PLoS ONE: Den ADMR Receptor medierer Effekter af Adrenomedullin på bugspytkirtelkræftceller og på Celler af Tumor Microenvironment

Abstrakt

Baggrund

Adrenomedullin (AM) er stærkt udtrykt i bugspytkirtelkræft og stimulerer bugspytkirtelkræftceller fører til øget tumorvækst og metastase. Den aktuelle undersøgelse undersøge den rolle, specifikke AM receptorer på tumor og celler ligner tumor mikromiljø (human pancreas stjerneformet – HPSC, menneskelig navlestrengen vene – HUVEC og mus lunge endotelceller – MLEC).

Metoder og Resultater

AM receptorer ADMR og CRLR var til stede i HPSC, HUVEC og MLEC’er mens PDAC celler besad kun ADMR receptorer som vurderet ved RT-PCR og western blotting. Alle cellelinier udtrykkes og udskilles AM som angivet ved ELISA. Væksten af ​​hver af cellelinierne blev stimuleret med exogent AM og inhiberes af antagonisten AMA. AM også stimuleret

in vitro

angiogenese vurderet af polygon dannelse af endotel cellelinjer. SiRNA-medieret dæmpning af ADMR, men ikke CRLR, nedsat basal vækst af alle celler undersøgt og reduceret polygon dannelse af endotelceller

in vitro

. Orthotopisk tumorer udviklet med shADMR bærende cancerceller havde dramatisk reduceret primær tumorvolumen ( 90%) og lunge- og levermetastaser sammenlignet med shControl bærende celler. For at validere ADMR som et potentielt terapeutisk mål, i

n vivo

undersøgelser blev udført ved hjælp af neutrale nanoliposomes til systemisk levere menneskelig siRNA til ADMR at lukke munden menneskelige kræftceller og mus siRNA til ADMR til tavshed mus stromale tumorceller. Systemisk silencing af både mennesker og mus ADMR havde ingen tydelige bivirkninger, men stærkt reduceret tumor udvikling.

Konklusion

ADMR formidler stimulerende virkninger af AM på kræftceller og på endothelceller og stjerneformede celler i tumormikromiljøet. Disse data understøtter den videre udvikling af ADMR som et nyttigt mål behandling af kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Ramachandran V, Arumugam T, Langley R, Hwang RF, Vivas-Mejia P, Sood AK, et al. (2009) Den ADMR receptor medierer Effekter af Adrenomedullin på bugspytkirtelkræftceller og på Celler af Tumor mikromiljø. PLoS ONE 4 (10): E7502. doi: 10,1371 /journal.pone.0007502

Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: Juni 4, 2009; Accepteret: September 15, 2009; Udgivet: 22 oktober 2009

Copyright: © 2009 Ramachandran et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af NIH DK052067, MD Anderson Support Core tilskud CA16672, MD Anderson pancreas Specialized programmer for forskning Excellence (SPORE) tilskud P20 CA101936, og af Lockton Endowment, og støtte fra et program Projektudvikling Grant fra æggestokkene Cancer Research Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, og det er blevet anslået, at cirka 37.680 amerikanere i 2008 blev diagnosticeret og 34.290 døde af denne sygdom [1]. Selv betydelige fremskridt er begyndt at ske i forvaltningen af ​​sygdommen, har 5-års overlevelsesraten ikke forbedret i løbet af de sidste 25 år [1]. Den høje dødelighed skyldes den høje forekomst af metastatisk sygdom ved første diagnose, den aggressive kliniske forløb og svigt af systemiske behandlinger [2]. Derfor er der et presserende behov for bedre forståelse af den molekylære biologi af sygdommen, som kan udnyttes til at udvikle nye terapier for kræft i bugspytkirtlen.

Vi har tidligere vist, at Adrenomedullin (AM) er overudtrykt i bugspytkirtelkræft og har en stærk autokrin rolle i denne sygdom [3]. AM er en 52 aminosyre peptid oprindeligt isoleret fra human fæokromocytom [4], der fungerer som en multifunktionel regulerende peptid [5]. Et problem med AM som mål for kræftbehandling er, at AM har flere fysiologiske funktioner, hvis hæmning kan være skadelig. AM udtrykkes i normale pancreas-ø-celler, med overvejende ekspression i F-celler, der også indeholder pancreatisk polypeptid [6]. AM reducerer insulinsekretion i fysiologiske betingelser [6]. AM har også vigtige virkninger i vaskulær cellebiologi, hvor det regulerer vaskulær tone og permeabilitet og fremmer vasodilation [7] – [11]. AM er også en potent angiogen molekyle, især i hypoxi, der inducerer AM [10]. De angiogene virkninger af AM er sandsynligvis medieret gennem direkte stimulering af endotelcelleproliferation [12] og beskyttelse af endotelceller fra apoptose [13]. Adrenomedullin signalering er nødvendig for murine lymfatiske vaskulær udvikling [14]. Mus, hvor AM er genetisk slettet udvikle kutan ødem og midgestational letalitet på grund af defekt i lymfe karvækst og hjertedefekt [15]. Ved cancer synes AM at have en vigtig rolle i angiogenese samt en yderligere trofisk virkning direkte på cancerceller [16] – [18].

AM fungerer som en peptidligand, der aktiverer receptorer på celleoverfladen . Pancreas-beta-celler udtrykker receptorer, der vides at reagere på AM herunder Adrenomedullin receptor (ADMR, også kendt som L1-R) og calcitonin-receptor-like-receptor (CRLR) [6], [19], [20]. Vores tidligere undersøgelse viste, at bugspytkirtelkræftceller kun udtrykker ADMR, mens begge receptorer er til stede i celler inden for tumormikromiljøet herunder menneskelige pancreas stjemeformige celler (HPSCs) og endotelceller. Men rollerne for de specifikke receptorer i AM virkninger på kræft i bugspytkirtlen, HPSCs og endotelceller er i øjeblikket ukendte.

Den aktuelle undersøgelse undersøger effekten af ​​AM på humane pancreas tumorceller, HPSCs og endotelceller og undersøger receptorer, der er involveret i disse virkninger. Vi tavshed hver af receptorerne

in vitro

hjælp siRNA og fandt, at ADMR var hovedansvarlig for de biologiske effekter af AM på hver af disse celletyper. Vi derefter undersøgt virkningerne af lyddæmpende ADMR på bugspytkirtelkræftceller og observeret en væsentlig reduktion af tumorvækst

in vivo

. For at analysere potentialet i ADMR som et mål for kræftbehandling, vi derefter evaluerede effekten af ​​lyddæmpende ADMR i både mus celler, der udgør tumor mikromiljø og på humane cancerceller ved at bruge DOPC nanoliposomes at levere artsspecifikke siRNA’er. Denne systemiske silencing af ADMR havde ikke indlysende skadelige virkninger på sunde mus, men stærkt reduceret tumor udvikling. Derfor bør ADMR være et vigtigt mål for den fremtidige udvikling af småmolekyle- lægemidler.

Materialer og metoder

cellelinjer og AM peptider

bugspytkirtelkræft BxPC3 celler og HUVEC celle linjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). MPanc96 pancreasadenocarcinom cellelinjer blev oprindeligt etableret af Dr. Timothy J. Eberlein (St. Louis, MO) [21]. MLEC’er er mikrovaskulære endotelceller fra primære kulturer opnået fra lungerne hos mus, hvis væv huser en temperaturfølsom SV40 stort T-antigen [22]. Når den dyrkes under permissive temperaturer (33 ° C), viste cellelinier fordoblingstider overensstemmelse med endotelceller besidder en angiogen fænotype. Overførslen af ​​disse endothelceller til ikke-permissive temperaturer (37 ° C) resulterede i celledifferentiering og induktion af en hviletilstand. MLEC’er blev dyrket i 10% FBS i DMEM. BxPC3 celler blev dyrket i 10% FBS i RPMI-medium, MPanc96 celler blev dyrket i 10% FBS i DMEM-medium og humane endotelceller (HUVEC) blev dyrket i 15% FBS i MEM. Alle medier indeholdt 1% antibiotikum. Humane pankreatiske stjemeformige celler (HPSCs) blev isoleret under anvendelse af udvækst metode fra pancreas adenocarcinom prøver fra patienter, der undergår kirurgisk resektion og dyrket i 15% FBS i DMEM [3], [23]. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. BxPC3 og MPanc96 cellelinier stabilt bærer shControl eller shADMR vektorer og luciferasegenet udviklet i en tidligere undersøgelse blev også anvendt [3]. Adrenomedullin (AM 52) og Adrenomedullin antagonist (AMA (AM 22-52)) blev købt fra Sigma, (St. Louis, MO).

ELISA for AM

AM blev påvist i konditioneret medier fra HPSC, HUVEC og MLEC’er anvendelse af et kommercielt ELISA. Til opsamling af konditionerede medier blev cellelinjer dyrket til 80% konfluens og vasket med PBS og derefter dyrket i 24 timer i deres respektive serumfrie medier. Medier blev opsamlet og koncentreret ved anvendelse af Centricon YM-3 filter enheder (Millipore Corporation, Chicago, IL). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse Bio-Rad-reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kompetitivt ELISA blev derefter udføres med en AM detektion kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA; cat # EK-010-01) ved at følge producentens foreslåede protokol. Respektive koncentrerede serumfrie medier tjente som kontrol reagens og kontrol OD-værdier blev trukket fra de af alle andre prøver. Beregninger af AM koncentration udnyttet standardkurven inkluderet i sættet og blev udført i overensstemmelse med producentens protokol.

Transient transfektion af siRNA

Silencing af ADMR og CRLR blev opnået i HPSC, HUVEC og MLEC’er (2 × 10

4 celler) under anvendelse af forbigående transfektion af siRNA’er. Menneskelige og mus siRNA’er hver mod kontrol, ADMR og CRLR (siRNA’er ID # 4611, 46184, 42.272, Ambion Inc. Austin, TX og specialfremstillede mus siRNAs ID # Kontrol – 1.129.089, 1.129.090, ADMR – 1.129.085, 1.129.086, CRLR – 1.129.087, 1129088 fra Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) blev transficeret ved en slutkoncentration på 5 nM per brønd på plader med 96 brønde. Vi analyserede også virkningerne af siADMR på MPanc96 kræftceller. SiRNA transfektion blev udført med Hiperfect transfektionsreagens (Qiagen, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol.

Western Blotting

MPanc96, HPSC, HUVEC og MLEC celler blev transient transficeret med kontrol siRNA eller siRNA’er mod ADMR eller CRLR og efter 72 timer, cellelysater blev fremstillet og proteinkoncentrationer blev målt ved BioRad-reagens. Protein (50 ug) blev fyldt på 10% SDS-PAGE geler og western blotting blev udført under anvendelse af et primært antistof mod ADMR (Cat # LS-A4048 MBL International Corporation, Woburn, MA) ved en 1: 1000 fortynding og under anvendelse af et primært antistof mod CRLR (cat # sc-30028, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved en 1: 100 fortynding. Den samme blot blev re-undersøgt for β-actin (1:200 fortynding kat # A2066 Sigma, St.Louis, MO)., Der tjente som lastning kontrol

RT-PCR

totalt RNA blev ekstraheret fra HPSC, HUVEC og MLEC celler med eller uden siRNA transfektion og fra muse pancreas. DNase blev anvendt til at fjerne kontaminerende genomisk DNA efter RNA oprensning. Integriteten af ​​RNA blev bekræftet ved at køre på en denaturerende gel, og observere klare 28S og 18S rRNA-båndene. En ikke-revers transkriberet kontrol blev kørt for at sikre, at der ikke genomisk DNA blev amplificeret. RT-PCR blev udført med mennesker og mus AM /ADMR /CRLR primere til at bestemme deres udtryk og niveauer af lyddæmpning. Revers transkription blev efterfulgt af 35 cyklusser af standard-PCR (1-min denaturering ved 94 ° C, 1-min annealing ved 63 ° C, og 1-min forlængelse ved 72 ° C). Primere specialiteter til human AM (Genebank: NM_001124) var: fremad 5’CGG GAT CCA TGA AGC TGG TTT CCG TC 3 ‘og omvendt, 5’ CGG AAT TCC TAA AGA AAG TGG GGA GC 3 ‘. Primere specialiteter til human ADMR (Genebank: NM_007264) var: fremad 5 ‘CAT CGC GGA FTT GGG CAT TGT 3’ og omvendt, 5 ‘TGA GAG GGA AGG GCA GCA GGA AGC 3’. Primere specialiteter til human CRLR (Genebank: NM_005795) var: videresende 5’TGC TCT GTG AAG GCA TTT AC 3 ‘og omvendt, 5’ CAG AAT TGC TTG AAC CTC TC 3 ‘. Primere designet til mus AM (Genebank: NM_009627) var: frem 5’CCA GGG TTC CCG CAG CAA 3 ‘og omvendt, 5’ CTA TAT FTT AAA GAG TCT GG 3 ‘. Primere designet til mus ADMR (Genebank: NM_007412) var: frem 5’CCG TTA FTT TCC CAA GGA 3 ‘og omvendt, 5’ TTA GCT GGC TAC AGA ATT GCA 3 ‘. Primere designet til mus CRLR (Genebank: NM_018782) var: frem 5’TGG CTT TTC CCA CTC TGA T 3 ‘og omvendt, 5’ TCA CAT CAC TAG ATC ATA CGT 3 ‘. 18S primere tjente som lastning kontrol for RT-PCR-reaktionerne. Amplificerede produkter blev adskilt på 1,5% agarosegeler og visualiseret ved ethidiumbromid.

undersøgelser cellevækst

HPSC blev HUVEC og MLEC’er (1000 celler) udplades på plader med 96 brønde i 0,5% serum holdigt medium med eller uden AM (0-200 nM) eller AMA (1 uM), der blev opdateres dagligt, og celleantal blev estimeret efter 48 timer for HPSC og HUVEC-celler, og efter 96 timer for MLEC’er af MTS-assay. For siRNA undersøgelser blev HPSC, HUVEC og MLEC’er (1000 celler) udplades på plader med 96 brønde og respektive menneskelige og muse siControl /siADMR /siCRLR blev transficeret og celleantal blev estimeret efter 48 timer for HPSC og HUVEC-celler, og efter 96 timer for MLEC’er. Cellevækst blev analyseret ved hjælp af MTS reagens tilsættes en time før tager spektrofotometriske aflæsning i overensstemmelse med producentens anvisninger (Promega, Madison, WI).

In vitro

Angiogenese assay

HUVEC og MLEC (1 × 10

4) celler blev podet på overfladen af ​​den polymeriserede ECMatrix fremstillet som beskrevet af producenten (Kat # ECM625; Chemicon Intl, Millipore Corp, Billerica, MA). Celler blev behandlet med AMA (1 uM) peptider AM (200 nM) eller og efter 6 timer rør-dannelse blev evalueret under et omvendt lysmikroskop (Olympus, Center Valley, PA). Billeder blev taget med et kølet, charge-coupled device-kamera (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) og SmartCapture software (Digital Scientific, Cambridge, UK). Billeder blev yderligere behandlet med Adobe Photoshop software (Adobe Systems, Mountain View, CA). For at kvantificere de angiogene begivenheder, mønstre af cellevækst i 10 tilfældige områder ved 100 × forstørrelse blev vurderet som pr fabrikantens forslag og gradueres som: Individuelle celler, godt adskilt -0; Celler migrerede og aligned -1; Kapillarrør synlige, ingen spiring -2; Spiring af kapillarrør -3; Lukkede polygoner dannet – 4; og komplekse mesh-lignende strukturer udviklet -5

immunhistokemisk farvning -. CD31 /VEGF

Ufarvede 4 um vævssnit fra siControl eller siADMR behandlede mus blev afparaffiniseret med xylen og hydreret med ethanol. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i methanol og ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med protein blokerende opløsning (5% normalt hest og 1% normalt gedeserum). Primært antistof mod CD31 (1: 800 fortynding; cat # 01951A; BD Pharmingen, San Diego CA) /VEGF (1:100 fortynding; cat # sc-152; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blev tilsat, og prøverne blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Sekundært antistof blev tilsat og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev objektglassene fremkaldt med 3,3-diaminobenzidin (DAB) substrat modfarvet med hematoxylin, dehydreret med ethanol, fikseret med xylen og monteret. Immunhistokemi blev analyseret under anvendelse af et inverteret lysmikroskop (Olympus, Center Valley, PA). Billeder blev taget med et kølet, charge-coupled device-kamera (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) og SmartCapture software (Digital Scientific, Cambridge, UK). Billeder blev yderligere behandlet med Adobe Photoshop software (Adobe Systems, Mountain View, CA). Slides blev blændet og analyseret ved IHC kerne i Dept. of Cancer Biology, UT MDACC.

DOPC nanoliposome koblede siRNA’er.

For eksperimenter for at teste effektiviteten af ​​

in vivo

terapeutiske målretning af ADMR i ortotopisk tumorer i mus, blev neutrale liposomer indeholdende siRNAs fremstillet som tidligere beskrevet [24]. Kort fortalt siRNA oligonukleotider (uden hårnåle) til ADMR målrette sekvenser (human siADMR (sense – 5 ‘rGrCUrGrCUUrGrArCrCUrCUUrCrArArCTT 3’), mus siRNA sense sekvens – 5 ‘rCrCUUUUrGrArArArCrGUrArCrArGrCrGTT 3’) eller kontrol sekvenser (kontrol siRNA sense sekvens – 5 ‘UUrCUrCrCrGrArArCrGUrGUrCrArCrGUTT 3’ ) (specialfremstillede menneske og mus oligoerne kat # menneskelig siADMR – 1.150.080, 1.150.081, Mouse siADMR – 1.129.085-H, 1.129.086-H; Kontrol – 1.129.089, 1.129.090 fra Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) blev blandet med 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DOPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) i et forhold på 10:01 (vægt /vægt) DOPC /siRNA og lyofiliseret. Umiddelbart før

in vivo

administration, lyofiliserede præparater blev hydratiseret i 0,9% saltvand ved en koncentration på 10 ug siRNA pr 200 pi og blev oprenset ved at adskille fri siRNA fra liposomer med filteranlæg med en størrelse udelukkelsesgrænse på 30.000 dalton (Millipore Corp, Billerica, MA).

glucosetolerancetest.

i glucose tolerance, blev mus injiceret intraperitonealt med 1,5 mg glucose /g legemsvægt på 9:00, efter en 16-h hurtigt. Blod glukose blev bestemt ved de angivne tidspunkter med prøver af halen blod opnået ved hjælp af Ascensia CONTOUR Blood glucometer (Bayer Health Care, Tarry by, NY).

In vivo

undersøgelser.

Alle dyr blev håndteret i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af de relevante nationale og /eller lokale dyrevelfærd organer, og alle dyr arbejde blev godkendt af den relevante udvalg (IACUC – 09-04-08832).

ortotopisk tumor model.

MPanc96 og BxPC3 celler, der bærer shADMR eller shControl blev udviklet som nævnt i en tidligere [3] publikation. Disse bugspytkirtelkræftceller blev yderligere ændret til stabilt udtrykke ildflue luciferase genet ved lentivirus transfektion at lette

in vivo

monitorering af tumor udvikling [25]. Disse celler blev dyrket til 80% konfluens, høstet ved trypsinisering, vasket to gange i PBS og resuspenderet til en slutkoncentration på 1 x 10

6 celler /50 ul af MPanc96 celler og 2 × 10

6 celler /50 ul BxPC3 celler i sterilt PBS og injiceret i pancreas fra fire uger gammel mand

athymiske nøgne Salg mus (n = 5). Tumorvækst blev vurderet ved bioluminescens billeddannelse ved udgangen af ​​fire uger.

Lunge og levermetastaser modeller.

Sammenligninger blev foretaget mellem lunge og levermetastaser i MPanc96 celler, der bærer shADMR eller shControl celler ved hjælp veletablerede metastase modeller. Lungemetastaser blev udviklet af haleveneinjektion på 1 × 10

6 celler /100 ul (n = 9) og levermetastaser ved milt injektion af 1 x 10

6 celler /50 ul (n = 7) til

atymiske nøgne

mus og evalueret af bioluminescens billeddannelse. Efter seks uger blev musene aflivet, og organer blev udskåret og opbevaret i Bouins fiksativ opløsning.

Levering af DOPC nanoliposome koblede siRNA’er.

Ved evaluering af potentielle toksicitet, blev eksperimenter udført levere DOPC nanoliposome koblede siControl eller siADMR (mus) til

athymiske nøgne

mus (10 ug per dyr ip to gange uge i fire uger). Vand og fødeindtagelse, kropsvægt og blodsukkerniveauet blev målt. Dyr blev aflivet efter fire uger, bugspytkirtlen blev isoleret og totalt RNA blev ekstraheret. RT-PCR blev anvendt til at evaluere silencing af ADMR, mens 18S tjente som intern kontrol. Orthotopisk tumorer blev udviklet i

athymiske nøgne

mus med MPanc96 celler der bærer luciferasegenet (1 × 10

6 celler /50 ul sterilt PBS) og to uger senere, DOPC nanoliposome koblet siControl og siADMRs (human og mus i kombination) blev leveret 10 ug per dyr ip to gange om ugen i seks uger. Bioluminescens billeddannelse. Bioluminescens billeddannelse blev udført ved anvendelse af et kryogent afkølet billeddannende system koblet til en dataopsamling computer med LivingImage software (Xenogen Corp., Alameda, CA). Før billeddannelse blev dyrene bedøvet i en akryl kammer med isofluoran /luftblanding 1,5% og injiceret i.p. med 40 mg /ml luciferin kaliumsalt i PBS ved en dosis på 150 mg /kg legemsvægt. Et digitalt gråtoner dyr billede blev taget, efterfulgt af køb og overlejring af et pseudo-billede, som repræsenterer den rumlige fordeling af detekterede fotoner nye fra aktiv luciferase inden dyret. Signal intensitet blev kvantificeret som summen af ​​alle registrerede fotoner inden for området af interesse per sekund. Efter den sidste tumorafbildning blev vævene fjernet og dyrene blev igen afbildet at visualisere og tælle celle formidling og metastaser kræft. Væv blev også fikseret med formaldehyd og histologi blev vurderet til at kontrollere rigtigheden af ​​bioluminescens data.

Statistisk analyse

Alle

in vitro

forsøg blev udført i tre eksemplarer og gennemført på tre eller flere separate lejligheder. Viste data er hjælp af de tre eller flere uafhængige forsøg ± standardafvigelse på middelværdien (SEM). Statistisk signifikante forskelle mellem kontrol og behandlede prøver blev bestemt ved to-halet uparret t-test og blev defineret som * p 0,05. Resultaterne blev sammenlignet ved hjælp af GraphPad Prism 4 software (GraphPad Software, https://www.graphpad.com).

Resultater

AM har autokrine virkninger på HPSC, HUVEC og MLEC celler

Tidligere observerede vi, at AM tjente som en autokrin regulator af spredning, overlevelse og motilitet bugspytkirtelkræftceller [3]. For at bestemme om AM også påvirket HPSC, HUVEC og MLEC’er, vi først undersøgt, om de gav udtryk for AM og dets receptorer ADMR og CRLR som målt ved RT-PCR. Alle tre cellelinier udtrykte AM, ADMR og CRLR (fig. 1A). Endvidere har vi vurderet om disse celler udskilte AM i vævskulturmedier anvendelse af et ELISA. Alle disse celletyper udskilte AM (fig. 1B), understøtter rollen af ​​dette molekyle som en autokrin regulator i multiple celletyper. For at undersøge effekten af ​​AM på biologi af disse celler, blev eksogent AM tilføjet til HPSC (Fig. 1C), HUVEC (fig. 1D) og MLEC (fig. 1E) celler og proliferation blev vurderet af MTS analysen. Tidligere undersøgelser indikerede, at den optimale koncentration af AM var 50 nM for HPSC og 200 nM for HUVEC og MLEC celler (data ikke vist). Tilsætning af AM på de optimale koncentrationer stimulerede væksten af ​​HPSCs med 29 ± 1,8% (p 0,05), HUVEC’er med 25 ± 3,7% (p 0,05) og MLEC’er med 33 ± 4,5% (p 0,05). Endvidere tilsætning af AM-antagonist, AMA (1 uM), reduceret den basale vækst af HPSCs med 21 ± 5,3% (p 0,05), HUVEC’er med 21 ± 0,4% (p 0,05) og MLEC’er med 25 ± 5,1% ( p 0,05) yderligere støtte en autokrin rolle AM ​​på disse celler. For yderligere at undersøge virkningerne af AM og vi gennemførte

in vitro

angiogenese analyser. AM stimuleret polygon dannelse i HUVEC’er (fig. 1F) og i MLEC’er (fig. 1G) ved 6 timer, sammenlignet med kontrolkulturer, og AMA blokerede AM-medierede virkninger af polygon formation.

(A) RT-PCR viser ekspressionen af ​​AM, ADMR, og CRLR på HPSC, HUVEC og MLEC’er. (B) ELISA-assay der viser sekretionen af ​​AM fra HPSC, HUVEC og MLEC celler. Serumfrie medier badning disse celler blev opsamlet og opkoncentreret og undersøgt for tilstedeværelsen af ​​AM. Niveauer blev beregnet ifølge producentens anvisninger. (C) HPSC, (D) HUVEC, eller (E) MLEC celler (1000 celler) blev udpladet på plader med 96 brønde og AM (50 nM for HPSC og 200 nM for HUVEC og MLEC) eller AMA (1 uM) blev tilsat til pladerne dagligt og celleantal blev estimeret efter 48 timer for HPSC og HUVEC-celler, og efter 96 timer for MLEC’er af MTS-assay. Sammenlignet med WT kontrolgruppen, AM stimulerede proliferation af alle tre celletyper. Ligeledes AMA behandling inhiberede basal proliferation af alle cellerne. De viste data er middel +/- SEM (* p 0,05).

In vitro

angiogenese analyser blev udført med (F) HUVEC og (G) MLEC celler. Celler blev udpladet på EF-matrix sammen med AM (200 nM) alene eller i kombination med AMA (1 uM). Efter 6 timer dannelse rør blev evalueret mikroskopisk i henhold til producentens instruktioner. Vist er repræsentative mikrografier. AM konsekvent stimuleret HUVEC og MLEC celler til at danne rør, mens AMA vendt effekterne af AM.

Virkningerne af AM på HPSC, HUVEC og MLEC celler medieres via ADMR receptoren

der er to mulige receptorer, der reagerer på AM, ADMR og CRLR. Vi har tidligere rapporteret, at humane bugspytkirtelkræftceller udtrykker udelukkende ADMR mens HPSC og HUVEC celler udtrykte både AM receptorer [3]. I den aktuelle undersøgelse, bemærkede vi, at MLEC’er også udtrykker begge receptorer. For at bestemme den relative betydning af disse receptorer, vi tavshed dem uafhængigt på disse tre cellelinjer hjælp siRNA teknikker. Transfektion med siRNA reducerede signifikant niveauerne af enten ADMR eller CRLR på HPSC (fig. 2A), HUVEC (Fig. 2B) og MLEC’er (fig. 2C) sammenlignet med kontroldyr siRNAs. HPSC, HUVEC og MLEC’er tavse med siRNA til enten ADMR eller CRLR blev undersøgt i vækst assays hvor celletal blev anslået ved hjælp af MTS-metoden. Silencing af ADMR, men ikke CRLR, reducerede signifikant væksten af ​​alle disse celletyper. Silencing af ADMR reducerede væksten af ​​HPSC med 21 ± 3,4% (p 0,05) (. Figur 2D), HUVEC’er med 24 ± 1,8% (p 0,05) (. Figur 2E) og MLEC’er med 26 ± 4,3% (p 0,05) (fig. 2F). Silencing af ADMR på HUVEC’er (Fig. 2G) og MLEC’er (fig. 2H) helt afskaffet AM medieret dannelse rør, mens tavshed af CRLR delvist reduceret rør formation. Disse data tilsammen antyder, at den autokrine virkninger af AM på HPSC, HUVEC og MLEC celler medieres primært via receptoren ADMR selvom CRLR også kan have nogle virkninger.

(A) HPSC og (B) HUVEC-celler blev forbigående transficeret med humane siRNAs og (C) MLEC celler blev transficeret med muse siRNA’er (siControl, siADMR eller siCRLR). Efter 72 timer blev cellerne høstet og protein eller RNA blev ekstraheret. Western blotting under anvendelse af humane antistoffer viser omfanget af inaktivering af human ADMR og CRLR i HPSC og HUVEC-celler, og RT-PCR under anvendelse af muse-primere viser virkningerne af muse siADMR og siCRLR på MLEC’er. p-actin tjente som en loading kontrol for western blotting og 18S primere tjente som en loading kontrol for RT-PCR. geler Fuld længde er vist i figur S1. Virkningerne på proliferation af siRNA-medieret inaktivering af receptorer er vist på (D) HPSC, (E) HUVEC, og (F) MLEC celler. Celler blev transficeret med deres respektive humane eller muse siRNA’er (siControl, siADMR eller siCRLR) i 24 timer, derefter proliferation blev anslået af MTS-assay efter yderligere 48 timer for HPSC og HUVEC-celler og 96 timer for MLEC’er. Silencing af ADMR men ikke CRLR forårsagede en signifikant reduktion af udbredelsen af ​​disse celler. De viste data er middel +/- SEM (* p 0,05).

In vitro

angiogenese assay med (G) HUVEC og (H) MLEC celler. Cellerne blev udsået på matrix gel 24 timer efter transfektion med deres respektive menneskelige eller muse-siRNA’er (siControl, siADMR eller siCRLR). Celler blev derefter behandlet med AM (200 nM) i 6 timer og undersøgt mikroskopisk. Omfanget af dannelse rør blev evalueret i henhold til fabrikantens anvisninger. Repræsentative mikrografer er vist. ADMR tavshed fuldstændig blokeret rør dannelse, mens CRLR tavshed kun delvist reduceret rør formation.

Silencing af ADMR på bugspytkirtelkræftceller reducerede tumorvækst og metastase

in vivo

for at undersøge effekten af ​​ADMR tavshed på kræftceller, observerede vi væksten af ​​ortotopisk tumorer dannet af to forskellige bugspytkirtlen kræft cellelinjer transficeret med enten shADMR eller shControl. Tumorvolumener blev målt efter 4 uger ved bioluminescens billeddannelse. Tumorvolumenet blev reduceret med 92 ± 0,5% i ADMR tavshed MPanc96 tumorer sammenlignet med kontrolpatienter vektor bærende tumorer (p 0,05) (figur 3A.). Ligeledes blev BxPC3 tumorvolumen signifikant reduceret med 83 ± 0,6% efter ADMR lyddæmpning sammenlignet med kontrol tumorer (p 0,05) (Fig 3B.). I begge tilfælde var der også en reduktion i lunge og levermetastaser og en reduktion i peritoneal formidling. Men fordi ADMR silencing reducerede tumorvolumen; enhver reduktion i metastaser kan have været på grund af den generelle reduktion i tumor volumen.

ortotopisk tumorer blev udviklet med MPanc96 (A) eller BxPC3 (B) celler stabilt tavshed med shADMR og udtrykker luciferasegenet. Efter 4 uger blev tumorvolumen estimeret ved bioluminescens billeddannelse og viste en signifikant reduktion mellem ADMR og shControl vektor bærende tumorer fra begge celletyper. De viste data er middelværdier +/- SEM for 10 dyr per gruppe. (* P 0,05) bioluminescens billeder af repræsentative mus er også

Silencing af ADMR på bugspytkirtelkræftceller reduceret metastaser

in vivo

For direkte at evaluere. rolle ADMR i bugspytkirtelkræft lunge- og levermetastaser, vi gennemførte separate undersøgelser i

nøgne

mus ved halevenen og milt injektion hhv. ADMR silencing reducerede forekomsten af ​​lunge metastase (ShControl – 67% vs ShADMR – 22%) som målt ved bioluminescens billeddannelse (fig 4A.). Desuden blev tilstedeværelsen af ​​metastaser påvises med bioluminescens billeddannelse udsat fra 2

nd uge i kontroldyr til 5

th uge i shADMR bærende celler. Udskårne lunger efter fiksering i Bouins opløsning viste reduktion i antallet af lunge metastatiske foci, som vist i den repræsentative billede (fig. 4C). Virkningerne af ADMR silencing på levermetastaser var de samme som på lunge metastase. ADMR lyddæmpning reducerede forekomsten af ​​levermetastaser (ShControl – 100% Vs ShADMR – 43%) (fig 4B.). Tilstedeværelsen af ​​påviselige metastaser blev udsat fra 2

nd uge indtil 5

th uge. Reduktion i antallet af liver metastatiske foci er vist som et repræsentativt billede (fig. 4D). Disse data viser, at AM kan fungere som en metastase inducer af bugspytkirtelkræftceller og disse virkninger af AM på kræftceller medieres via receptor ADMR.

MPanc96 celler, der bærer luciferasegenet stabilt transficeret med shControl eller shADMR celler blev injiceret i halevenen til måling lunge metastase og ind i milten at måle levermetastaser. Dyr med ADMR tavshed celler viste reduktion i forekomsten af ​​lunge (A) og levermetastaser (B) som målt ved bioluminescens billeddannelse. Efter 6 uger blev musene aflivet, og lunger og leveren blev også udskåret og undersøgt groft og histologisk. Stabil silencing af ADMR reduceret antallet af metastatiske foci på lunge og lever i sammenligning med shControl. Repræsentative billeder viser reduktionen i antallet af metastatiske foci i lungerne (C) og lever (D).

I

n vivo

målretning af ADMR hjælp systemisk levering af siRNA’er er yderst effektiv at reducere tumorvækst

Vores data understøtter en rolle for ADMR i virkningerne af AM på bugspytkirtelkræftceller.