tidligere undersøgelser, viste vi, at FBA-TPQ er den mest potente makaluvamine analog med hensyn til induktion af DNA-skader, apoptose, cellecyklusstandsning og proliferation inhibering i brystcancerceller [6]. Imidlertid havde de mulige underliggende mekanismer for disse anti-tumor aktiviteter og stoffets potentiale ansøgning om andre typer kræft ikke blevet belyst. Fokus for den aktuelle undersøgelse var at bestemme, hvorvidt FBA-TPQ kunne repræsentere en lovende kandidat til fremtidige anti-cancer udvikling af lægemidler, og for yderligere at belyse dens mekanisme (r) handling.

Vi oprindeligt observeret, at FBA- TPQ udøver betydelige cytotoksicitet og celleproliferation hæmningseffekter mod A2780 og OVCAR-3 celler. Efterfølgende evaluering viste en dosisafhængig effekt af FBA-TPQ på OVCAR-3 celler apoptose, og cellecyklusprogression (G2 /M-fase-cellecyklusstandsnings). Disse observationer blev yderligere understøttet af udtryk profilering af beslægtede proteiner i OVCAR-3 celler ved hjælp af Western blotting. I et forsøg på at udforske mekanismen (r) for bag de observerede biologiske aktiviteter af FBA-TPQ, fandt vi, at FBA-TPQ kan inducere cellulær ROS stress og efterfølgende mitokondriel sammenbrud, hvilket giver en potentiel forklaring på kaskaden udløser

in vitro

anticancer effekter, herunder apoptose. Dernæst vurderede vi

in vivo

aktiviteten af ​​FBA-TPQ i OVCAR-3 æggestokkræft xenograft model, og viste, at FBA-TPQ igen kan udøve potent tumordræbende aktivitet, med op til 69,4% af tumorvækst inhibering ved 10 mg /kg dosis. Vi systematisk (begge

in vitro

in vivo

) evalueret sin underliggende mekanisme (r) af handlinger, og vores

in vivo

undersøgelser bekræftede, at FBA-TPQ udøver sin potente antitumorvirkninger hovedsageligt ved at påvirke celleproliferation, inducere celle apoptose og cellecyklusstandsning.

spaltningen af ​​PARP og procaspase-3 er de veldokumenterede indikatorer for apoptose [18], [19]. Medlemmer af Bcl-2-familien, såsom Bcl-2 og Bax, er kendte kritiske regulatorer ansvarlige for celleoverlevelse /apoptose [20] – [22]. Vi har påvist en dosisafhængig spaltning af PARP og procaspase-3, såvel som en dosis-afhængigt fald i Bcl-2 /Bax-forhold i FBA-TPQ-behandlede celler og tumorer, som godtgør, at FBA-TPQ inducerer apoptose. Baseret på vores tidligere data, der viser, at FBA-TPQ kan virke som en DNA-ødelæggende middel, vi evalueret ROS niveauet i OVCAR-3 celler efter FBA-TPQ inkubation som oxidation (sammen med methylering, depurinering og deaminering) forårsaget af ROS stress kan bidrage til DNA-beskadigelse [23]. Faktisk observerede vi en dosisafhængig stigning i cellulær ROS niveau, samt en dosisafhængig bortledning af det mitokondrielle membranpotentiale. Da tabet af mitochondriemembranpotential betragtes som en tidlig begivenhed i apoptose [18], [24], kan vi konkludere, at FBA-TPQ udløser den observerede apoptose i OVCAR-3 celler ved at inducere et forhøjet niveau af cellulær ROS, hvilket fører til efterfølgende mitokondriemembranen kollaps [23], [24].

celler udnytte cellecykluskontrolpunkter at sikre korrekt cellecyklus udførelse for at beskytte delende celler fra potentielt dødelige DNA skader [25], [26]. Celler kan standset i G2 /M-fasen for at blive underkastet DNA-reparation eller apoptotisk celledød [26], [27]. For yderligere at undersøge virkningerne af FBA-TPQ om standsning af cellecyklus som følge af dets induktion af DNA-skader, vi evaluerede sin modulering af ekspressionen af ​​vigtige proteiner involveret i G2 /M-signalering og observeret en dosisafhængig reduktion i ekspressionen af Cdc25C og CDK1 /cyclin B1, hvis aktivering er nøglen til G2 /M progression [26], [28], [29]. Dette bekræfter, at FBA-TPQ fremmer G2 /M anholdelsen af ​​OVCAR-3 celler efter ROS-induceret skade.

Aktivering af p53 er en væsentlig virkningsmekanisme for mange DNA-ødelæggende stoffer [6]. Vi observerede en dosisafhængig stigning i mutant-p53-ekspression i OVCAR-3 celler, der er i overensstemmelse med vores tidligere rapport, at celler reagerer på FBA-TPQ skade uanset deres p53 status [6]. Vi har også observeret nedregulering af MDM2 og et ledsagende fald i E2F1, og forøget ekspression af Rb, p21 og p27 [30], [31], hvilket indikerer, at aktivering af p53-MDM2 tilbagekoblingssløjfe sandsynligvis ansvarlig for FBA- TPQ behandlings-induceret stigning i apoptose og cellecyklusstandsning og faldet i cellevækst og proliferation i A2780 og OVCAR-3 celler. Den Akt signalvejen spiller kritiske roller i regulering celle overlevelse [32], [33]. Aktiveringen af ​​Akt af PI3K (phosphoinositid-3-OH-kinase) kinase kan regulere transkriptionelle faktorer, der er ansvarlige for pro- og anti-apoptotiske proteiner, såvel som vækstfaktorer for overlevelse som respons på ekstracellulære stimuli eller skader [32]. Phosphoryleret Akt (p-Akt) rapporteres at være i stand til at hindre p53-afhængig apoptose og vækstsuppression ved phosphorylering MDM2 [34]. Vores data viste en dosisafhængig reduktion i p-Akt (og t-Akt) og dens opstrøms aktivator PI3K (katalytisk subunit) og en stigning i Fas (dødsreceptor), hvilket antyder, at FBA-TPQ stimulus -suppresses PI3K-Akt (p-Akt) pathway og phosphorylerer MDM2 at regulere ekspressionen af ​​vækstfaktorer (E2F1, Rb, p21 og p27, etc.) eller apoptotiske (PARP, Bcl-2, Bax og caspase-3, etc.) og cellecyklus relaterede (Cdc25C, CDK1 og cyclin B1 osv) proteiner, hvilket resulterer i stoffets vedvarende anti-cancer effekter

i betragtning af den høje dødelighed af kræft i æggestokkene [1] – [4]., er det nødvendigt at undersøge nye agenter, der kan virke via nye virkningsmekanismer til forbedring af kræft i æggestokkene terapi. Den foreliggende undersøgelse viser, at den mest effektive makaluvamine analog, FBA-TPQ, kan være en hidtil ukendt og lovende anti-æggestokkræft middel, idet den kan fortrinsvis og kraftigt inhiberer ovariecancer OVCAR-3 celler (men ikke ikke-tumorigene OSE celle) vækst. Ifølge vores

in vitro

in vivo

data, mener vi, at FBA-TPQ kan hæmme ovariecancer vækst ved at udløse Fas-relateret /ROS-associeret, og PI3K-Akt medieret /p53-MDM2-relateret stigning i cellulær apoptose og cellecyklusstandsning og faldet i celleproliferation (fig. 5). Disse resultater blev bekræftet på proteinniveauet i

in vitro

in vivo

, og var i overensstemmelse med vores microarray data analyse (se tekst S1, fig. S1, tabel S1, S2, S3 ), at FBA-TPQ udøver sin aktivitet primært gennem sin induktion af ROS og DNA-skader, regulering af ‘vej i kræft’, ‘p53 signalvej “og” phosphatidylinositol signalsystem «(f.eks PI3K-Akt), samt sin negativt regulering af CDK (f.eks CDK1 og den tilhørende Cdc25C og CyclinB1).

som konklusion, vores undersøgelse viste, at FBA-TPQ kan udøve potente cytotoksicitet og celleproliferation hæmning effekter i retning af A2780 og OVCAR-3 celler. Undtagen for induktion af apoptose, kan det også inducere cellecyklusstandsning og inhiberer OVCAR-3 xenotransplantattumorer vækst gennem ROS /dødsfald receptor-initieret, og PI3K-Akt medieret /p53-MDM2-relateret celleproliferation og apoptose og cellecyklus progression-associerede pathways (illustreret i fig. 5). Den præcise virkningsmekanisme (r) af forbindelsen, og om den udøver samme virkning i andre tumorer typer er endnu ikke godt belyst. I fremtiden nærværende undersøgelse, sammen med vores tidligere rapporteret fund [6], vil helt sikkert forbedre vores forståelse om virkningsmekanismer af makaluvamine analog og vil også danne grundlag for deres fremtidige kliniske udvikling af FBA-TPQ som en ny anti -cancer agent.

Materialer og metoder

Forbindelser og reagenser

Alle kemikalier var alle af analytisk kvalitet. FBA-TPQ var en slags gave fra professor Sadanandan Velu (UAB, Birmingham, AL, USA). Propidiumiodid (P4170) blev købt fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA). Den JC-1 farvestof (5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid) (T-3186), TRIZOL reagens og CM-H

2DCFDA [5- (og-6) -chlormethyl-2 ‘, 7’dichlorodihydrofluorescein diacetat acetyl ester] (C6827) blev købt fra Invitrogen-Molecular Probes Co. (By, stat, USA). Den CellTiter 96® AQ

ueous One Solution (G3580) Cell Proliferation Assay (MTS assay) kit blev købt fra Promega Co., Ltd. (Madison, WI). DC proteinassaykit (500-0113) blev opnået fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA), og ECL plus systemet blev indkøbt fra Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Alle cellekultur forsyninger blev opnået fra Invitrogen-Gibco Co. (By, stat, USA). Anti-humant MDM2-antistof blev opnået fra Calbiochem® af EMD Chemicals Inc. (Darmstadt, Tyskland) blev Caspase-3 (8G10) antistof købt hos Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA), og den anti -human β-actin (AC-74) antistof blev opnået fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). Anti-human p53 (SC-98), Fas (SC-8009), PI3K110a (SC-7189), PI3K85a (SC-423), AKT (SC-8312), p-AKT (SC-7985-R), PARP (H-250, SC-7150), Bax (SC-493), Bcl-2 (SC-509), Rb (SC-50), p21 (SC-817), p27 (SC-528), E2F1 (SC -193), CDK1 (SC-8395), cyclin B1 (SC-595), og Cdc25C (SC-13138) antistoffer, sammen med alle sekundære antistoffer (anti-muse, anti-ged og anti-kanin immunoglobulin G) blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, Californien, USA).

cellelinjer og Cell Culture

menneskelig ovariekarcinom A2780 og OVCAR-3 celler og den menneskelige æggestokkene IOSE144 (udødeliggjort ikke- tumorigene æggestokkene Surface Epitelceller), der oprindeligt blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) var gaver fra Dr. Jing Fang (Institut for Nutritional Sciences, Shanghai, Kina). Alle celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin ifølge ATCC anvisninger. FBA-TPQ blev opløst i DMSO og derefter fortyndet i celledyrkningsmedier ( 0,1%, endelig inkubering koncentration).

Cell Levedygtighed Assay

Cell vækst og levedygtighed blev bestemt ved MTS-assay under anvendelse den CellTiter 96® AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (G3580, Promega). Kort fortalt, 4 × 10

3 celler (per brønd) blev podet i plader med 96 brønde og blev enten behandlet i 48 timer med FBA-TPQ (opløst i DMSO 0,1%, slutkoncentration) ved serielle koncentrationer (0 , 100, 500, 750, 1000, 1500 og 2500 nM) eller blev behandlet i forskellige tidsrum (0, 24, 48 og 72 timer) med FBA-TPQ i koncentrationer på 0, 500, 750 og 1000 nM. Efter 24~72 hrs behandling blev 20 pi MTS-opløsning tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i yderligere 2~4 timer ved 37 ° C, hvorefter absorbansen ved 490 nm blev registreret ved anvendelse af et SpectraMax

190 mikropladelæser (Molecular Devices, USA) til beregning af celle overlevelse procenter.

Påvisning af apoptose

Cell apoptose blev påvist via en Annexin V-FITC-kit indkøbt fra BioVision, Inc [6], [17]. Kort fortalt, 1 x 10

6-celler blev podet i 6 cm skåle og behandlet med testforbindelsen (FBA-TPQ) ved 0,5, 1,5 og 2,5 uM i 24 timer inden analyse. De flydende og trypsinerede adhærente celler blev opsamlet og forberedt til detektion i overensstemmelse med producentens anvisninger. Prøver blev analyseret med et FACSAria ™ flowcytometer (Becton Dickinson, USA) efter inkubation i mørke ved stuetemperatur i 5 min. Celler positive for tidlig apoptose (Annexin V-FITC kun farvede, se Q

4 i figur 2A) og for sen apoptose (Annexin V-FITC og PI farvede, se Q

2 i figur 2A) blev kombineret.

Cell Cycle Analysis

propidiumiodid (PI) farvning blev udført for at bestemme virkningerne af FBA-TPQ på cellecyklussen [6]. Kort fortalt 6 × 10

5-celler, der blev podet i 6 cm skåle blev udsat for FBA-TPQ (ved 0, 0,5, 1,5 og 2,5 pM) og inkuberet i 12 timer inden analyse. Celler blev trypsinbehandlet, vasket med PBS og fikseret i 1 ml 70% ethanol (700 pi 100% ethanol tilsat til 300 pi PBS) ved 4 ° C natten over, efterfulgt af centrifugering (3000 rpm, 5 min), inkubering med RNase (100 ug /ml) og farvning med propidiumiodid (50 ug /ml) i 15 minutter i mørke. DNA-indhold blev analyseret ved en Cell Lab Quanta ™ SC flowcytometer (Beckman Coulter, USA).

Måling af reaktive oxygenarter (ROS)

Produktionen af ​​ROS blev målt ved anvendelse af 5- (og-6) -chlormethyl-2 ‘, 7’dichlorodihydrofluorescein diacetat acetyl ester (CM-H2DCFDA). Kort beskrevet Celler (ca. 7 x 10

5) blev podet i 6 cm-skåle og eksponeret for FBA-TPQ i 4 timer ved serielle koncentrationer (0, 1,0, 2,0 og 3,0 uM), hvorefter cellerne blev høstet og vasket med PBS gang, derefter inkuberet med 5 uM CM-H2DCFDA (i DMSO) i 30 minutter ved 37 ° C i phenol-rød-frit RPMI 1640 medium.