PLoS ONE: Ikke-redundant Rolle for IL-12 og IL-27 i Modulerende Th2 polarisering af carcinoembryonisk antigen specifikke CD4 T-celler fra bugspytkirtlen kræftpatienter

Abstrakt

Baggrund

Kræft i bugspytkirtlen er en meget aggressiv sygdom med dystre prognose; ejendommelige er tumormikromiljøet karakteriseret ved en omfattende fibrotisk stroma, som favoriserer hurtig tumorprogression. Vi har tidligere rapporteret, at pancreas-cancer-patienter har en selektiv Th2 skew i anti-carcinoembryonisk antigen (CEA) CD4

+ T-celle immunitet, som korrelerer med tilstedeværelsen af ​​et fremherskende GATA-3

+ tumor lymfoid infiltrat. Dette har negative virkninger i både effektiv anti-tumor immunitet og yderligere at begunstige fibrinogenesis. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om Th2 polarisering af CEA-specifikke CD4

+ T celler fra bugspytkirtlen kræftpatienter er stabil eller kan fortrydes med immunmodulerende cytokiner.

Metode /vigtigste resultater

Vi først evalueret indflydelse af IL-12 og IL-27, som enkelte midler og i forening, på polarisationen af ​​CEA-specifikke Th2 CD4

+ T-cellekloner fra et pancreatisk cancerpatient. Vi fandt, at kun kombinationen af ​​IL-12 og IL-27 modificeret polarisationen af ​​Th2 effektorer af både reduktion af IL-5, GM-CSF og IL-13 og induktion af IFN-γ produktion, som varede efter cytokin fjernelse. For det andet, vi evaluerede virkningen af ​​den kombinerede behandling på polyklonale CEA-specifikke CD4

+ T-celler i kort tid restimulering assays. Efter aftale med de data, der er opnået med kloner, fandt vi, at den kombinerede behandling funktionelt moduleret Th2 polarisering af CEA-specifikke CD4

+ T-celler og udvidet eksisterende Th1 typen immunitet.

Konklusioner /Betydning

Kollektivt, vores resultater viser, at tumorantigen specifikke Th2 CD4

+ T-celler i bugspytkirtelkræft er udstyret med funktionel plasticitet. . Derfor loco-regional cytokiner levering eller målrettet terapi baseret på antistoffer eller molekyler rettet mod tumor stroma kan forbedre anti-tumor immunitet og forbedre fibrose, uden systemisk toksicitet

Henvisning: Tassi E, Braga M, Longhi R , Gavazzi F, Parmiani G, Di Carlo V, et al. (2009) Ikke-redundant Rolle for IL-12 og IL-27 i Modulerende Th2 polarisering af carcinoembryonisk antigen specifikke CD4 T-celler fra bugspytkirtlen kræftpatienter. PLoS ONE 4 (10): e7234. doi: 10,1371 /journal.pone.0007234

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 17, 2009; Accepteret: 9. september 2009; Udgivet: 2 okt 2009

Copyright: © 2009 Tassi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af det Europæiske Fællesskab (DC-THERA), det italienske sundhedsministerium, det italienske ministerium for University og videnskabelig forskning og Rich Foundation (LDP Pancreas Cancer Research Project). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er en meget aggressiv sygdom med dystre [1] prognose. Peculiar er tumormikromiljøet, som består af fibroblaster, pancreas stjemeformige celler, endotelceller immun- og endokrine celler og perineural spredning og det menes at spille en aktiv rolle i sygdommens progression og aggressivitet [2].

Senest [3], undersøgte vi kvaliteten af ​​anti-tumor-CD4

+ T-celle-responser i PC patienter, der gennemgår kirurgisk resektion, ved at sammenligne den anti-carcinoembryonisk (CEA) og anti-viral CD4

+ T-celle immunitet. Vi fandt, at anti-CEA CD4

+ T-celle immunitet var til stede i et væsentligt lavere antal pc-patienter sammenlignet med normale donorer. Vigtigst, mens CD4

+ T-celler fra normale donorer fremstillet hovedsageligt granulocytter makrofager kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og den pro-inflammatoriske (

dvs.

, Th1) cytokin interferon-γ (IFN-γ ), CD4

+ T-celler fra patienterne producerede primært interleukin (IL) -5 og IL-13, hvilket viser en skrå retning af en anti-inflammatorisk (

dvs.

, Th2) skriver. Tværtimod omfanget af antivirale CD4

+ T-celle immunitet var sammenlignelige mellem de to grupper og viste en Th1-typen. Efter aftale med Th2 Skew observeret i cirkulerende CEA specifikke CD4

+ T-celler, immunhistokemisk analyse af tumor infiltrerer lymfocytter viste et signifikant højere antal GATA-3

+ (Th2) sammenlignet med T-bet

+ (Th1) lymfoide celler, der støtter en Th2 skew også ved tumorstedet.

det er vist, at fibrose, der er kendetegnende i PC, er stærkt knyttet til udviklingen af ​​Th2 respons gennem aktivering af Th2 cytokiner af collagensyntese af fibroblaster og samtidig reduceret collagen nedbrydning i fravær af Th1 cytokiner [4]. Derfor er tilstedeværelsen af ​​GATA-3

+ lymfoide celler, som vi observerede [3] i bugspytkirtlen tumor mikromiljø, kunne bidrage yderligere til fibrose og lokale behandlinger til formål at reducere tilstedeværelsen af ​​Th2 cytokiner kan være gavnligt.

Blandt de forskellige faktorer, der fremmer CD4

+ T celler polarisering, cytokiner har en afgørende rolle [5]. IL-12, et produkt fra fagocytter og dendritiske celler som reaktion på mikrobiel stimulation, har en vigtig rolle i fremme Th1 polarisering og øge CD4

+ T-celler proliferation [6]. Desuden har IL-12 vist sig at inducere tilbageførsel af Th2 polarisering i humane allergen-specifikke Th2-celler [7], [8] og i synergi med IL-18, til at stimulere IFN-γ produktion af perifert blod mononukleære celler (PBMC ) fra lepromatøs spedalskhed patienter [9]. IL-27, et nyligt identificeret medlem af IL-12 familien [10], stimulerer også proliferation og synergistisk med IL-12 i udløsning IFN-γ produktion af naive CD4

+ T-celler [10], [11]. For nylig er det blevet vist [12], at IL-27 inhiberer Th2 polarisering af naive murine CD4

+ T-celler og undertrykker Th2-cytokiner produktion fra

in vitro Salg polariserede Th2-celler.

i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi muligheden for at tilbageføre det Th2 polarisering af

bona fide in vivo

primet CEA-specifikke CD4

+ T celler fra PC patienter ved hjælp af IL-12 og IL-27 som immunmodulerende agenter. Vi fandt, at tilstedeværelsen af ​​IL-27 alene var tilstrækkelig til at inhibere IL-5 og IL-13-sekretion, mens IL-12 stærkt stimuleret IFN-γ produktion med mindre indvirkning på Th2-cytokiner sekretion; kombinationen af ​​de to cytokiner inducerede en funktionel modulering af Th2 polarisation.

Materialer og metoder

Fag og cellelinier

PBMC blev opnået fra to PC patienter (pt # 15 og pt # 43) og en rask donor (ND # 11) af en kohorte af fag, hvor vi tidligere afslørede anti-CEA CD4

+ T-celler [3]. Patienterne blev trukket før operation og iscenesættelse af sygdommen var T3N1M0 i begge tilfælde. Den institutionelle etiske udvalg (Comitato Etico Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Ospedale San Raffaele) havde godkendt forsøgsprotokollen og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle donorer før blodprøvetagning. EBV-transformerede lymfoblastoide cellelinjer (LCL), der anvendes, og deres human leukocyt antigen (HLA) -DR typen var: SKP-LCL (β1 * 0405, * 1401; β3 * 02), der blev oprettet i vores laboratorium fra en rask donor; BM21 (β1 * 1101; β3 * 0202) og Pitout (β1 * 0701; β4 * 0101), venligst stillet til rådighed af K. Fleischhauer (San Raffaele Scientific Institute, Milano). LCL blev dyrket i RPMI 1640 (BioWhittaker) indeholdende 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 50 mg /ml streptomycin (BioWhittaker), og 10% FCS (BioWhittaker).

Syntese af CEA-peptider

CEA

99-111, CEA

117-129, CEA

177-189 /355-367, CEA

425-437, CEA

568-582, og CEA

666-678 sekvenser blev syntetiseret ved den trinvise fastfase-metoden som tidligere beskrevet [13]; peptiderne blev lyofiliseret, rekonstitueret i DMSO (Sigma-Aldrich) ved 10 mg /ml og fortyndet i RPMI 1640 efter behov. Salg

In vitro Salg formering af CD4

+ T-cellekloner

Polyklonale CEA

177-189 /355-367 specifik CD4

+ T-celler fra pt # 15, opnået efter 13 dage med kortvarig kultur med det specifikke peptid og autologe CD4

+ -depleted PBMC som antigenpræsenterende celler (APC), blev klonet ved begrænsende fortynding som beskrevet i [14]. Klonerne blev dyrket i X-vivo 15 (BioWhittaker) suppleret med 5% varmeinaktiveret poolet humant serum (BioWhittaker), penicillin (100 U /ml; BioWhittaker), streptomycin (50 mg /ml; BioWhittaker), og IL-2 (250 IE /ml; Proleukine, Novartis). Kloner blev restimuleret hver 15-21 dage med phytohæmagglutinin (PHA) (0,5 ug /ml; Sigma-Aldrich) og bestrålet allogen PBMC

CD4

+ T-cellekloner stimulation assay

CD4

+ T-celler (10

4 /brønd) blev dyrket i tre eksemplarer i 96-U bundplader i nærvær af bestrålede LCL (5 x 10

4 /brønd), eller bestrålet autologe eller HLA-DRβ3 * 02 matchede PBMC (10

5 /brønd) som APC pulseret med CEA

177-189 /355-367 peptid (10 ug /ml), eller det oprensede CEA-protein (30 ug /ml, BiosPacific) eller normal human IgG (30 pg /ml, Venimmun N, Aventis Behring), som negativ kontrol. I inhiberingseksperimenter følgende monoklonale antistoffer (mAb’er) (Beckton Dickinson) blev anvendt: anti-HLA-DR (100 ng /ml), anti-HLA-DP (3 ug /ml) og anti-HLA-DQ (125 ng /ml). I peptid titreringsforsøg blev følgende koncentrationer af peptid tilsat: 20-10-5-1-0,5-0,1-0,05-0,01 og 0,005 ug /ml. I forsøgene med immunmodulerende cytokiner, rekombinant human IL-12 og /eller IL-27 (R IL-27, som enkeltstof (0,01-1-10-100 ng /ml); kombineret IL-12 og IL-27-behandling (5 ng /ml + 100 ng /ml). Efter 48 timer blev supernatanten fra hver brønd fjernet og puljet for cytokiner ‘påvisning ved ELISA, ifølge producentens anvisninger: GM-CSF (følsomhed tærskel: 31,25 pg /ml) og transformerende vækstfaktor (TGF) -β1 ( sensitivitetstærskel: 62,5 pg /ml) (Biosource International Inc.); IFN-γ, IL-5 og IL-13 (følsomhed tærskel: 15,6 pg /ml) (Mabtech) og IL-17 (eBioscience) (følsomhed tærskel: 7,8 pg /ml). IFN-γ, tumornekrosefaktor (TNF) -α, IL-10, IL-4, IL-5 og IL-2 release blev også bestemt ved hjælp af cytometrisk Beads Array (CBA) Humant Th1-Th2-cytokiner Kit (følsomhed tærskel :. 20 pg /ml), (Becton Dickinson), ved at følge producentens instruktioner

Kortsigtede kultur og cytokinfrigørelse assay

Oprenset CD4

+ T-celler blev stimuleret én gang

in vitro

i nærvær af CEA-peptider som beskrevet tidligere [3]. Kort fortalt CD4

+ T-celler (3 x 10

4 /brønd), oprenset fra total PBMC ved magnetiske perler (Miltenyi Biotec), blev udpladet i plader med 96 brønde i fem gentagelser for hver tilstand og dyrket i X -VIVO 15 suppleret med penicillin (100 U /ml), streptomycin (50 mg /ml) og 3% varmeinaktiveret poolet humant serum (vævskulturmedium, TCM), i nærvær af bestrålede CD4

+ – depleteret PBMC som APC, ved en CD4

+: APC-forhold på 1:03. Stimuli var: PHA (10 pg /ml; Sigma-Aldrich), som positiv kontrol; CD4

+ T-celler i nærvær af APC alene, som baseline (blind); og hvert enkelt peptid (10 ug /ml). Rekombinant human IL-12 (5 ng /ml) og IL-27 (100 ng /ml) blev tilsat hvor det er angivet. På dag 7, var halvdelen medium fra hver brønd fjernet og genopfyldes med frisk TCM indeholdende IL-2 (25 IU /ml) og IL-12 og IL-27 er angivet, uden yderligere antigenstimulering. På dag 14 blev supernatanten opsamlet til IFN-γ, IL-5, IL-13 og GM-CSF-frigivelse ved hjælp af ELISA, som beskrevet ovenfor.

Flowcytometri

cytofluorimetrisk analyser blev udført på en FACSCalibur og analyseret ved anvendelse af FlowJo software (Tree Star, Inc.). Følgende antistoffer blev anvendt: anti-CD3-APC, anti-CD4-PerCP, anti-CCR4-PE, anti-CCR5-FITC (Pharmingen) og anti-CRTH2-PE (Miltenyi Biotec). TCRVβ udtryk blev bestemt med IO Test Beta Mark kit (Immunotech), efter fabrikantens anvisninger.

Resultater

Karakterisering af CEA

177-189 /355-367 specifikke Th2-cytokiner producerende CD4

+ T-cellekloner

Vi har tidligere rapporteret, at PC-patienter har en Th2 skew i anti-CEA CD4

+ T-celle immunitet og samtidig opretholde en intakt repertoire af antivirale Th1-celler [3 ]. For bedre at karakterisere funktion af denne anti-CEA respons vi klonet ved at begrænse fortynding CEA

177-189 /355-367 specifikke polyklonale CD4

+ T celler fra pt # 15, opnået efter en

in vitro

kortfristet restimulering af CD4

+ T-celler med autologe APC pulseret med det relevante peptid; en analyse, som vi tidligere viste ikke at favorisere

in vitro

priming [15]. Polyklonale celler produceret høje niveauer af IL-5 og meget lidt af GM-CSF, men ingen IFN-γ [3], hvilket antyder tilstedeværelsen af ​​

in vivo

primet CD4

+ T-celler med Th2 funktioner. To kloner blev opnået, som udtrykte den samme T-celle receptor (TCR) Vp-kæde,

dvs

Vβ17 (fig. 1 E), og derfor vi brugte dem ligegyldigt i de følgende forsøg er

bona fide

den samme klon.

Profil af cytokin udskilt (A)

. CD4

+ T-celler blev dyrket med bestrålet APC i nærvær eller fravær af det relevante peptid i en 2-dages stimulation assay og koncentrationen af ​​de angivne cytokiner i supernatanterne blev bestemt enten ved CBA (øvre panel) eller ELISA (nederste felt). De data er repræsentative for mindst seks eksperimenter; til ELISA assays, data er gennemsnit af dobbeltbestemmelse ± SD.

HLA begrænsning (B)

. CD4

+ T-celler blev dyrket med bestrålet autolog PBMC eller HLA-DR matchede LCL, som anført, i nærvær eller fravær af det relevante peptid (10 ug /ml) og i fravær eller nærvær af anti-HLA -DR, anti-HLA-DP og anti-HLA-DQ-mAb’er: efter 2 dage IL-5 blev testet. Øvre panel:% inhibering blev beregnet baseret på IL-5-sekretion med CD4

+ T-celler i nærvær af det relevante peptid (2 ng /ml mere end 0 ng /ml baggrundsniveauet). Dataene er repræsentative for to (øvre panel) og fire (nedre felt) eksperimenter og er gennemsnit af dobbeltbestemmelse ± SD. Responser signifikant højere end emnerne (

dvs.

, de basale niveauer af cytokiner sekretion fra CD4

+ T-celler i nærvær af LCL kun) er angivet som: ***, p p 0,05; ***, P 0,001 (bestemt af uparret ensidigt Students t-test).

TCRVβ udtryk (E)

. Testen blev udført med IO Test Beta Mark kit. Kvadranter blev sat baseret på isotypekontrol farvning.

Surface udtryk for Th2 (CRTH2 og CCR4) og Th1 (CCR5) markører (F)

. Fyldte histogrammer repræsenterer isotypekontroller; åbne histogrammer prøver farvet med de angivne markører.

karakteriseringen af ​​CEA

177-189 /355-367 specifik CD4

+ T-kloner er afbildet i figur 1. CD4

+ T-cellekloner, der er fremstillet hovedsageligt IL-5, IL-13 og GM-CSF, mens de frigives lav mængde IL-4, og IFN-γ og ingen IL-2, TNF-α, TGF-β1, IL-10 eller IL-17 (fig. 1A). Selvom cellerne producerer lidt mængde af IL-4, dette mønster af cytokin sekretion er i overensstemmelse med en Th2 polarisering.

For at identificere begrænsningen element vi først testet anerkendelse af CD4

+ T-celler af peptid indlæst autolog APC i fravær eller i nærvær af anti-HLA-DR, anti-HLA-DP og anti-HLA-DQ mAb’er. Som vist i fig. 1B (øvre panel), tilsætning af anti-DR mAb inhiberede (65,5%) IL-5-produktion af CD4

+ T-celler, hvilket viser, at et HLA-DR-molekyle præsenteret peptidet. For at identificere HLA-DR præsentere allel, blev cellerne derefter udfordret med det relevante peptid i nærvær af LCL, der udtrykker forskellige kombinationer af HLA-DRβ1, p3 og p4 alleler udtrykt af patienten (angivet i fig. 1 B) og testet for IL-5 release. Som vist i fig. 1B (nederste felt), CD4

+ T-celler genkendte peptidet i association med HLA-DRβ3 * 02, som er den allel delt mellem patienten og de to præsentere LCL (BM21 og SKP).

vi udførte også peptid titreringskurve hvori CD4

+ T-celler blev udfordret med stigende koncentration af det relevante peptid (fig. 1C). Forsøgene indikerede ekspression ved klonen af ​​en meget lav affinitet TCR.

Vi har tidligere vist, at CEA-sekvens gentages ved positionerne 177-189 og 355-367 indeholder en

in vitro

naturligt processerede epitop præsenteret i association med flere HLA-DR alleler [16]. For at bekræfte disse data blev CD4

+ T-cellekloner udfordret med CEA-proteinet eller normal human IgG, som en negativ kontrol, og undersøgt for IL-13 release. Som vist i fig. 1D, CD4

+ T-celler specifikt produceret IL-13 i nærvær af peptidet og, vigtigst, i nærvær af CEA men ikke af kontrol-protein (

dvs.

, humant IgG), viser, at selv om CEA

177-189 /355-367 specifik CD4

+ T-celle-kloner bære en lav affinitet TCR de anerkender den indfødte epitop.

Endelig, for at kontrollere, om Th2 cytokin profil korreleret med de fænotypiske markører af Th1 og Th2-celler, blev klonerne undersøges for ekspression af CCR5, der fortrinsvis udtrykkes af Th1-celler [17] og CRTH2 og CCR4, hvis ekspression karakteriserer Th2-celler [17], [18]. Som forventet ud fra cytokinprofilen, CD4

+ T-celler udtrykt på deres overflade både CRTH2 og CCR4 mens CCR5 ekspression var til stede (fig. 1F).

kombinerede IL-27 og IL-12-behandling inhiberer sekretion af Th2-cytokiner og stimulerer IFN-γ-produktion af CEA specifikke CD4

+ T-celler

Vi næste testede mulighed for at graduere polarisationen af ​​CEA

177-189 /355-367-specifikke Th2 celler ved de immunmodulerende cytokiner IL-27 og IL-12.

til dette formål vi først evalueret effekten af ​​stigende koncentrationer af IL-27 eller IL-12, som enkelte agenter, om produktion af CD4

+ T-celler fra Th1- og Th2-cytokiner i nærvær af det relevante peptid. Tilsætningen af ​​IL-27 faldt på en dosisafhængig-måde IL-5 og IL-13 produktion, mens der ikke blev observeret nogen effekt for IL-4 og IFN-γ (fig. 2A). Tilsætningen af ​​IL-12 nåede sit plateau effekt allerede ved en dosis på 5 ng /ml (Fig 2B.): IL-5 produktion faldt også i nærvær af IL-12, mens på forskel med IL-27, er virkningen på IL-13 var marginal som på IL-4. Vigtigt er det, og ved forskel med IL-27, IFN-γ-produktion blev kraftigt forøget (fig. 2B). Disse data viser, at begge cytokiner påvirker effektorfunktion af CEA-specifikke CD4

+ T-cellekloner, men hverken IL-27 eller IL-12, som enkelte midler, var optimale ved modulering deres Th polarisering.

(A).

CD4

+ T-celler blev dyrket med det relevante peptid og bestrålet LCL som APC i nærvær af stigende koncentrationer af IL-27 (0-0,1-1-10- 100 ng /ml); efter 2 dage cytokin frigivelse blev evalueret af CBA (IL-5 IL-4, og IFN-γ) eller ELISA (IL-13). Dataene for IL-13 er gennemsnit af dobbeltbestemmelse ± SD.

(B).

CD4

+ T-celler blev dyrket og testet som beskrevet ovenfor, i nærværelse af stigende koncentrationer af IL-12 (0-5-20 ng /ml). Det basale niveau af cytokiner sekretion af CD4

+ T-celler i nærvær af LCL kun blev subtraheret fra prøveværdier og blev omfattet mellem 0 og 0,018 ng /ml. Dataene er repræsentative for mindst tre forsøg.

andet, vi evaluerede virkningen af ​​den kombinerede behandling med de to cytokiner (Fig. 3). Når de anvendes ved 5 ng /ml, IL-12, som et enkelt middel, induceret 61% inhibering af IL-5 og havde ingen virkning på IL-13 og GM-CSF, mens IFN-γ produktion havde næsten en 10-dobling . IL-27 behandling alene ved den højeste koncentration viste 78%, 30% og 53% inhibering af IL-5, IL-13 og GM-CSF, henholdsvis; mens kun 1,4 gange stigning i IFN-γ-produktion. Ved anvendelse i kombination til de bedste koncentrationer, blev en synergistisk effekt observeret i inhibering af IL-5 (91%) og IL-13 (48%), mens, som forventet ud fra resultaterne af de enkelte midler, GM-CSF-sekretion blev ikke yderligere inhiberet og IFN-γ-produktion blev ikke yderligere forøget.

CD4

+ T-celler blev dyrket med det relevante peptid i fravær (basal) eller i nærvær af IL-12 (5 ng /ml), som enkeltstof; eller IL-27 (100 ng /ml), som enkeltstof; eller kombineret IL-12 og IL-27 i en 2-dages stimulation assay og derefter testet for cytokinfrigørelse fra CBA (IL-5 og IFN-γ) eller ELISA (IL-13 og GM-CSF). Dataene for IL-13 og GM-CSF er gennemsnit af dobbeltbestemmelse ± SD. Det basale niveau af cytokiner sekretion af CD4

+ T-celler i nærvær af LCL kun blev subtraheret fra prøveværdier og blev omfattet mellem 0 og 0,006 ng /ml. Dataene er repræsentative for fem eksperimenter.

Modulation af Th2 polarisering af IL-12 og IL-27 varer efter cytokiner fjernelse

For at kontrollere, om modulation af Th2 polarisering opnået ved kombineret behandling med IL-12 og IL-27 var stabilt, vi designet et eksperiment, hvor CEA-specifikke CD4

+ T-celler blev først stimuleret med det relevante peptid i fravær eller i nærvær af IL-12 og IL- 27 (5 og 100 ng /ml, henholdsvis). For det andet blev celler stimuleret i fravær af de cytokiner holdt i kultur i 14 dage i TCM plus IL-2 og anvendt som kontroller. Celler behandlet med cytokiner blev opdelt i to portioner og dyrket under forskellige betingelser for de følgende 14 dage: i én betingelse cytokinerne blev fjernet efter 2 dage, og cellerne dyrket som kontrollerne i TCM plus IL-2, i den anden betingelse, cytokiner blev holdt i kultur hele tiden og udskiftes hver to til tre dage. På dag 14 blev celler fra hver af de tre betingelser testet i en 2-dages stimulation assay med det relevante peptid og cytokinfrigørelse testet. De opnåede resultater er vist i figur 4. Kontrolceller bekræftede produktionen af ​​IL-5, IL-13 og ingen IFN-γ, mens celler holdes i kultur kontinuerligt med cytokinerne bekræftet 98% og 74% inhibering af IL-5 og IL- 13 produktion, henholdsvis og en 11-dobling for IFN-γ. Vigtigt er det, celler, hvori cytokiner blev fjernet efter 2 dages dyrkning viste stadig 70% og 47% inhibering i IL-5 og IL-13 produktion henholdsvis og en 5 gange stigning i IFN-γ frigivelse.

(A)

. CD4

+ T-celler blev dyrket med det relevante peptid og enten venstre ubehandlede (peptid) eller behandlet i 2 dage med kombineret IL-12 (5 ng /ml) og IL-27 (100 ng /ml) og derefter vasket og venstre ubehandlet (IL-12 + IL-27 (2-dage)) eller behandles kontinuerligt med IL-12 og IL-27 ved de samme doser i 2 uger (IL-12 + IL-27 (14 dage)). På dag 14 blev celler testet i nærvær eller fravær af det relevante peptid og den specifikke IL-5, IL-13 og IFN-γ-frigivelse i den testet ved ELISA supernatant. Dataene er gennemsnit af dobbeltbestemmelse ± SD. Det basale niveau af cytokiner sekretion af CD4

+ T-celler i nærvær af LCL kun blev subtraheret fra prøveværdier, og var som følger: IL-5 (0,093 ± 0,006 ng /ml), IL-13 (0468 ± 0028 ng /ml) og IFN-γ (0 ng /ml). Dataene er repræsentative for fire eksperimenter. (

B

). Overfladeekspression af CRTH2, CCR4 CCR5 af CD4

+ T-celler efter behandling med kombineret IL-12 + IL-27. Analyse blev udført på celler behandlet i 2 dage og derefter efterladt ubehandlet i endnu en uge. Fyldte histogrammer repræsenterer isotypekontroller; åbne histogrammer prøver farvet med de angivne markører.

For at kontrollere, om den kombinerede behandling også påvirket Th2 overfladen fænotype, CD4

+ T-celler, som var blevet re-stimuleret i overværelse af cytokiner i 2 dage og derefter dyrket i yderligere syv dage i fravær af de cytokiner, blev testet for ekspression af CRTH2, CCR4 og CCR5. Som vist i figur 4B, cellerne, og samtidig opretholde CRTH2 og CCR4 som i fravær af behandling (fig. 1F), erhvervet ekspressionen af ​​CCR5.

Tilsammen viser disse resultater, at modulering af Th2 polarisering af CEA -specifikke CD4

+ T celle kloner opnået med den kombinerede behandling er varig, om end med reduceret effektivitet, selv efter cytokiner fjernelse og er associeret med funktionelle og fænotypiske træk Th0 eller begge Th1 og Th2-celler.

IL-12 og IL-27 kombination øger Th1 og modulerer Th2 polarisering af spontan anti-CEA CD4

+ T-celle responser

for at verificere effekten af ​​kombineret IL-12 og IL-27 behandling på polarisering af CEA-specifikke CD4

+ T-celler i en mere fysiologisk miljø og på polyklonale plan, CD4

+ T-celler fra patient (pt # 43) og normal donor (ND # 11) blev testet i et 14-dage

in vitro

re-stimulation assay for anerkendelse af de relevante peptider i fravær eller i tilstedeværelsen af ​​de to immunmodulerende cytokiner (figur 5). Som tidligere rapporteret i [3], i mangel af immunmodulerende cytokiner CD4

+ T celler fra pt # 43 producerede IL-5 i nærvær af CEA

425-437; IL-13 i tilstedeværelse af CEA

568-582; GM-CSF i tilstedeværelse af CEA

568-582 og IFN-γ i tilstedeværelse af CEA

568-582 og, om end på et meget lavere, men betydeligt niveau, CEA

177-189 /355 -367 (fig. 5,

venstre panel

s, grå søjler

). Kombinationen af ​​IL-12 og IL-27 næsten afskaffet IL-5 (99% inhibering) og IL-13 (76% inhibering), mens induceret

de novo

IFN-γ-sekretion i nærvær af CEA

425-437, forstærkede (9 gange stigning) IFN-γ-produktion i nærværelse af CEA

177-189 /355-367 og bekræftet IFN-γ mens stærkt reduceret IL-13 (98% inhibering) og GM CSF (80% hæmning) produktion i tilstedeværelse af CEA

568-582 (fig. 5,

venstre panel

s, sorte bjælker

). Som tidligere rapporteret [3], i fravær af de immunmodulerende cytokiner CD4

+ T-celler fra ND # 11 viste signifikant proliferation [3] og meget lidt mængde IFN-γ-sekretion i nærvær af CEA

99- 111, mens der blev observeret nogen signifikant produktion af IL-5 og GM-CSF i tilstedeværelsen af ​​peptid (fig. 5,

højre panel

s, grå søjler

). IL-13 frigivelse blev ikke testet. stærkt forøget Cytokine behandling (23-dobling) IFN-γ frigivelse mod CEA

99-111, mens, som forventet, sås ingen effekt på IL-5 og GM-CSF-produktion (fig. 5,

højre panel

s, sorte bjælker

). I begge tilfælde er de to cytokiner induceret modulering af Th2 eller amplifikation af Th1-reaktioner, der var allerede til stede, selv ved meget lavt niveau, i fravær af cytokiner kombination, mens der ikke var tegn på

de-novo

særlig anerkendelse af CEA-peptider.

CD4

+ T celler fra pt # 43 og ND # 11 blev dyrket i fem gentagelser, som beskrevet i materialer og metoder, med lydhør CEA peptider, i fravær ( grå søjler) eller i nærvær (sorte søjler) af den kombinerede behandling med IL-12 (5 ng /ml) plus IL-27 (100 ng /ml). Efter 14 dage, IL-5, IL-13, GM-CSF og IFN-γ frigivelse blev testet ved ELISA. Indberettede data er midler til dobbeltbestemmelse ± SD. Stiplede linjer identificere det basale niveau af cytokinsekretion i nærvær af APC alene. n.d. = Ikke bestemt.

Kollektivt antyder disse resultater at IL-12 og IL-27 fremmer funktionel modulering af Th2-typen og amplifikation af allerede eksisterende Th1-type anti-CEA respons.

diskussion

i den foreliggende undersøgelse rapporterer vi, at sammenslutningen af ​​de immunmodulerende cytokiner IL-12 og IL-27 er i stand til at modulere den funktionelle polarisering af anti-CEA Th2 CD4

+ T-celler fra PC patienter og øge allerede eksisterende Th1 typen anti-CEA CD4

+ T-celler.

Vi viser, at behandling med IL-27 som et enkelt middel hæmmede både IL-5 og IL-13 release ved CEA-specifikke Th2-celler. Dette bekræfter i det menneskelige system en tidligere rapport, der er beskrevet IL-27 som i stand til at undertrykke Th2-cytokiner produktion fra

in vitro

polariseret muse Th2 celler [12]; men, ved forskel med denne rapport, i vores system, hvor vi beskæftiger os med

bona fide in vivo

polariseret CD4

+ T-celler IL-27 havde ingen effekt på IFN-γ-sekretion. Vigtigt er det, vi afslørede også en ny funktion for IL-27, der er inhiberingen af ​​GM-CSF-produktion. Når IL-12 blev anvendt som et enkelt middel, det kraftigt forbedret IFN-γ produktion, mens kun havde en marginal effekt i at undertrykke frigivelsen af ​​Th2 cytokiner og af IL-13 i særdeleshed og ingen effekt på GM-CSF. Dette er også til forskel med tidligere rapporter [7], [8], hvor IL-12 blev vist at vende polarisering af humant allergen specifikke Th2-celler ved at inducere IFN-γ og inhibering af IL-4-produktion. Faktisk, i tilfælde af vore kloner IL-4, som dog ikke blev produceret i høje mængder, blev ikke inhiberet, hverken af ​​IL-27 eller IL-12. Den eneste Th2 cytokin påvirket af IL-12 var IL-5; denne funktion blev også tidligere rapporteret for T-celle-kloner opnået fra bronchoalveolær lavage af astmatiske patienter [19].

Tilsammen viser vi, at IL-12 og IL-27 i vores system har ikke-redundante roller i modulering af polarisering af etablerede CEA-specifikke Th2 CD4

+ T-celler, og at modulering af funktionelle og fænotypiske Th2 polarisering af anti-tumor CD4

+ effektorer i en Th0 typen opnåedes kun ved tilstedeværelsen af ​​den kombinerede synergistiske behandling med de to cytokiner. Modulation af cytokinerne produktion var, i det mindste i tilfælde af klonerne, for det meste funktionelle med induktionen af ​​en temmelig ejendommelig fænotype hvor CCR4, CRTH2 og CCR5 ekspression sameksisteret (

dvs.

, ikke typiske for enten Th1 eller Th0 celler). Indledende forsøg (data ikke vist), hvor vi evaluerede cytokiner produktion på enkelt celle niveau ved intracellulær farvning, viste, at:

i

) IL-27 alene påvirkede ikke procentdelen af ​​IL-5 og IL