PLoS ONE: Molekylær og in vivo karakterisering af Cancer-Plantemateriale celler fra MitCN-Dependent medulloblastom

Abstrakte

medulloblastom (MB) er den mest almindelige maligne pædiatrisk hjernesvulst. Mens veje, der er dereguleret i MB endnu ikke fuldt karakteriseret, amplifikation og /eller overekspression af

MitCN

gen, som er en kritisk rolle i cerebellare udvikling som en regulator af neural progenitorcelle skæbne, har været identificeret i flere MB undergrupper. Fænotypisk, er afvigende ekspression af MitCN forbundet med store-celle /anaplastisk MB variant, som tegner sig for 5-15% af tilfældene og er forbundet med aggressiv sygdom og dårlig klinisk resultat. For bedre at forstå den rolle MitCN i MB

in vitro

og

in vivo

at støtte udviklingen af ​​MitCN målrettede lægemidler, vi etablerede tumor-afledte neurosfære cellelinjer fra GTML (

Glt1-tTA /TRE-MitCN-Luc

) gensplejset musemodel. En fraktion af GTML neurosfærer viste sig at være vækstfaktor uafhængig, udtrykt CD133 (en markør for neurale stamceller) til kroppen til at differentiere ved MitCN tilbagetrækning og var stærkt tumorigene når orthotopisk implanteret i cerebellum. Principal komponent analyser ved hjælp af enkelt celle-RNA assay data antydede, at den kliniske kandidat aurora-A-hæmmer MLN8237 konverterer GTML neurosfærer at ligne ikke-MitCN ekspressorer. Korrelerer med dette, MLN8237 udvidet betydeligt overlevelsen af ​​mus med GTML MB allotransplantater. Sammenfattende vores resultater viser, at MitCN spiller en kritisk rolle i ekspansion og overlevelse af aggressive MB-formerings celler, og etablere GTML neurosfærer som en vigtig ressource for udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier

Henvisning:. Ahmad Z, Jasnos L, Gil V, Howell L, Hallsworth A, Petrie K, et al. (2015) Molekylær og

In Vivo

Karakterisering af Cancer-Plantemateriale celler fra MitCN-Dependent medulloblastom. PLoS ONE 10 (3): e0119834. doi: 10,1371 /journal.pone.0119834

Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: 11. juli, 2014 Accepteret: 16 januar 2015; Udgivet: 18 Marts 2015

Copyright: © 2015 Ahmad et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Institut for Cancer Research, American Institute for Cancer Research (11-0301), Cancer Research Storbritannien (C34648 /A12054 ), og Brain Tumor Charity (SDBTT 6/88). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hos børn, medulloblastom (MB) er den hyppigst forekommende primitive neuroectodermal tumor (PNET) med oprindelse i hjernen og er blevet klassificeret i fire store undertyper baseret på kopi nummer variation og transskription profiler: MB

WNT , MB

SHH (sonisk pindsvin), MB

Group3 og MB

Group4 [1,2]. På trods af de fremskridt i MB molekylær klassifikation, i de fleste pædiatriske MB (med undtagelse af afvigende SHH og Wnt veje) onkogene signalveje, der er terapeutisk målrettes mangler at blive identificeret. Nyere forskning har imidlertid vist, at MB huser MitCN forstærkning og /eller overekspression kan også målrettes [3]. Forstærkning af de

MitCN

genet er forbundet med en dårlig prognose [4,5], er observeret i MB

SHH, MB

Group3 og MB

GROUP4 undertyper [6-10] og udtrykkes afvigende i størstedelen af ​​humane MB [11]. På trods af den voksende betydning af MitCN som terapeutisk target i MB, men vi har stadig en dårlig forståelse af, hvordan afvigende

MitCN

udtryk forvandler neurale stamceller /stamceller af tumorer. Vi har tidligere rapporteret en gensplejset musemodel (GEMM) af MitCN-drevet MB (GTML:

G

LT1-tTA /

T

RE-

M

YCN-

L

uc

), hvor MitCN udtryk styres af doxycyklin (DOX) (Tet-off). Anvendelse af dette system viste vi, at målrettet ekspression af MitCN inducerer både klassisk og storcellet anaplastisk (LCA) patologi uafhængig af SHH [11]. Undergruppe klassifikation baseret på genekspressionsprofiler afledt af humane medulloblastom prøver i sammenligning med transgene mus foreslået, at GTML og GTML /Trp53

KI /KI-mus viste ekspression profiler karakteristisk for human MB

Group3 [3]. Neurosfære linjer, der er etableret fra GTML mus formere robust, udtrykker neuronale markører, og danne tumorer, når orthotopisk implanteret i hjernen på mus [12]. Disse resultater tyder på, at GTML neurosfære kulturer indeholder tumor-formerings celler, hvilket gør dette en potentielt nyttigt system, som transformative rolle MitCN i MB tilblivelse kunne belyses.

I denne sammenhæng har vi gennemført en række molekylær og cytologiske undersøgelser for at karakterisere neurosfære kulturer etableret fra GTML mus. Enkelt celle analyse afslørede en udvidelse af en homogen cellepopulation er afhængig MitCN udtryk for overlevelse. Disse sfæroider er resistente over for differentiering, og har karakteristiske for delvist begået neurale stam- og progenitorceller med MitCN ekspression, herunder opregulering af Nestin, CD133, Otx2, og Musashi, ekspression er forbundet med opretholdelse af en udifferentieret tilstand, og typiske af MB-stamme /stamfædre. Cerebellare implantation af GTML neurosfærer subpopulationer viste, at tumor formerings-potentiale boet i CD133 + men ikke CD15 + eller CD15- celler. Endvidere behandling af tumorer med MLN8237, en aurora-A kinase inhibitor, som inducerer MitCN oncoprotein nedbrydning [13], effektivt forlænget overlevelsesraten for GTML mus med aggressive MB. Disse resultater afklare rolle MitCN i cellulær transformation og progression af MB, styrkelse af hypotesen om, at MitCN driver udvidelse og berigelse af CD133 + tumor-formerings celler stand til at generere aggressiv MB.

Materialer og Metoder

mus dyrehold

GTML musemodel er blevet beskrevet tidligere [11]. Alle mus procedurer blev godkendt af Institute of Cancer Research Komité efter UK hjemmekontor retningslinjer (Project License Nummer: 70/7945). Alle operation blev udført under bedøvelse isoflurothane, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

neurosfæren isolation og kultur

Væv blev isoleret fra GTML tumorer eller postnatal P5, P8, P21 lillehjernen og midthjernen og overført til kold HBSS (Invitrogen). Vævene blev derefter skåret i 2-3 mm

2 stykker og enzymatisk dissocieret ved 37 ° C under anvendelse Liberase Blendzyme 1 (0,62 Wunsch enheder /ml, Roche) i PBS i 15-45 minutter. Enzymreaktionen standsedes ved anvendelse af 10% volumen kalvefosterserum (FCS, PAA) før cellerne blev findelt i DMEM /F12-medium indeholdende B27 og filtreret gennem en 70 pm mesh. Efterfølgende blev cellerne dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen) suppleret med 2% B27 supplement (Invitrogen), 20 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF, Sigma), 20 ng /ml fibroblastvækstfaktor (bFGF-basic, Invitrogen) og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin.

For at undersøge celledeling satser blev neurosfærer dissocieret ved pipettering, og celler farvet med trypanblå blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. Alternativt blev celler talt under anvendelse af Guava PCA-96 instrument efter farvning med Guava ViaCount Flex-reagens (1:50, Millipore) ifølge producentens protokol.

I vurderingen af ​​differentierende potentiale blev celler udpladet på dækglas overtrukket med poly-D-lysin (0,1 M, Sigma), 0,1% gelatine eller laminin (0,5 ug-2.0μg /ml, Invitrogen) og dyrket under differentieringstilstande i op til 14 dage. Differentiering medium består af DMEM /F12 medium suppleret med 10% FCS, B27 med eller uden 1 pg /ml retinsyre (Sigma-Aldrich). Vi belagte også frisk sorteret GTML cellerne i nærvær af 0.5-1.0mg /ml kollagen (Invitrogen, A1048301). I pro-differentiering Neurobasal medier med serum

ortotopisk implantation

For at undersøge den tumorigent potentiale, celler direkte fremstillet af primære tumorer, GTML kugler, eller deres derivater resuspenderedes i neurosfære medier og sprøjtes ind i lillehjernen af ​​FVB /N hunmus: følgende antal celler blev implanteret: primære tumorer (25 eller 100 celler /site ), M10519 celler (passager 10-27, 25 til 10.000 celler /websted) eller frisk sorteret celler (10 celler /site).

Mus alderen 6-8 uger blev bedøvet ved hjælp af inhalation af bedøvelsesmiddel isoflurothane. Et snit (1 cm

2) blev lavet i midterlinjen af ​​hovedbunden over lillehjernen, og et lille hul med en diameter på 1 mm blev lavet i kraniet ved en tandlægebor i en position 1 mm lateral fra midterlinien og mellem 1 og 2 mm posteriort for lambdoidal sutur undgå nogen tydelige blodkar. Celler blev injiceret i en dybde på 2 mm under anvendelse af en 10 pi Hamilton-sprøjte i en stereotaktisk ramme. Nålen blev efterladt på plads i yderligere 2 minutter for at undgå tilbagesvaling. Nålen blev fjernet forsigtigt ikke forskubbes tumorceller. Kraniet blev derefter forseglet under anvendelse af kirurgiske lim. Efter implantationen tumorprogression blev overvåget ugentligt under anvendelse IVIS Living billede System (Caliper Life Sciences) ifølge producentens instruktioner. Luciferase billeddannelse blev udført som tidligere beskrevet [11], bortset fra at D-luciferin kaliumsalt (Parkin Elmer) i PBS blev anvendt ved 15 mg /kg.

Doxycyclin behandlingen blev udført som beskrevet i vores tidligere papir [11] . Kort beskrevet mus med fremskredne tumorer målt med et signal på 1×10

9 fotoner /s blev fodret med foder (TestDiet) indeholdende doxycyclin ved 200 mg /kg for at tilvejebringe en daglig dosis på ca. 32 mg /kg. Tumorbyrde blev bestemt ved bioluminescens.

Immunhistokemi og Immuncytokemi

I immunocytokemi neurosfærer blev indlejret i OCT montering medier (BDH) og langsomt frosset ved anvendelse isopropanol afkølet i flydende nitrogen. Derefter 4 um tykke kryosnit blev monteret på poly-lysin overtrukne objektglas (VWR) og fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA, Sigma) i PBS i 10 minutter. Efter efterfølgende vaske med TBS blev sektionerne derefter blokeret med 10% bovint serumalbumin (BSA, Sigma), 15 mM glycin (Sigma) og 0,02% Triton X100 (Sigma) i TBS i 1 time ved stuetemperatur. For museantistoffer snit blev blokeret af MOM blokering kit (Vector Laboratories) ifølge producentens anvisninger. Snit blev inkuberet med primært antistof natten over i blokerende opløsning (0,1% BSA-PBS) ved stuetemperatur, og efter efterfølgende vaske med TBS objektglas blev mærket med sekundære antistoffer konjugeret med Alexa Fluor (1: 500, Molecular Probes). Objektglas blev modfarvet med DAPI (Sigma) og derefter blev monteret med Fluoromount G (Southern Biotech).

I immunhistokemi blev tumorprøver fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS i 24 timer til 7 dage. Prøverne blev afkalkes med 0,3 M EDTA og derefter behandles ved hjælp af Leica ASP300S væv processor til at oprette en paraffin blok. Snit blev skåret ved 4 um for hematoxylin og eosin-farvning og immunohistokemi blev udført som tidligere beskrevet [14]

Antistoffer anvendt til immunhistokemi og immuncytokemi var:. MitCN (OP-13, Calbiochem), Ki67 (556.003, BD Pharmingen ), GFAP (Z0334, DAKO), CD15 (332.778, BD Bioscience), TUJ1 (BAM1195, R . D), kløvet Caspase 3 (9664, Cell Signaling)

Immunblotanalyse

neurosfærer blev dyrket under normale og differentieringsfaktorer betingelser i nærvær eller fravær af 1 ug /ml doxycyclin. Sfærer blev høstet, og derefter suspenderet i cellelyse-buffer (Cell Signaling Technology) ifølge producentens protokol. Immunoblotanalyse blev udført som beskrevet [14]. Følgende antistoffer blev anvendt: MitCN (OP-13, Calbiochem), c-myc (SC-40, Santa Cruz), Nestin (ab5968, Abcam), beta-actin (4967, Cell Signaling Technology) og GAPDH (2118, Cell Signaling Technology).

Flowcytometri og fluorescens-aktiveret cellesortering

i cellecyklus analyser, GTML kugler blev behandlet med 1 pg /ml doxycyclin, og prøver blev taget ved 0, 2, 4, 6, 8, 24 og 48 timer. Prøverne blev fikseret under anvendelse af 70% iskold ethanol og derefter blev opbevaret ved 4 ° C i mindst 30 min. Derefter blev celler farvet med propidiumiodid (PI) (40 pg /ml, Invitrogen) ved 37 ° C i 30 minutter, og derefter blev opbevaret ved 4 ° C i 24 timer. Cellecyklus-profiler blev analyseret ved hjælp af en Becton Dickinson LSR II fluorescens-aktiveret celle-analysator.

For at isolere CD15 + og CD15- eller CD133 + og CD133- populationer blev M10519 GTML neurosfærer dissocieret til enkelte celler, og derefter blev farvet med anti-CD15 konjugeret med FITC (1: 100, Millipore) eller anti-CD133 konjugeret med PE (1: 100, Miltenyi Biotec) i 30 minutter på is, vasket med PBS indeholdende 0,3% bovint serumalbumin med antibiotika. Celler blev derefter modfarvet med 0,5 ug /ml DAPI i PBS og sorteret gennem en Becton Dickinson FACS Aria. Celler blev sorteret i DMEM /F12-medium indeholdende vækstfaktorer og B27. Renheden af ​​hver population blev vurderet ved udgangen af ​​hver art, under anvendelse af samme analysator.

oprensning af CD133 +/- celler under anvendelse af magnetiske perler

M10519 GTML neurosfærer blev dissocieret til enkelte celler ved anvendelse neurosfæren dissociation kit P (Miltenyi Biotec) efter producentens anvisninger. Efter dissociation blev cellerne centrifugeret ved 500 x g i 10 minutter og derefter blev resuspenderet i 1 ml PBS suppleret med 2% FBS og 1 mM EDTA (sortering puffer). Isolering af CD133 + og CD133- populationer blev indledningsvis udføres gennem magnetisk separation (Easysep, StemCell Technologies), efterfulgt af en endelig oprensningstrin under anvendelse af FACS ARIA (BD Biosciences). Cellesuspensionen (0,5 ml, 2×10

7 celler) blev inkuberet med 50 pi anti-CD133 (Prominin-1) PE-konjugeret antistof (Miltenyi Biotec) eller anti-IgG

1 konjugeret med PE (Miltenyi Biotec) for 10 min ved 4 ° C. Celler blev derefter vasket med sortering buffer og inkuberet med 100 pi af PE-udvælgelse cocktail (EasySep PE udvælgelse kit, StemCell Technologies) pr 1 ml sortering buffer i 15 minutter ved stuetemperatur efter tilsætning af EasySep 50 pi nanopartikler pr 1 ml cellesuspension før magnetisk adskillelse. For at forbedre renheden blev den magnetiske separationsproces gentages totalt tre gange. Renheden af ​​perle-bundne eller -unbound fraktioner blev vurderet ved hjælp af FACS LSRII analysator (BD Biosciences). Både CD133 + og CD133- fraktioner blev yderligere oprenset fra perle-bundne og ubundne fraktioner-, henholdsvis ved hjælp af FACS ARIA (BD Biosciences). 7AAD (Beckman Coulter) blev anvendt til at udelukke døde celler i FACS-analyser. Levende celler blev talt med trypanblåt-farvning før ortotopisk implantation (10 celler pr stedet).

Limited fortyndingsanalyse

M10519 celler (100, 10 og 1 celle (r) pr 100 pi neurobasalt medier i nærvær af vækstfaktorer) blev udpladet i en plade til langvarig kultur 96. Cellerne blev monitoreret hver anden uge for at vurdere sfære dannelse, og derefter det endelige estimat blev gjort ca. 4 uger efter podning.

Primere til enkeltcelle-assays

Til denne undersøgelse vi oprindeligt designet 48 primere for (i) faktorer, der udtrykkes i tre distinkte MB undertyper [5,15-17], (ii) kendte neural stamcelle markører, (III) kendte kræft markører og (IV) MitCN targets. Vi undersøgte disse sammen med 93 primere vi brugte til mus embryonale stamceller i vores tidligere undersøgelser [18,19] for primer validering ved hjælp af cDNA fra GTML og mus embryonale stamceller. Ud af 141 primere, valgte vi 96 primere, der passerede primeren validering, processen er blevet beskrevet tidligere [18].

cellesortering for enkelt celleassays

Nøjagtigheden af ​​sorteringsprocessen blev bestemt som følger. Først 2×10

5 celler blev farvet ved hjælp 0.4μl carboxyfluoresceindiacetat diacetat N-succinimidyl Ester (CFSE) fluorescerende farvestof (Sigma Aldrich), og enkelte celler blev sorteret ved hjælp af en celle sorteringsanlæg Becton Dickinson i AG480F slides (Beckman Coulter). Derefter tilstedeværelsen af ​​mærkede celler blev inspiceret under et fluorescerende mikroskop CKX41 (Olympus) for at bekræfte, at kun en celle blev spottet på en reaktionssite af objektglasset. Hvis der blev fundet to celler ved en enkelt reaktion sted, blev kalibrering af sorteringsmaskinen genstartes fra starten. Når sortering nøjagtighed blev bekræftet, blev prøveceller mærket med propidiumiodid, sorteret i PCR-rør, og derefter frosset. Celler blev derefter optøet på is for at forstyrre cellemembranerne.

revers transkription og målspecifik amplifikation

Den eksperimentelle detaljer er beskrevet i vores tidligere papir [18]. Kort fortalt blev revers transkription og cDNA-amplifikation udført som følger. Reaktionen blev inkuberet ved 50 ° C i 15 minutter, 95 ° C i 2 minutter, efterfulgt af 18 cykler ved 95 ° C i 15 sekund og 60 ° C i 4 minutter. Ikke-inkorporerede primere blev efterfølgende fjernet ved behandling med exonuklease I (Exo I, NEB). En reaktionsblanding indeholder 10 pi amplificeret cDNA, 0.4μl af 10 x Exo I buffer, 0.8μl Exo I enzym (20 U /ul), og 2.8μl af RT-PCR-kvalitet vand. Reaktionen blev holdt ved 37 ° C i 30 minutter, derefter ved 80 ° C i 15 minutter for at inaktivere af Exo I. Endelig blev DNA Suspension Buffer (36μl) blev tilsat til hver prøve (totalt 50 pi).

Analyser hjælp BioMark systemet

Eksperimentelle detaljer er beskrevet i vores tidligere papirer [19] [18], bortset fra at vi brugte 96×96 genekspression IFC Array plader (Fluidigm Corporation) i denne undersøgelse. Prøve og primer blandinger blev fyldt separat til indløb placeret på begge sider af arrayet. En BioMark qPCR Reaktionsblandingen blev sammensat af 2.5μl af 2xTaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), 0.25μl af 20x DNA Binding Dye Sample Loading Reagent (Fluidigm Corporation), 0.25μl af 20x EvaGreen DNA-bindende farvestof (Biotium) og 2 pi exo I-behandlet cDNA prøve. En primer reaktionsblanding blev sammensat af 2.5μl af 2xAssay indlæses Reagent, 1.25μl af DNA Suspension Buffer, og 1.25μl af en 20pM primerpar. Prøve læssemetoden henhold til betjeningsvejledningen til BioMark systemet.

Datavalidering

At evaluere dannelsen af ​​ikke-specifikke amplifikationsprodukter grund primer-dimer-dannelse eller ikke-specifik annealing, vi har udført smeltende kurve analyser for hver primer som beskrevet tidligere [18].

Statistisk analyse

Cq værdier højere end tærsklen for pålidelige CQ værdier (Cq

tærskel, S1 tabel) var udeladt fra de statistiske analyser som beskrevet [18]. Principalkomponentanalyse og hierarkisk clustering analyse (Ward metode) blev udført ved anvendelse R. Det skal bemærkes, at for klyngedannelse analyser og principal komponent analyse, Cq værdier over Cq

tærskel blev behandlet som upålidelige værdier, og således blev alle erstattet med Cq

tærskel + 1d. The Kolmogorov-Smirnov-testen blev anvendt til at evaluere forskellene i korrelationskoefficient fordelinger af datasæt afledt af to prøvesæt, på grund af tilstedeværelsen af ​​skævhed af distributionen og ulige antal observationer mellem sammenlignede grupper, som begge ikke var til rørledninger stærkere tests. The Log-rank test blev anvendt til at vurdere forskellen mellem de overlevelse fordelinger af to sample grupper.

Resultater

Etablering af GTML neurosfære linjer

I denne undersøgelse sigter vi til identificere tumor-formerings celler i MB, og at etablere et effektivt studie-system prækliniske at undersøge potentialet i små molekyler at forebygge tumor udvikling. Vi udnyttede den

Glt1-tTA /TRE-MitCN-luciferase Hotel (GTML) transgene mus model, hvor undertrykkelse af menneskelig MitCN og luciferase er opnåeligt i et dox-afhængig måde i hjernevæv [11,12] ( S1 fig.). I dette system tumorudvikling kan forebygges ved DOX, og tumorprogression er synlig ved hjælp af

in vivo

bioluminescerende billeddannelse (S1 Fig.); både tumorbelastning og

in vitro

cellevækst er lineært korreleret med luciferase signalintensitet (S1 Fig.) [11].

Primære væv blev kirurgisk isoleret fra voksende tumorer overvåges af ugentlig luciferase imaging ( fig. 1A og S1 fig.). Det udskårne tumorer blev dissocieret og dyrket i serumfrit Neurobasal medium indeholdende EGF og bFGF [20], og etablerede neurosfærer inden for 3-7 dage (fig. 1A), i modsætning til eksplantater af midthjernen eller cerebellum fra vildtypemus (som havde en begrænset levetid på 7-10 passager). Celler etableret fra mindst 6 forskellige primære tumorer på forskellige aldre var udødelige og udviste en fordoblingstid på ca. 24 timer. (S2 Table og S1 Fig.). Tilsammen antyder disse data, at der findes en meget proliferativ, transformeret celle sandsynligvis drevet af MitCN transgen ekspression.

(A) Etablering GTML kugler i kultur. Primære celler blev isoleret fra GTML tumorer, der blev identificeret gennem bioluminescens signaler (øverst til venstre) og morfologi, og blev derefter dissocieret til enkelte celler. M10519 GTML Neurosphærer dyrket efter 10 dage er også vist. Målestok: 100 um. (B) Effekt af MitCN tilbagetrækning på cellevækst. M10519 GTML sfærer blev podet ved densiteten af ​​1×10

5 celler /ml i nærvær af fravær af 1 pg /ml DOX, og spredning af kugler blev målt ved WST-1 metabolisk assay. Fejlsøjler, ± SD. (C) Effekt af MitCN tilbagetrækning på cellecyklus. M10519 GTML neurosfære blev behandlet med dox før cellecyklus analyser bruger FACS. (D) Western-analyser. M10519 GTML kugler blev dyrket med 1 ug /ml dox.

For at undersøge, hvilken rolle MitCN i væksten i GTML celler, vi behandlede M10519 GTML neurosfærer (samt yderligere cellelinjer, se S2 Fig .) med dox, og fundet klare beviser for, at vækst er afhængig af MitCN (fig. 1B). Cellecyklus analyser under anvendelse af flowcytometri viste klart akkumulering af vækst–begrænsede celler i G1-fasen, inden for 4 til 6 timer efter behandling (fig. 1C), Growth begrænsning var sammenfaldende med fuldstændig undertrykkelse af MitCN, men ikke c-myc-protein (S1 Fig . og S3 fig.), reducerede niveauer af Ki67, en spredning markering, og Nestin, en neural stam- og /eller progenitorcelle markering, 48 timer efter tilbagetrækning af MitCN (fig. 1D og S1 fig.). Interessant, i modsætning til vores tidligere etablerede GTML linjer med vildtype

Trp53

[12], anholdt GTML celler hurtigt udvidet efter fjernelse af DOX (S1 Fig.), Tyder på, at MitCN tilbagetrækning er cytostatisk på en brøkdel af disse celler, og at væksten anholdelse er reversibel. Den uoverensstemmelse blandt GTML celler anvendt i de to undersøgelser kan skyldes, i det mindste delvist, at det faktum, at alle GTML celler, der er etableret i nærværende undersøgelse havnen spontane mutationer i regionen af ​​

Trp53

gen, der koder p53 DNA-bindende domæne [3]. Vi foretog analyse for at fastslå, om kompenserende opregulering af muse c-myc-proteinet er involveret i frigivelsen fra cellecyklusstandsning og fandt, at c-myc niveauer var konstant (S1 Fig. Og S3 Fig.), Hvilket antyder, at i det mindste i vores neurosfære-kulturer , c-myc ikke kompensere for reduktion af MitCN (som tidligere rapporteret at forekomme i neurale stamfædre [21]). Klonogene potentiale M10519 celler, en af ​​GTML linjer, blev undersøgt gennem sekundære sfære analyser, som viser, at 42% af enkelte M10519 celler stand til at danne kugler i kultur (S4 Fig).

MitCN udtryk driver udvidelse af celler udtrykker markører typiske for neurale stam- og /eller progenitorceller og MB

for at karakterisere GTML neurosfærer, undersøgte vi ekspressionen af ​​neurale stamceller /stamceller markører ved immuncytokemi. Vi fandt, at Nestin, en markør for neurale stamceller /progenitorceller, og spredning Ki67 blev udtrykt i GTML neurosfærer i en MitCN-afhængig måde (Fig. 2A). Ekspression af et neuron-specifikt progenitor markør TUJ1 [22] blev ikke imidlertid synligt ændret af MitCN tilbagetrækning (fig. 2A), hvilket indebærer, at udtømning af MitCN ikke dramatisk påvirke graden af ​​differentiering i kultur. I modsætning til vores tidligere observation i GTML væv [11], ingen fremtrædende fald i Spaltet Caspase 3, en markør for apoptose, blev observeret ved MitCN tilbagetrækning (fig. 2A og S3 Fig.). For at få et mere detaljeret billede af genekspression på enkelt celle niveau, vi analyserede en M10519 linje (vi fundet GTML linjer vi er etableret i denne undersøgelse var bemærkelsesværdigt ens) ved hjælp af 96-plexed enkelt celle QRT-PCR (S5 Fig. Og S6 Fig .). Denne analyse viste, at fælles markører for MB og neurale stamceller, herunder NeuroD1 [23], CD133 (Prominin 1) [24-27], Otx2 [11,28], og Musashi [29] blev nedreguleret ved MitCN tilbagetrækning (Fig. 2B og S5 fig.). Hyppigheden af ​​celler, der udtrykker markører herunder CD133 og Musashi blev også reduceret med dox, mens andre stamcelle markører herunder Sox2 var upåvirket af MitCN tilbagetrækning (Fig. 2C og S5 Fig.). Angivelse af markører for astrocytter og ependymceller (GFAP) [30], astrocytter (S100B) [31], granulat neuron stamfædre og gliom (Olig2) [32-34] var knap påviselige (S5 Fig.) Eller sjældent observeret (S5 Fig .) i enkelt celle analyser. Korrelerer med den hurtige vækst i kultur, MitCN udtryk opreguleret master-regulatorer for cellecyklusprogression, E2F1 og E2F2, som begge er MitCN mål [35] (S5 Fig.). CD133, en markør for S, G2 og M faser af neurale stamceller [36] (fig. 2B og 2C). MitCN, som forventet, var næppe detekterbar i M10519 celler behandlet med DOX (fig. 2B og 2C). Taget sammen antyder disse resultater, at MitCN ekspression resulterer i en udvidelse af celler med markører typiske for neurale stamceller og /eller progenitorer forbundet med MB tumorigenese.

(A) M10519 GTML kugler blev behandlet med eller uden dox for 17 dage. Immunofluorescens analyse blev udført på cryosectioned kugler med anti-Ki67, anti-Nestin, eller anti-TUJ1, anti-GFAP, og anti-c-caspase 3 sammen med anti-MitCN. Kerner blev modfarvet med DAPI. Bar, 50 um. (B) En varme kort til midlede ekspressionsniveauer (CQ-værdier, n = 96) af 13 neural stamcelle gener er vist. (C) Procent af celler, der udtrykker CD133, Musashi, Sox2, MitCN, og CD15 er vist. Vi undersøgte WT1 og WT2 celler (se teksten), ubehandlede M10519 kugler (M10519), M10519 kugler behandlet med dox i 24 timer (Dox) eller M10519 kugler behandlet med MLN8237 i 24 timer (MLN8237).

96-genet (se S3 tabel og Janos

et al

[19]) udtryk profiler til 96 single M10519 celler viste en grad af heterogenitet (S6 fig.). Enkelt celle BioMark HD udtryk data er vist i S3 tabel. Til bedømmelse af forskellen af ​​korrelationskoefficient fordelinger af datasæt afledt fra to populationer under anvendelse af Kolmogorov-Smirnov test beregnede vi parvise korrelationskoefficienter på ekspressionsniveauer i 96 gener i en given cellepopulation. Den gennemsnitlige Korrelationskoefficienten (

R

) for M10519 neurosfærer var 0,77, og forskellen mellem M10519 celler og WT1 (

r

= 0,71, N

M10519 = 1081, N

WT1 = 990, D = 0,2662,

P

= 2.2×10

-16) eller WT2 (

r

= 0,60, N

M10519 = 1081, N

WT2 = 990 D = 0,57,

P

= 2.2×10

-16) celler var statistisk signifikant. Disse data indikerer, at mens udtrykket profiler af individuelle celler i M10519 neurosfære population er ikke helt homogene i naturen, transskriptionsprofiler blandt celler i WT1 og WT2 neurosfære kulturer afledt fra normal cerebella er signifikant mere heterogene. Desuden MitCN tilbagetrækning resulterede i en betydelig reduktion af den heterogenitet indeks (

r

= 0,69, N

M10519 = 1081, N

M10519 + Dox = 990, D = 0,27,

P

= 2.2×10

-16). Taget sammen antyder disse resultater, at MitCN ekspression hæver niveauet af cellulær homogenitet og udvider celler med neurale stam- og progenitorceller markører.

MitCN drev ekspansion af celler er resistente over for differentierings stimuli i kultur

Interessant, på trods af stamcelle og /eller stamfader-lignende transskription profil af de udvidede celler i neurosfære kulturer GTML celler, der udtrykker MitCN vises kun begrænset potentiale differentiering

in vitro

. Efter 8 dages vækst i serumholdigt pro-differentiering medier, fandt vi, at tre GTML linjer bevaret morfologiske træk er typiske for udifferentierede celler (S2 Fig.), Selvom vi fundet, at den neurale stam- /progenitorceller markør Nestin blev nedreguleret efter 2 dages MitCN tilbagetrækning (fig. 1D). Derimod er de samme betingelser inducerede differentiering af neurosfærer etableret fra vildtype cerebella (S2 Fig.). Den tilsyneladende tab af differentiering potentiale i GTML celler tyder på, at genetisk eller epigenetiske ændringer kan forekomme efter længere tids MitCN aktivering. Vi fandt også, GTML celler ikke fuldt ud differentiere under forskellige betingelser (f.eks behandling med retinsyre, en stærk inducer af differentiering (S2 fig.), Eller dyrkning i medier indeholdende 0,5 mg-1 mg /ml collagen (data ikke vist )). Når M10519 celler blev dyrket i pro-differentierende medium indeholdende serum og retinsyrer, mens vi observerede nedregulering af MitCN, som kontrolleres af den

Glt1

promotor, der aktiveres i progenitorer, og Nestin på 48-96 timer vi observerer ingen væsentlige ændringer i niveauerne af neuronal markører synaptophysin og TUJ1 og glial markør GFAP (S3 fig.). Taget sammen antyder disse resultater, at MitCN ekspression resulterer i berigelse af celler med markører typiske for stam- og /eller progenitorceller, kørsel udvidelse af stærkt proliferative celler resistente over for differentierings- stimuli. Den tilsyneladende tab af differentiering potentiale i GTML sfærer er i modsætning med neurosfærer fra humant MB (som

MitCN

status blev ikke undersøgt) [27] eller

Ptc

– /- mus model [37], tyder på, at vedvarende udtryk for MitCN driver uigenkaldelige forpligtelse til udvidelse af celler med neurale stamceller og progenitor markører.

MitCN-drevet GTML neurosfærer bevarer egenskaber af primære tumorer

in vivo

Vi har for nylig vist, at neurosfærer afledt fra GTML mus er stand til at danne tumorer i et MitCN-afhængig måde, når orthotopisk implanteret i cerebella af ikke-transgene individer fra samme kuld [12]. Som forventet tilsætningen af ​​DOX til diæt hurtigt reduceret bioluminescens (fig. 3A) og tumorbelastning (fig. 3B) hos mus implanteret med M10519 celler. For at evaluere virkningen af ​​MitCN tilbagetrækning

in vivo

undersøgte vi udtryk for biomarkører i ortotopisk tumorer.