PLoS ONE: Bacillus Calmette Guerin inducerer fibroblast Aktivering både direkte og gennem makrofager i en mus blærekræft Model

Abstrakt

Baggrund

Bacillus Calmette-Guerin (BCG) er den mest effektive behandling for non-muskel invasiv blærekræft. Imidlertid har en fejl i den indledende respons eller tilbagefald inden for de første fem års behandling blevet observeret i 20% af patienterne. Vi har tidligere bemærket, at

in vivo

indgivelse af en inhibitor af nitrogenoxid forbedret reaktion på BCG af blæren tumorbærende mus. Det blev beskrevet, at denne virkning skyldes en udskiftning af tumorvæv ved kollagen depoter. Formålet med det foreliggende arbejde var at klarlægge den mekanisme involveret i denne proces.

Metode /vigtigste resultater

Vi viste, at BCG inducerer NIH-3T3 fibroblast proliferation ved at aktivere MAPK og PI3K signalveje og også differentiering bestemmes ved a-glat muskel-actin (a-SMA) ekspression.

In vivo

, intratumoral podning af BCG også øget alpha-SMA og kollagen-ekspression. Oral indgivelse af L-NAME forøgede pro-fibrotisk effekt af BCG. Peritoneale makrofager opnået fra MB49 tumorbærende mus behandlet

in vivo

med kombineret behandling af BCG med L-NAME også forbedret fibroblastproliferation. Vi observerede, at FGF-2 er en af ​​de faktorer frigivet af BCG-aktiverede makrofager, der kan fremkalde fibroblast proliferation. Inddragelsen af ​​FGF-2 blev påvist under anvendelse af et anti-FGF2-antistof. Samtidig, forbedret denne makrofag population sårheling sats i normale mus og FGF-2 ekspression blev også øget i disse sår.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater tyder på, at fibroblaster er målrettet ved BCG både direkte og gennem aktiverede makrofager i en immunterapi forbindelse med en blære musemodel. Vi har også beskrevet, for første gang, at FGF-2 er involveret i en dialog mellem fibroblaster og makrofager fremkaldt efter BCG-behandling. Det faktum, at L-NAME administration forbedrer BCG effekt på fibroblaster, ingen hæmning, kan repræsentere en ny tilgang for at tilføje til den konventionelle BCG terapi

Henvisning:. Lodillinsky C, Langle Y, Guionet A, Góngora A, Baldi A, Sandes EO, et al. (2010) Bacillus Calmette Guerin inducerer fibroblast Aktivering både direkte og gennem makrofager i en mus blærekræft Model. PLoS ONE 5 (10): e13571. doi: 10,1371 /journal.pone.0013571

Redaktør: Ludovic Tailleux, Institut Pasteur, Frankrig

Modtaget: May 5, 2010; Accepteret: 4 oktober 2010; Udgivet: 22 oktober 2010

Copyright: © 2010 Lodillinsky et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CL, YL, AB, AME), og tilskud fra Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas-PIP, og Universidad de Buenos Aires -UBACYT M017 (www.conicet.gov.ar . www.uba.ar). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på tidspunktet for diagnosen, 60-80% af blæretumorer er ikke-muskel invasive og begrænset til i urinvejene og /eller lamina propria. Disse omfatter papillære tumorer eller carcinoma in situ. Begge typer tumorer almindeligvis opstå samtidig. I 1976 Morales et al. [1] rapporterede, for første gang, den vellykkede intravesikal anvendelse af

Bacillus Calmette Guerin (BCG)

som adjuvans behandling af ikke-muskel invasiv blærekræft efter transuretral resektion. Det er nu almindeligt accepteret, at intravesikal BCG er mere potent terapi i at forhindre tumor tilbagefald end nogen intravesikal kemoterapi [2]. Men omkring 20% ​​af patienterne enten ikke reagerer indledningsvist eller tilbagefald inden for de første fem års behandling [3].

Det er kendt, at BCG genererer et lokalt immunologisk reaktion med aktivering af immunceller samt sekretion af cytokiner involverer Th1-celle cytotoksicitet [4]. Der er konstateret en betydelig stigning i polymorfkernede og mononukleære celle, der infiltrerer i blæretumorer efter BCG-behandling [5]. Da makrofager (MLA) er fagocytiske og antigen-præsenterende celler og har kapacitet til at udskille cytokiner og vækstfaktorer, de anses for de bedst udstyrede celler involveret i BCG immunterapi. Afhængigt mikromiljøet, arten og intensiteten hvor MLA differentiering finder sted, er disse celler i stand til at aktivere forskellige veje og giver anledning til særlige profiler [6]. Svarene fra MLA efter skade eller infektion er eksempler på mange forskellige stimuli, der udløser MLA aktivering i væv, viser stor plasticitet. BCG, når det anvendes som immunterapi for blæretumorer, behandles af MLA og urothelial celler, hvilket resulterer i en hurtig løsladelse af inflammatoriske cytokiner, hvoraf nogle kan være ansvarlig for visse bivirkninger observeret hos patienter [7], [8]. En af mediatorer af denne inflammatoriske proces er nitrogenoxid (NO), genereres af en familie af NO syntaser (Noss). Inflammatoriske cytokiner og /eller bakterielle produkter aktiverer sædvanligvis ekspressionen af ​​den inducerbare NOS (iNOS) isoform, genererer store mængder af NO. iNOS udtrykkes ikke i normal blære epitel men er blevet påvist i tidlig blære tumor tilbagefald [9], og det er blevet rapporteret, at iNOS-ekspression i tumorceller kan være forbundet med manglende respons til BCG [10]. Vi har tidligere rapporteret, at in vivo administrering af BCG til MB49 tumorbærende mus faldt tumorvækst og at den kombinerede behandling af BCG med NOS-inhibitoren L-NAME signifikant forbedret tumorregression ved at erstatte tumorvæv ved kollagen depoter, der ligner sårheling [11] . Vores nuværende resultater tyder på, at kontrollen over blære tumor tilbagefald ved BCG terapi involverer stroma reorganisering og at ingen hæmning kan forbedre væv remodellering. Sårheling er et eksempel på væv reorganisering, da efter viklet generation, vækstfaktorer frigivet til den ekstracellulære matrix inducerer en inflammatorisk proces, der tillader cellemigrering [12]. Blandt andet, MLA og fibroblast er vigtige celler involveret i denne proces. Fibroblast migrere til den beskadigede zone, differentiere til myofibroblasts og syntetisere ekstracellulære matrixproteiner, der tillader sammentrækning og endelig såret tæt. I en sårhelende kontekst, vækstfaktorer, såsom en fibloblast vækstfaktor-2 (FGF-2) og transformerende vækstfaktor beta (TGF-beta) udskilt af MLA, stimulere fibroblaster, som er ansvarlige for syntesen, aflejring og remodellering af den ekstracellulære matrix [13]. FGF-2 blev oprindeligt identificeret som en grundlæggende vækstfaktor, som stimulerer proliferation af NIH-3T3-fibroblaster. Desuden har flere undersøgelser vist en rolle af FGF-2 i væv fibrose, hvor denne faktor er forøget i akutte sår og spiller en rolle i dannelsen af ​​granulationsvæv, reepithelization og vævsremodellering [12], [14].

til vores viden, er der ingen information om den rolle i væv remodellering af BCG, når de anvendes i blærekræft behandling. Derfor er formålet med vores arbejde var at vurdere effekten af ​​BCG på fibroblast aktivering, målt ved MAPK og PI3K signalveje og kollagen I, og alpha glatmuskelactin (a-SMA) ekspression. Da MLA er involveret i både BCG respons og i væv reorganisering som observeret i processen med sårheling [6], [15] vurderede vi også den rolle MLA under BCG behandling og ingen inhibering terapi, fibroblast-aktivering i en sårhelende model . Vores resultater tyder på, at som en del af mekanismerne i blærekræft kontrol, BCG inducerer aktivering af fibroblaster, enten direkte eller gennem MLA, at ved at frigive opløselige produkter, kan selv aktivere fibroblaster. Deltagelsen af ​​NO som en negativ regulator af denne proces blev også demonstreret.

Resultater

BCG inducerer NIH-3T3 proliferation

Det er blevet beskrevet, at BCG kan fremkalde cellecyklusstop og apoptose i blæren tumorcellelinjer [15], [16]. Dog kunne man resterende spørgsmål være, hvad ville være effekten af ​​BCG på fibroblaster? For at besvare dette spørgsmål NIH-3T3-celler blev dyrket under forskellige koncentrationer af BCG. Som vist i fig. 1A og 1B, BCG inducerede proliferation af NIH-3T3-celler, evalueret både ved at tælle antallet af celler og ved MTS-assayet. Induktion af fibroblast proliferation blev påvist med BCG-koncentrationer fra 1,5 × 10

6 CFU /ml op til 3 × 10

6 CFU /ml, faldende til højere koncentrationer end 6 × 10

6 CFU /ml. Vores resultater viser afvigelser, når bestemmelsen af ​​proliferation blev fremstillet enten ved at tælle antallet af celler eller ved MTS (figur 1 A og B henholdsvis) for koncentrationer på eller større end 6 × 10

6 CFU /ml. Vi mener, at denne forskel var relateret til forbedre af mitokondrie-aktivitet induceret af høje mængder af BCG. Således blev de følgende eksperimenter udført med 3 × 10

6 CFU /ml BCG, hvor der er enighed mellem de to former for kvantificering. At vurdere, om PI3K og MAPK veje er involveret i BCG-induceret fibroblast proliferation, analyserede vi virkningerne af LY 294002 og PD 98059, inhibitorer af PI3K og MAPK pathways henholdsvis den fibroblastproliferation induceret af BCG. Vi evaluerede også phosphorylering af ERK og AKT, to aktiverede molekyler, som er centrale i disse veje. Vi observerede, at LY (20 uM) var i stand til at inhibere proliferationen induceret af BCG efter 24 timer af behandlingen (fig. 1C), og at PD (50 uM) inhiberede proliferationen induceret af BCG efter 48 timers behandling (fig. 1D ). Som vist i fig. 1E og 1F, BCG behandling inducerede en hurtig phosphorylering af ERK og AKT inden for 5 min. Western blot-analyser afslørede, at phosphorylering af AKT blev stimuleret mellem 5-10 min, faldende efter 20 min (fig. 1E). BCG fremkaldte også ERK1 og ERK2-phosphorylering efter 5 min, som derefter formindsket efter 30 minutter (fig. 1F). Denne interaktion mellem BCG og fibroblast involverer både en spredning og en overlevelse vej. Disse data antyder, at BCG-mål ikke kun tumorceller og MLA, men også fibroblaster.

(A) NIH-3T3 fibroblast blev behandlet med forskellige koncentrationer af BCG i 24 timer. Celler blev talt eller (B) cellelevedygtigheden blev vurderet ved en ikke-radioaktiv celle titter metode (MTS), vs kontrol: p 0,05. (C) Effekt af LY 294002 og (D) PD 98059 evalueret af MTS i fibroblast stimuleret med BCG (3 × 10

6 CFU /ml) i 24 og 48 timer henholdsvis a: p 0,05 vs kontrol, b: vs BCG. Fibroblast stimuleret med BCG (3 × 10

6 CFU /ml) og p-AKT (E) og p-ERK (F) bestemt ved Western blot. Relative phosphoryleringsniveauerne blev normaliseret til totalt protein og nævnt som en fold ændring af kontrollen, en: s. 0,05

Spredning af NHI-3T3-celler blev forstærket af L-NAME på 0,5 til 4 mM (p 0,05) på en koncentrationsafhængig uafhængig måde (data ikke vist). Når fibroblaster blev behandlet med en kombineret protokol blev den højeste proliferation aktivitet detekteret med BCG 3 × 10

6 CFU /ml plus L-NAME 2 mM (figur 2). Denne virkning blev inhiberet af LY 294002 og PD 98059, hvilket viser, at L-NAME er i stand til at forbedre BCG-induceret proliferation i NIH-3T3-celler medieret af MAPK og PI3K signalveje.

NIH-3T3 fibroblast blev behandlet med BCG (3 × 10

6 CFU /ml), L-NAME (2 mM) eller BCG og L-NAME i nærvær af LY 294002 og PD 98059 i 24 og 48 timer hhv. Cellelevedygtighed blev evalueret ved MTS. a: p 0,01 vs kontrol; b: p 0,05 vs BCG eller L-NAME alene; c: p. 0,01 vs deres respektive Kontrol

BCG inducerer NIH-3T3 differentiering

Aktivering af fibroblaster i myofibroblaster, et afgørende skridt i processen med sårheling, er karakteriseret ved udviklingen af ​​intracytoplasmatiske stress fibre, der bibringer til disse celler kapaciteten for at udvikle spændinger, samt af den øgede syntese af ekstracellulære matrixbestanddele, såsom collagen type i [17], [18]. Den vigtigste markør af fibroblast /myofibroblastdifferentiering fænotypiske overgang er novo expresion af alfa-glatmuskelactin [19]. Så vi analyserede alpha-SMA og kollagen I som indikatorer for fibrogene aktivitet og evalueret udtryk for disse molekyler i NIH-3T3-celler behandlet med BCG.

For at fastlægge den bedste dosis af BCG, immunfluorescens af begge proteiner var udført i fibroblaster behandlet med forskellige koncentrationer af BCG i 24 timer (data ikke vist). Den stærkeste ekspression af både a-SMA og kollagen I blev observeret med 3 × 10

6 CFU /ml BCG (fig. 3A), således blev denne koncentration valgt til at udføre Western blots analyser. Figur 3B viser, at 3 × 10

6 CFU /ml BCG var i stand til at inducere kollagen I-ekspression efter 6 timers behandling, idet ekspressionen 2,5 gange højere end kontroller efter 12 timers behandling. En væsentlig induktion af alpha-SMA efter 12 timer af BCG-behandling blev observeret, forbliver forøget ved 48 timer efter behandling. Tilsammen data viste indtil nu, kunne vi hypotesen, at fibroblast aktivering kan også finde sted in vivo.

(A) Immunofluoresce farvning af NIH-3T3 behandlet med BCG (3 × 10

6 CFU /ml) i 24 timer afsløret med anti-kollagen i og anti-a-SMA-antistof. Skala: bar = 100 um. (B) Western blot fra fibroblast homogenater behandlet med BCG (3 × 10

6 CFU /ml) på forskellige tidspunkter for at determinate kollagen I og alfa-SMA induktion. (C) Densitometriske enheder af collagen I eller (D) a-SMA blev bestemt ved anvendelse analysesoftware, relativeres til beta-actin og nævnt som en fold change of control a: p 0,05, b: p. 0,01

BCG inducerer fibroblast aktivering via makrofager

in vitro

og inducerer kollagen og alpha-SMA-ekspression i MB49 tumorer

in vivo

Som den direkte behandling med BCG inducerer fibroblast proliferation og MLA er nogle af de vigtigste celler i BCG-responser, vi den hypotese, at der er en dialog mellem fibroblaster og MLA under BCG behandling. For at teste dette, undersøgte vi, om MLA behandlet med BCG kan påvirke proliferation og differentiering af fibroblaster. Først, vi vurderet NO produktionen i MLA behandlet med BCG. Som vist i fig. 4A, peritoneale MLA fra tumorbærende mus behandlet in vivo med BCG producerede højere mængder af NO end dem fra ikke-behandlede dem. In vitro behandling af MLA cellelinje RAW 264.7 med BCG også øget NO-produktion. At vurdere betydningen af ​​de opløselige produkter, der frigives fra MLA, opnåede vi det konditionerede medier (CM) fra peritoneale MLA fra tumorbærende mus enten behandlet in vivo eller ej med BCG +/- L-NAME. Vi observerede, at CM fra peritoneale MLA fra tumorbærende mus (MLA-T) af forskellige grupper inducerede fibroblastproliferation. Især CM af MLA fra tumorbærende mus behandlet in vivo med BCG (MLA-T-BCG) plus L-NAME inducerede den højeste fibroblaster proliferationshastighed in vitro. CM fra ubehandlet RAW 264,7 ændrede ikke fibroblast proliferation. Men in vitro behandling af RAW 264,7 med BCG enten kombineret eller ikke med L-NAME, på samme måde som peritoneale MLA, også induceret NIH-3T3 proliferation (fig. 4B).

(A) NO produktion blev bestemt i supernatanterne fra begge peritoneale MLA fra MB49 tumorbærende mus (MLA-T) og RAW 264.7 celler behandlet in vivo med BCG (6 × 10

6 CFU /ml) eller in vitro (3 × 10

6 CFU ml) henholdsvis /, blev evalueret i supernatanten ved Griess reagens. a: p 0,0001 vs kontrol. RAW 264.7-celler blev behandlet med BCG (3 × 10

6 CFU /ml) i 24 timer og derefter celler blev vasket grundigt med PBS. Serumfrit medium blev tilsat, og inkubationen blev fortsat i 24 timer til opnåelse af CM. (B) fibroblast behandlet i 48 timer med CM fra peritoneale eller RAW 264.7 celler tidligere er behandlet med BCG (3 × 10

6 CFU /ml) plus L-NAME (2 mM). Fibroblast levedygtighed blev bedømt ved MTS og henvist som en procentdel af kontrol (RAW 264.7 eller NIH-3T3 ubehandlet cellelinjer), a: p 0,05 og b: p 0,01 vs kontrol, c: p 0,05 vs MLA-T kontrol. (C) Western blot for at bestemme kollagen I og alpha-SMA fra fibroblast homogenater blev behandlet i 24 timer med CM fra RAW 264,7 tidligere behandlede i 24 timer med BCG plus L-NAME. Relativ udtryk niveau blev normaliseret til beta-actin og nævnt som en fold ændring af kontrollen, a: p 0,05, b: p 0,01. (D) Masson trichome (øverste panel) og immunhistokemisk farvning (nederste panel), at bestemme kollagenfibre og alpha-SMA henholdsvis blev udført i MB49 tumorer vokser subkutant i mus behandlet med BCG, L-NAME eller BCG + L-NAME. Hvide pile viser blåsplint af kollagen fibre. Gule pile viser brun positiv farvning for a-SMA. Scale:. Bar = 100 um

CM fås fra RAW 264,7 induceret collagen I udtryk i fibroblaster. Udtrykket var højere, når CM var fra MLA behandlet med BCG, og denne virkning blev fortsat høj under L-NAME tilføjelse. CM opnået fra RAW 264.7 behandlet med BCG plus L-NAME også induceret a-SMA-ekspression (fig. 4C). Disse resultater tyder på, at der er nogle opløselige faktorer secerneret fra MLA aktiveres af BCG, som kan inducere fibroblastproliferation og aktivering. Med det formål at evaluere denne effekt in vivo analyserede vi collagenaflejring og alpha-SMA-ekspression i MB49 tumorbærende mus under BCG og L-NAME-behandling. Vores resultater viste, at både BCG og L-NAME og deres kombination inducerede aflejring af kollagen fibre i disse tumorer. BCG og L-NAME-induceret også ekspression af a-SMA sammenlignet med kontrolgruppen. Imidlertid blev mere intens farvning af a-SMA observeret i tumorer behandlet med BCG plus L-NAME. Disse resultater antyder, at BCG kan inducere aktiveringen af ​​fibroblaster in vivo, og at denne virkning forøges ved inhibering af NO-produktion.

Nitrogenoxid inhibering forbedrer

in vivo

sårheling induceret af peritoneale MLA fra tumor-bærende mus behandlet med BCG

for at bestemme den funktionelle kapacitet af MLA under BCG behandling og regulering af NO, blev et in vivo eksperiment af sårheling udført. Peritoneale MLA-T enten behandlet eller ikke med BCG in vivo blev anbragt i en dorsal hudsår af normale mus. Den INGEN hæmmere L-NAME og 1400W blev tilføjet i sår enten alene eller kombineret med MLA. Overfladen sår blev signifikant formindsket, når MLA fra normale (data ikke vist) eller MAC-T blev tilsat på såret i sammenligning med kontrollerne, hvor kun PBS-glycerol-opløsning blev tilsat. Det er vigtigt at bemærke, at tilsætningen af ​​NO inhibitorer L-NAME eller 1400W alene var i stand til signifikant formindske overfladen såret. Når peritoneale MLA fra tumorbærende mus, der havde modtaget BCG intratumoralt (MLA-T-BCG) blev tilsat på såret, blev procentdelen af ​​sårlukning formindsket, sammenlignet med de sår med MLA-T. Men når disse MLA-T-BCG blev sat med 1400 W, den sårheling var signifikant forøget (fig. 5A).

(A) Peritoneale MLA fra tumorbærende mus enten behandlet eller ikke med BCG ( MLA-T-BCG og MLA-T henholdsvis), blev anbragt i dorsal hudsår af normale mus. L-NAME (2 mM) eller 1400 W (1 uM) blev tilsat på såret. Sårlukningen blev beregnet som procentdelen af ​​det oprindelige sårområde (dag nul), a: p 0,01, b: p 0,001 vs PBS-gli, c: p 0,05 vs MLA-T-BCG kontrol. (B) Peritoneal MLA-T-BCG blev anbragt i dorsal hudsår af mus behandlet oralt med L-NAME (0,2 g /kg mus), a: p 0,0001 vs PBS-gli, b: p 0,01 vs MAC-T -BCG kontrol.

Når den dorsale hudsår blev genereret i mus drikke NO inhibitoren L-NAME, blev overfladen såret indskrænket i forhold til kontrolgruppen. MLA-T-BCG tilsætning inducerede også en fremskyndelse af sårheling. Desuden MLA-T-BCG tilsætning forbedret sårheling, når mus modtog L-NAME oralt (fig. 5B).

FGF-2 medierer den stimulerende virkning af BCG-aktiverede makrofager på fibroblaster

Det er blevet påvist, at FGF-2 er et af de vigtigste vækstfaktorer involveret i fibroblast proliferation [20]. Desuden er det blevet vist, at FGF-2 er i stand til at inhibere apoptose i NIH-3T3-celler behandlet med kemoterapi narkotika [21]. Vi har således en hypotese, at FGF-2 kan være et af de opløselige faktorer secerneret af aktiverede MLA stand til at stimulere proliferation af fibroblaster. For at bekræfte denne idé, vi først analyseret, om FGF-2 er moduleret i MLA RAW 264.7 celler under BCG behandling. 6A viser som Immunfluorescensfarvning, at FGF-2 er forøget i MLA RAW 264.7 behandlet med BCG sammenlignet med ubehandlede celler. Dette blev også observeret ved Western blot-assay (figur 6B), hvor det kan ses et bånd på 17,2 kDa bruges i sekretorisk FGF-2. Bånd med højere molekylvægt repræsenterer ikke-sekretorisk FGF-2. Vi udførte derefter en proliferationsassay med CM afledt fra RAW 264.7 aktiveres af BCG, forarmet eller ikke af FGF-2. CM fra RAW 264.7 behandlet med BCG forøget fibroblast proliferation, mens udtømningen af ​​FGF-2 signifikant reducerede fibroblast stimulering, hvilket antyder, at BCG-aktiverede MLA kunne inducere fibroblastproliferation, i det mindste delvist, ved FGF-2-sekretion. Fibroblaster migrerer ind i såret, hvor de prolifererer og producerer store mængder af ekstracellulær matrix. Nogle fibroblaster differentiante ind myofibroblaster, som er ansvarlige for såret sammentrækning og aflejring af yderligere matrix [22]. At undersøge om MLA fra tumorbærende mus behandlet med BCG er i stand til at inducere FGF-2 in vivo, ekspression af FGF-2 blev evalueret enten ved sårheling assays. Ved siden af, vi evalueret også FGF-2-ekspression i MB49 tumorer. Histologiske analyser fra hudsår viste øget ekspression af FGF-2 i sår med MLA-T-BCG. Når disse MLA blev anbragt sammen med NO inhibitorer på sår, FGF-2-ekspression forblev høj (fig. 6D). Det høje niveau af FGF-2 var i overensstemmelse med den forøgede helbredende kurs, der blev vist i fig. 5. Endvidere blev lignende resultater observeret i MB49 tumorer, hvor ekspressionen af ​​FGF-2 blev højere i tumorer fra mus behandlet med enten BCG eller med L-NAME end i kontroller. Tumorer afledt fra mus, der modtog den kombinerede behandling viste mere lokaliseret og intensiv FGF-2-farvning (fig. 6E). I denne model, vores resultater viser, at FGF-2 er forbundet med virkningsmekanismen BCG immunterapi.

(A) Immunfluorescensfarvning med anti-FGF-2-antistof af RAW 264.7 MAC behandlet med BCG (3 x 10

6 CFU /ml) i 24 timer. (B) Western blot fra lysater af RAW 264.7 behandlet med BCG (3 × 10

6 CFU /ml) i 8 og 24 timer. 20 ng af oprenset murint FGF-2 blev anvendt som en positiv kontrol. Relativ udtryk niveau blev normaliseret til GAPDH og nævnt som en fold ændring af kontrollen, a: p 0,05 (C) fibroblaster blev behandlet med CM fra RAW 264.7 celler tidligere er behandlet med BCG (3 × 10

6 CFU /ml), L-NAME eller BCG plus L-NAME i 24 timer. Kontrol blev udført med opbrugt dyrkningsmedier (CM 3T3, fra samme NIH-3T3-celler). 0,5 ng /ml af FGF-2 i CM 3T3 blev anvendt som en positiv kontrol. NIH-3T3 proliferation blev overvåget ved

3 (H) thymidin-inkorporering. CM blev præinkuberet 1 time med 10 ug /ml af det blokerende monoklonale anti FGF-2-antistof (DB3) eller normal IgG som en kontrol, a: p 0,001 vs CM NIH-3T3, b: p 0,001 vs IgG. (D) Immunohistokemisk farvning til determinate FGF-2-ekspression blev udført i hudsår. Sårene blev behandlet med peritoneale MLA fra tumorbærende mus behandlet eller ej med BCG (MAC-T og MAC-T-BCG respectivesly) alene eller lokalt kombineret med ingen inhibitorer (E). Immunhistokemisk farvning af FGF-2 blev udført i s.c. MB49 tumorer fra mus behandlet med BCG, L-NAME eller BCG plus L-NAME. Scale:.. Bar = 100 um

Diskussion

Intravesikal behandling med BCG spiller en stor rolle i behandlingen og profylakse af recidiverende non-muscle invasive blære karcinom [23]

Shelley et al. [24] har for nylig beskrevet i en meta-analyser undersøgelse, BCG anvendes som hjælpestof efter transuretral resektion reducerede risikoen for tilbagefald med 67% efter 12 måneder sammenlignet med transuretral resektion alene; men nogle bivirkninger såsom blærebetændelse, feber og hæmaturi, var forbundet med BCG administration. Den nøjagtige mekanisme af antitumoraktiviteten af ​​BCG er ikke helt forstået, men det fremgår, at BCG involverer både direkte virkninger på tumorceller [16] og indirekte virkninger medieret af immunceller [7].

Vi har tidligere rapporteret at BCG wass stand til at inducere vækstinhibering af MB49 blære tumorceller enten in vitro eller inokuleret vivo i syngene mus NO produceret af MB49 cancerceller behandlet med BCG inducerede MLA og splenocytter død, hvilket antyder en in vivo immunsuppressiv funktion af NO. Vores eksperimenter viste også en større hæmning af tumorvækst hos mus behandlet med BCG kombineret med L-NAME sammenlignet med BCG alene. I det første tilfælde blev få tilbageværende tumorceller helt omgivet af kollagen fibre [11].

I det nuværende arbejde, vi undersøge nogle af de mekanismer, som BCG og L-NAME generere arret vi beskrevet tidligere. MAPK og PI3K signalveje er blevet bredt undersøgt i forskellige modeller. Disse aktiveres af forskellige stimuli, såsom vækstfaktorer og cytokiner [25], [26]. Vores nuværende resultater viser, at BCG er i stand til direkte at inducere NIH-3T3 fibroblast proliferation gennem MAPK og PI3K signalveje, collagen-ekspression og fibroblast differentiation som bestemt ved alpha-SMA-ekspression. Desuden immunhistokemi af tumorer fra BCG behandlede mus viste forøget ekspression af kollagen fibre og alpha-SMA, tyder på, at fibroblast aktivering kan også finde sted.

Vi mener, at BCG kan handle på stroma omgivende tumorceller, der kan tilbage efter tumorresektion eller på en ny stigende tumor. Således ville den fælles aktivitet af fibroblast og immunceller aktiveret af BCG og direkte virkning på tumorceller mindske risikoen for tilbagefald. Koncentrationen af ​​BCG anvendt i hver instillation i patienter, er ca. 10

7 CFU /ml (samlet volumen 50 ml). Vi kender ikke den nøjagtige dosis, der modtager stroma, ikke desto mindre, i vores eksperimenter bruger vi 3 × 10

6 CFU /ml, som er den bedste dosis, der inducerer fibroblast proliferaton in vitro, bliver en lavere orden end den, der anvendes i instillation af patienten. Således har vi spekulere, at mængderne af BCG vi anvender in vitro er næsten fysiologiske.

Det er kendt, at bakterielle stimuli er i stand til at fremkalde NO produktionen i MLA [27]. Her viste vi, at efter BCG behandling, RAW 264.7 og MLA-T var i stand til at øge NO-niveauer in vitro og in vivo henholdsvis og CM fra RAW 264.7 behandlet in vitro med BCG induceret fibroblast proliferation og øget collagen I-ekspression. På grund af inddragelse af NO i forskellige aspekter af fysiologiske og patologiske processer, har NOS-inhibitorer fået fremtrædende i de involverede i sårheling, angiogenese og inflammatoriske respons på cytokiner [28], [29], [30] mekanismer. Da CM fra MLA-T-BCG-L-NAME inducerede den højeste fibroblast proliferationshastighed, kan vi spekulere, at i denne cellepopulation, inhibering af NO inducerer frigivelsen af ​​nogle opløselige faktorer, i stand til at øge fibroblast proliferation og aktivering. Desuden kan vi ikke skille, at ingen hæmning også kan modificere sekretion mønster af disse opløselige faktorer. Til vores viden, er der ingen rapporter, der viser samspillet mellem MAC og fibroblast i blærekræft. I konkordans med vores resultater, under anvendelse af en lungetuberkulose model, er det blevet beskrevet forøget proliferation af pulmonal fibroblast ved CM af alveolære makrofager stimuleret med BCG [31]. Samtidig observerede vi overensstemmelse mellem effekten af ​​in vivo-behandling af blære tumos og in vitro-analyse. En markant ekspression af kollagenfibre og alpha-SMA blev observeret i tumorer behandlet med BCG, L-NAME og BCG plus L-NAME, bliver effekten mere udtalt med den kombinerede behandling.

rolle NO i dermal fibroblast proliferation er tidligere blevet beskrevet af Chen et al [32], der foreslog at inhibering af dermal fibroblast proliferation med UV-lys, kan være relateret til den opregulering af iNOS-genekspression og dermed til NO over-sekretion i enige i disse resultater , kan vi foreslå, at NO-produktionen er en negativ regulator af fibroblast proliferation og aktivering, når BCG anvendes i blærekræft terapi.

tumorer og sår deler nogle komponenter, såsom den inflammatoriske sammenhæng [22]. Selv i sår inflammation er forbigående, i tumorer denne proces der fortsætter i tid, hvilket gør denne reversion, mål til bekæmpelse af tumorvækst. I 1986, Dvorak postuleres begrebet “tumorer er sår, som ikke heler”, og den hypotese, at sammensætningen af ​​tumorstroma ligner granulationsvævet helbredende hudsår, hvilket antyder, at epiteliale tumorer fremme dannelsen af ​​deres stroma ved at aktivere såret helbredende reaktion hos værten [22], [33]. Baseret på denne hypotese, genereret vi en dorsal hudsår assay til at evaluere rollen af ​​makrofager under forskellige behandlinger i en model, hvor fibroblaster har en nøglefunktion. Vi evaluerede kapaciteten af ​​MLA-T-BCG at hjælpe ved sårheling. Vi observerede, at eksogene MLA-T accelererede helingsprocessen, men tværtimod MLA-T-BCG faldt helbredende sats sammenlignet med MLA-T. Men i nærværelse af en NO-inhibitor, blev sårlukningen accelereret, hvilket antyder, at NO frigivet af MLA-T-BCG forsinker helingsprocessen. For at evaluere rollen af ​​endogent NO i værten, blev L-NAME oralt til sår-bærende mus, sårlukningen var signifikant hurtigere, når MLA-T-BCG blev anbragt i sårene. Sammenfattende tyder vore resultater, at ud over NO frigivet på såret ved MLA-T-BCG, andre celler, der producerer NO i sår-bærende mus spiller en negativ rolle i helingsprocessen. De oplysninger vedrørende NO aktivitet i sårheling er kontroversiel. Nogle forfattere har vist, at NO inducerer en angiogen proces nødvendig for en god heling [29], [34], mens andre har vist, at apoptose induceret af NO er ​​i stand til at inhibere sårheling [30]. På basis af vores resultater, kan vi spekulere, at NO genereret af MLA-T-BCG eller de tilbageværende kræftceller kan forsinke vævet reorganisering under BCG immunterapi.

Forskellige funktioner af vækstfaktorer, såsom FGF-2 eller TGF-beta, i sårheling og cancer er også blevet rapporteret.