PLoS ONE: Nrf2 Pathway Regulerer Multidrug-Resistance-associeret protein 1 i småcellet Cancer

Abstrakt

Selvom multidrug-resistens-associerede protein-1 (MRP1) er en stor bidragyder til multi-resistens ( MDR), stadig uklart reguleringsmekanismen af ​​MRP1. Nrf2 er en transkriptionsfaktor som regulerer cellulær forsvarsrespons gennem antioxidant responselementer (Ares) i normale væv. Senest har Nrf2 dukket op som en vigtig bidragyder til kemo-resistens i tumorvæv. I nærværende undersøgelse blev rollen som Nrf2-ARE vej om regulering af MRP1 undersøgt. Sammenlignet med H69 lunge kræftceller, H69AR celler med MDR viste signifikant højere Nrf2-ER pathway aktivitet og udtryk for MRP1 så godt. Da Nrf2 blev slået ned i H69AR celler, MRP1 udtryk faldt tilsvarende. De nævnte H69AR celler med reduceret Nrf2 niveau gendannet følsomhed over for kemo-lægemidler. For at undersøge, hvordan Nrf2-ARE vej regulerer MRP1 blev promotoren for MRP1 gen søges, og to formodede ARE’er-ARE1 og ARE2-fundet. Brug af reportergen og chip assay både ARE1 og ARE2 viste respons på og interaktion med Nrf2. I 40 tilfælde af kræft væv, blev udtryk for Nrf2 og MRP1 målt ved immunhistokemisk (IHC). Da de kvantitative data for IHC angivet, både Nrf2 og MRP1 viste signifikant højere ekspression i tumorvæv end tilstødende ikke-tumorvæv. Og vigtigere, korrelationen analyse af de to gener bevist, at deres udtryk var korrelationsmaalinger. Tilsammen, specialer data foreslog, at Nrf2-ARE vej er nødvendig for de lovgivningsmæssige udtryk for MRP1 og impliceret Nrf2 som en ny terapeutisk mål for MDR

Henvisning:. Ji L, Li H, Gao P, Shang G, Zhang DD Zhang N, et al. (2013) Nrf2 Pathway Regulerer Multidrug-Resistance-associeret protein 1 i småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (5): e63404. doi: 10,1371 /journal.pone.0063404

Redaktør: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-Universitetet i München, Tyskland

Modtaget: Februar 3, 2013; Accepteret: April 2, 2013; Udgivet: 7. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Ji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering forudsat af Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (11ZR1402400 til TJ), https://www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm; National Natural Science Foundation of China (30900538 til HL), https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm; National Institute of Environmental Health (2R01 ES015010 til DDZ), https://www.niehs.nih.gov/; og National Cancer Institute (R01 CA154377 til DDZ), https://www.nci.cu.edu.eg/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

multiresistens (MDR) er en væsentlig hindring i behandlingen af ​​maligne carcinom. Det er et fænomen, hvor kræftceller udviser reduceret følsomhed over for en stor gruppe af ikke-relaterede lægemidler med forskellige ordninger for farmakologisk aktivitet, om det forekommer i primær terapi (iboende) eller erhverves under eller efter behandling [1]. Mekanistisk, kan modstanden fænomener forklares ved en række aspekter, som omfatter reduceret akkumulering grund af overekspression af transportproteiner, øget afgiftning, ændret mål og forringet apoptose pathway [2]. En af de mest undersøgte aspekter af MDR er reduktion af intracellulær akkumulering, hvori ATP bindende kassette (ABC) transportere udtrykt i plasmamembranen er berygtet mediatorer af MDR [3].

Multidrug-resistance- associerede proteints (MRPs) tilhører underfamilien C i ABC transportør superfamilien (ABCC). I menneskelige, er MRP familien består af flere medlemmer (MRP1-MRP9), hvoraf, MRP1 spiller en meget vigtig rolle i MDR. Som en af ​​lægemidlet transportere ABCC proteiner blev MRP1 først klonet stærkt over-udtrykt i en doxorubicin-udvalgt multilægemiddelresistent human lungecarcinom-cellelinje H69AR [4]. I tumorceller, kan den 190 kDa MRP1 bibringe resistens over for ikke blot doxorubicin, men også mange andre udbredte antineoplastiske lægemiddel, såsom methotrexat (MTX), daunorubicin, vincristin og etoposid [5].

Selvom MRP1 har dukket op som en vigtig bidragyder til kemoresistens, har den molekylære mekanisme for fremkaldelse af MRP1 ikke afklaret. Adskillige regulatoriske elementer er allerede blevet identificeret til at styre ekspression og inducerbarhed af MRPs [6], [7], [8]. Der er imidlertid betydelige beviser, der indikerer induktionen af ​​fase II-enzymer og MRPs er ens. [9], [10], [11]. Som induktion af fase II-enzymer er primært medieret gennem antioxidant respons elementer (ARE eller EpREs) [12], det tyder på, at den mest sandsynlige kandidat til en samordnet regulering af ekspressionen af ​​MRPs er også ER [13], som har en fælles 5 ‘- (G /A) TGACnnnGC (G./A) -3’ motiv [14]. For nylig, i musen MRP2 [15], [16], Mrp3 og Mrp4 gen [16], ER-lignende sekvenser blev identificeret, hvilket tyder på mulige rolle ARE motiv i de lovgivningsmæssige udtryk for MRP1. For eksempel er både γ-GCS, den velkendte antioxidant enzym og MRP1 alle induceret af oxidativ stress [17]. Den viste, at ekspression af MRP1 kan opreguleres ved redox-aktive forbindelser, quercetin i MCF-7 celler [18]. Men den videre reportergenanalysen angivet, at en kandidat ER motiv placeret i den proksimale promotor af MRP1 genet syntes at være uden betydning for induktion. Senere, en formodet ER /AP-1-bindingssted -511 til -477 opstrøms for det transkriptionelle initieringssite i human MRP1 genet blev identificeret og fungerede som en transkriptionel enhancer [19]. Men det stadig ikke mediere induktion af et luciferasereportergen ved β-naphthoflavon behandling, hvilket antyder, at der kan en anden ER (er) findes [19]. Selv om undersøgelsen under anvendelse Nrf2 vildtype og knockout mus fibroblaster bekræftet, at Nrf2 er påkrævet for den konstitutive og inducerbare ekspression af MRP1 [20], hvor Nrf2 medierer transkriptionel aktivering af MRP1 fortsat uklart, fordi det nøjagtige ARE (er) ikke blev identificeret endnu.

Nrf2 blev identificeret som den vigtigste transskription faktor, der medierer ARE-drevet transskription [12]. Den regulerer antioxidant svar ved at indføre ekspression af gener, der bærer en er i deres regulatoriske regioner, såsom NQO1, GCS, og HO-1 [21], [22], [23], det er negativt reguleret af Kelch-lignende ECH -associeret protein 1 (Keap 1), et substrat adapter til Cul3-afhængige E3 ubiquitinligase kompleks [24]. Aktivering af Nrf2 vej komponerer et cellulært beskyttende system, der fremmer celle overlevelse under ugunstige miljøer [25], [26]. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, at konstitutivt højt Nrf2 fremmer kræft dannelse og bidrager til kemoresistens [27], [28], [29], [30], som kaldes mørke side af Nrf2 vej. Nedregulering af Nrf2 sensibiliserer celler til kemoterapeutiske midler, hvorimod opregulering øger modstanden i forskellige cancerceller [31], [32], [33], [34]. I yderligere støtte fra en rolle for Nrf2 i kemoresistens, er udtryk for Nrf2 i cancerceller steg i erhvervelse af resistens [35], [36]. Kollektivt, disse resultater, at Nrf2 bidrager til kemoresistens observeret i mange typer af cancer. Men hvordan Nrf2 spiller en sådan rolle er stadig ukendt. For eksempel, som molekylær der er stramt reguleret af Nrf2 vej er ansvarlig for kemoresistens? Er MRP1 en af ​​kandidaterne?

I dette studie undersøgte vi regulative rolle Nrf2 på MRP1 ekspression ikke kun i dyrket celle niveau, men også i kræftpatienters væv. Vi demonstrerede MRP1 er en af ​​Nrf2 nedstrøms gener, som vi bekræftet to ER motiver i promotorregionen af ​​MRP1 genet. Desuden er der en høj korrelation mellem MRP1 og Nrf2 ekspression i forskellige typer af maligne tumorer. I et ord, som mere og mere opmærksomhed blev udbetalt til den rolle, Nrf2 i kemoresistens, vores undersøgelse viste den detaljerede mekanisme for, hvordan Nrf2 spiller sin negativ rolle.

Materialer og metoder

Etik erklæring

tilladelse til at bruge de vævssnit til forskningsformål blev opnået og godkendt af den etiske komité fra Shanghai Medical College, Fudan University, Kina, og en skriftlig samtykkeerklæring blev opnået fra alle patienter.

reagenser

Polyklonale antistoffer, herunder anti-Nrf2, MRP1, MRP2, tubulin, β-actin blev alle indkøbt fra Santa Cruz Inc. (CA, USA). Tert.butylhydroquinon (tBHQ), sulforaphane (SFN), og alle kemikalier, herunder cisplatin, doxorubicin og etoposid var køb fra Sigma Co. (St. Louis, MO, USA). Dual-Luciferase Reporter Assay System blev indkøbt fra Promega (Madison, WI, USA). Alle reagenser var analytisk kvalitet.

Cellelinier, cellekultur og celleviabilitetstest

småcellet lungecancer-cellelinie H69, multiresistente småcellet lungecancer-cellelinie H69AR, og MDA-MB -231-cellelinie blev fremskaffet fra ATCC (Manassas, VA, USA). H69 og H69AR celler blev opretholdt i ATCC-formuleret RPMI-1640-medium, suppleret med 10% og 20% ​​(volumen /volumen) føtalt bovint serum henholdsvis. MDA-MB-231 blev dyrket i ATCC-formuleret Leibovitz L-15 medium med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum. Alle kulturer blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære. Cellelevedygtighed blev målt ved 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay baseret på den funktionelle ændring af mitokondrier under celledød.

Rekombinant DNA

Et par primere designet indeholdende Xhol og HindIII sider for at finde et 992 bp promotor-regionen, fra -817 til +175 med nummerering i forhold til transkriptionsstartsitet (+1), af den humane MRP1 genet fra humant genomisk DNA ved PCR. Yderligere fire par af primere blev udformet til at klone de to mulige er elementer i promotorregionen af ​​MRP1 genet og deres mutanter i overensstemmelse hermed. De amplificerede produkter blev oprenset og fordøjet med restriktionsendonuklease, og derefter klonet ind i pGL3-basic (Promega, Madison, WI). Sekvenserne af primere blev opført i tabel 1.

siRNA transfektion og luciferasereportergen assay

Nrf2 siRNA og Hiperfect transfektionsreagens blev købt fra Qiagen (Valencia, CA) og transfektion af Nrf2 siRNA blev udført ifølge producentens anvisninger. For luciferasereportergen assay blev cellerne transficeret med luciferase- reporter plasmider til MRP1 genpromotor, Ares, mutanter og Renilla luciferase, sammen med en ekspressionsvektor for HA-Nrf2. Firefly og renilla luciferaseaktiviteter blev målt under anvendelse af en dual-luciferasereportergen assaysystem (Promega, Madison, WI) og analyseret på en GloMax 20/20 luminometer (Promega, Madison, WI).

chromatin immunoprecipitation (chip )

chip analyse blev udført i overensstemmelse med protokoller, som Upstate (en del af Millipore, MA). Kort fortalt, MDA-MB-231 celler eller H69AR celler eller H69-celler (ca. 4 x 10

7) blev tværbundet med formaldehyd, opsamlet i PBS, resuspenderes i SDS lysis buffer og sonikeret på is. Lysaterne blev derefter fortyndet ved chip fortyndingspuffer, præ-clearet med protein Agarose, og derefter inkuberet med angivne antistoffer (4 ug /prøve) natten over. Immunkomplekserne blev opsamlet med protein A agarose, vasket og elueret. DNA-protein-tværbindinger blev vendt, og DNA blev udvundet. Relative mængder af DNA i komplekset blev kvantificeret ved real-time PCR under anvendelse LightCycler 480 DNA SYBR Green I kittet (Roche). Primere er vist i tabel 2 blev udformet ifølge ARE sekvenser i promotorområdet af MRP1 genet. Den bekræftede ER sekvens af NQO1 genet blev anvendt som positiv kontrol for Nrf2 interaktion og promotorsekvens af tubulin-genet som negativ kontrol. Chippen assayet blev gentaget 3 gange.

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR), immunblotassay

Når celler blev høstet, det totale RNA blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-opløsning ( Invitrogen, Carlsbad, CA). Lige store mængder af RNA (2 ug) blev revers-transkriberet under anvendelse af Transcriptor First Strand cDNA-syntese kit (Roche, IN, USA). De anvendte primere i den næste PCR-assayet blev opført i tabel 2. qPCR var som følger: en cyklus af indledende denaturering (95 ° C i 30 s), 40 amplifikationscykler (denaturering ved 95 ° C i 5 s, annealing ved 60 ° C i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 30 s), efterfulgt af en periode med køling (50 ° C i 5 s). Relativ mRNA-ekspression blev bestemt ved anvendelse af Rotor-Gene 3000, som anvender en modifikation af delta-delta Ct metode til at justere til amplifikation effektivitet mellem mål- og husholdningsgener. PCR-data blev udtrykt som relativ gange ændring af målgenet mellem behandlingsgrupper og kontrolgrupper. Cyklussen punkt (ep) værdier blev analyseret ved t-test for at bestemme en P-værdi.

I immunoblotassay blev celler homogeniseret i lysis smør (0,1 M Tris-buffer (pH 7,4), 0,1 mM EDTA) i nærvær af 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, og protease inhibitor cocktail (Roche, IN, USA). Den samme mængde prøve blev påsat i hver brønd af en 7,5% gel og underkastet SDS-PAGE. Geler blev overført til nitrocellulosemembran. Membranen blev derefter inkuberet med primære antistoffer til 4 ° C natten over mod Nrf2 (110 KD), MRP1 (190 KD), og MRP2 (~170 KD). Efter vask med TBS-T, blev membranen inkuberet med sekundært antistof mod kanin og mus IgG og signalerne blev visualiseret under anvendelse af ECL plus western blotting system. Alle eksperimenter er nævnt ovenfor blev udført tre gange, medmindre andet er angivet.

Patienter og immunhistokemisk analyse

Vævene (n = 40), herunder gastrisk cancer (n = 10), brystcancer (n = 10 ), blev tyktarmskræft (n = 10) og småcellet lungecancer (n = 10) opnået fra Institut for Patologi, Shanghai Huashan Hospital, Kina, inden 2007. Alle sager blev diagnosticeret med 2 patologer individuelt i en dobbeltblind måde . De paraffinsnit blev farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05 blev taget som signifikant forskel i alle tilfælde

Resultater Salg

I modsætning til H69-celler, H69AR celler har højere Nrf2. -aktivering og MRP1 ekspressionsniveauet

på basisniveauet, blev aktiveringen af ​​Nrf2 pathway sammenlignet mellem H69 og H69AR celler. Downstream gener af Nrf2, såsom NQO1, HO-1 og GST viste forøget mRNA-ekspression i H69AR celler, men der var ingen signifikant forskel i TXN mRNA-ekspression (figur 1, felt A, * P 0,05 over H69-celler). Interessant nok var en højere Nrf2 mRNA-niveau i H69AR celler end H69-celler, med ingen forskel i Keap1 genet (figur 1, felt A, * P 0,05 over H69-celler). Både MRP1 og MRP2 genet viste højere mRNA-niveauet i H69AR celler, især MRP1 havde mere end 70 gange i H69AR celler til H69-celler (figur 1, felt A, * P 0,05 over H69-celler). Næste proteinniveauet af Nrf2 blev målt i de to cellelinier. I overensstemmelse med ændringerne i mRNA-niveau, H69AR celler havde højere Nrf2 pathway aktivering end H69-celler (figur 1, panel B) i proteinniveau. Desuden MRP1 og MRP2 viste også øget ekspression i H69AR celler (figur 1, felt B). Interessant nok større negativ regulator af Nrf2, Keap1 viste ingen forskel mellem de to cellelinjer (figur 1, felt B). I betragtning af de vigtige roller, MRP1 og MRP2 spiller, H69AR celler har multi-kemo medicin modstand på grund af det høje niveau af MRP1 og MRP2. Som vores MTT data viste, H69AR celler havde mere levedygtighed sats med kemo medicin behandling, såsom Doxorubicin, cisplatin og etoposid (Figur 1, panel C, D og E, * P 0,05 vs. H69 celler).

(A) Relativ mRNA niveau af Nrf2, Keap1, MRP1, MRP2 sammen med NQO1, HO-1, GST og TXN blev sammenlignet i H69 og H69AR celler ved real-time RT-PCR ved hjælp af ΔΔCt metoden med GAPDH som en intern kontrol. Resultaterne blev udtrykt som middel ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (B) Protein niveau af Keap1, Nrf2, MRP1, MRP2 blev sammenlignet i H69 og H69AR celler ved Western blotting hjælp tubulin som intern kontrol. Eksperimenter blev udført tre gange og et repræsentativt immunoblot blev vist her. (C), (D) og (E) Levedygtigheden af ​​H69 og H69AR celler med behandling af Dox, cisplatin og etoposid i forskellige doser i 24 timer blev bestemt ved MTT-assayet. De eksperimentelle forskelle blev bestemt ved to-tailed t-test og p 0,05 blev taget som en signifikant forskel i alle tilfælde

Knockdown af Nrf2 fører til nedsat MRP1 udtryk og sensibiliserede H69AR celler til multi. -chemo narkotika

for at analysere reguleringen af ​​MRP1 af Nrf2 blev specifikke siRNA brugt til at banke ned Nrf2 udtryk. Eftersom dataene viste, blev ekspressionen af ​​Nrf2 reduceret mere end 50% i modsætning til den mock gruppe (figur 2, panel A). Mere vigtigt blev proteinniveauet af MRP1 også nedsættes tilsvarende (figur 2, panel A), hvilket betyder MRP1 kan reguleres ved Nrf2 pathway. Som H69AR viste multi-kemo lægemidler modstand, næste modstanden blev målt igen, når ekspression af Nrf2 blev slået ned. Som forventet H69AR celler genoprettet følsomhed over for alle de tre kemo lægemidler, herunder doxorubicin, cisplatin og etoposid, når det specifikke siRNA blev anvendt til at reducere ekspressionen af ​​Nrf2 (figur 2, panel B, C og D, * P 0,05 vs. mock gruppe). Kollektivt, disse data indikerede den mulige rolle af Nrf2 om regulering af MRP1 og bekræftede rolle Nrf2 i kemo-resistens.

(A) H69AR celler blev udført transfektion af Nrf2 siRNA (10 nM og 50 nM) til 72 timer. Protein ekspression af Nrf2 og MRP1 blev bestemt ved western blotting under anvendelse af β-actin som intern kontrol. Eksperimenter blev udført tre gange og et repræsentativt immunoblot blev vist her. (B), (C) og (D) H69AR celler blev underkastet knockdown af Nrf2 med siRNA transfektion. Otteogfyrre timer senere blev cellerne behandlet med Dox, cisplatin og etoposid i forskellige doser i yderligere 24 timer, og de blev derefter underkastet MTT-assay til måling af cellernes levedygtighed. De eksperimentelle forskelle blev bestemt ved to-halet t-test og p 0,05 blev taget som en væsentlig forskel i alle tilfælde

5′-flankerende region af det humane MRP1 genet indeholder to ER. sekvenser

for at bestemme tilstedeværelsen af ​​ARE-sekvensen i 5′-flankerende region af det humane MRP1 genet blev et 992-bp langt fragment klonet og sekventeret fra nukleotid -817 til +175 med nummerering i forhold til transkriptionen startsted (angivet som +1 i figur 3). Nukleotidsekvensen af ​​5′-flankerende region af det humane MRP1 genet blev vist i figur 3. transkriptionsstartstedet blev sat til at være ved 5′-enden af ​​MRP1 mRNA-sekvensen med den længste 5′-utranslaterede region, og blev lokaliseret 175 basepar opstrøms for translation start-site’t (angivet med fed skrift i figur 3). Et antal cis-virkende sekvenser, blev identificeret. Interessant, to ER-lignende sekvenser blev fundet i isolerede regioner: en på positionerne -499 til -490 (ARE-1, gTGActcaGC, med små bogstaver indikerer ikke-konserverede baser) og den anden i positioner -66 til -57 (ARE-2; gTGAgcggGC). De to er sekvenser var identiske med de tidligere rapporterede minimal ARE forstærker sekvens (a /g) TGA (C /T /G) nnnGC [37]. Nukleotiderne skal muteres blev fremhævet med fed kursiv i figur 3.

nucleotider blev nummereret i forhold til transkriptionsstartsitet (+1). Translationsinitieringskodonet (ATG) blev med fed skrift. Boxed region angivet ARE1 og ARE2 hhv. De nukleotider til være muteret i denne undersøgelse var i fed kursiv.

Nrf2-medieret induktion af MRP1 promotor-aktivitet afhænger både af ARE1 og ARE2

For at undersøge reaktion 5′ -flanking region MRP1 til Nrf2 blev dobbelt luciferasereportergenet assay udføres. For det første blev 992 bp fragment amplificeret ved PCR fra humant genomisk DNA med primere, der blev nævnt i tabel 1, og derefter blev PCR-produktet klonet i pGL3-basisk vektor og navngivne pGL3-wt. For det andet er baseret på pGL3-vægt, de to formodede ar samt muterede ARE’er blev forstærket og klonet ind pGL3-grundlæggende vektor, som blev navngivet pGL3-ARE1, pGL3-ARE2, pGL3-ΔARE1 og pGL3-ΔARE2 (De muterede nukleotider blev fremhævet i fed kursiv i tabel 1). Reporter assay viste, at Nrf2 inducerede promotoraktiviteten af ​​MRP1 gen efter co-transfektion af pGL3-wt med Nrf2 udtrykkende plasmid (figur 4, panel A, * P 0,05 versus kontrol). Det viste også, at induktion af MRP1 promotor-aktivitet var forbundet med de to formodede Ares, da begge af dem blev opreguleret ved overekspression af Nrf2. Desuden mutation af dem ablateret induktionen overensstemmelse hermed (figur 4, panel A, ** P 0,05 over for kontrol, *** P 0,05 versus kontrol). Imidlertid var der ingen signifikant forskel på induktion mellem de to ARE’er. Desuden NQO1 ER-Luc blev anvendt som en positiv kontrol for at sikre gyldigheden af ​​hele assay og immunoblot-assayet blev udført for at sikre, at overekspression af Nrf2 var helt tilsvarende (Figur 4, A, øvre panel).

(A) 231-celler blev transficeret med fem luciferase reporterkonstruktioner (wt-Luc, ARE1-Luc, ARE2-Luc, ΔARE1-Luc og ΔARE2-Luc), og promotorløse pGL3-basic (pGL3-Luc), NQO1-ARE-Luc og pRL-TK blev brugt som negativ kontrol, positiv kontrol og intern kontrol, hhv. De førnævnte plasmider blev co-transficeret med eller uden Nrf2-ekspressionsplasmid. Efter 48 timer blev cellerne høstet og luciferaseaktiviteter blev målt med en dual-luciferase-assaysystem (nederste panel). Dataene var middel ± SD af værdier fra tre uafhængige forsøg. Den samme mængde transfektion af Nrf2 var sikret ved Western Blot (øverste panel). (B) 231-celler blev behandlet med 40 pM tBHQ for det angivne tidspunkt, og derefter blev høstet at blive udsat for immun-blot at måle Nrf2 proteinniveauet. Eksperimenter blev udført tre gange og et repræsentativt immunoblot blev vist her. (C), (D), (E) og (F) 231-celler blev behandlet eller ikke med 40 pM tBHQ i 24 timer og blev tværbundet med formaldehyd. Sonikeret kromatin blev underkastet immunpræcipitation med antistoffer mod Nrf2 eller normal IgG. Præcipiteret DNA blev efterfulgt af realtime PCR-analyse med primere mod MRP1 ARE1 (panel C), MRP1 ARE2 (panel D), NQO1 ER (panel E) og tubulin-promotoren (felt F). Eksperimenter blev udført tre gange og en repræsentant for tre forsøg blev vist her.

Næste, for at bekræfte den sande binding af Nrf2 med de to formodede Ares, blev chip assay udført både i 231 celler og småcellet lungecancerceller. Ifølge immunblotassay af Nrf2 behandlet med tBHQ i 231-celler, den velkendte Nrf2 pathway inducer, en passende behandlingstid af tBHQ, blev 24 timer indstillet (figur 4, panel B). Så 231-celler (4 x 107) blev behandlet med 40 pM tBHQ i 24 timer, og derefter blev høstet til genstand for chip assay. Sammenlignet med den negative kontrol, bindingen med ARE1 af Nrf2 blev øget signifikant (figur 4, panel C, * P 0,05). Desuden behandling med tBHQ gjort bindende steget meget mere højere (Figur 4, panel C,

# P 0,05). Tilsvarende ARE2 viste også binding med Nrf2 med eller uden tBHQ behandling (figur 4, panel D, * P 0,05,

# P 0,05). Men bindingen af ​​Nrf2 med ARE2 var lavere end ARE1 i både basale niveau og tBHQ behandlingsniveau. Som et udtryk for Nrf2 var meget højere i H69AR celler end H69-celler (figur 1, panel B), vi næste udført en sammenlignende chipanalyse at teste om forøget Nrf2 i H69AR celler var bundet til ARE1 og ARE2 elementer i MRP1 promotoren. I overensstemmelse med vores forventning, bindingen med ARE1 af Nrf2 blev øget markant i H69AR celler sammenlignet med H69-celler (figur 5, panel A, * P 0,05). Lignende bindende resultater med ARE2 blev også fundet (figur 5, panel B, * P 0,05). Dette kan tyde på en molekylær forklaring på øget MRP1 udtryk i H69AR celler. Desuden binding af Nrf2 med ARE2 var lavere end ARE1 i både H69 og H69AR celler, som var i overensstemmelse med resultaterne i 231-celler. De positive og negative kontroller chip assay forsikre eksperimentet var troværdigt og dataene var faststof (Figur 4, panel E og F og figur 5, panel C og D). Kollektivt demonstrerede disse data, at de to formodede ar for MRP1 genpromotorregion var virkelige ARE’er der kunne reguleres af Nrf2.

H69 og H69AR celler blev tværbundet med formaldehyd. Sonikeret kromatin blev underkastet immunpræcipitation med antistoffer mod Nrf2 eller normal IgG. Præcipiteret DNA blev efterfulgt af realtime PCR-analyse med primere mod MRP1 ARE1 (panel A), MRP1 ARE2 (panel B), NQO1 ER (panel C) og tubulin-promotoren (felt D). Eksperimenter blev udført tre gange og en repræsentant for tre forsøg blev vist her.

Udtrykket af Nrf2 og MRP1 var korrelativ og højere i maligne tumorer end tilstødende ikke-tumorvæv

Helt , 40 tilfælde af maligne tumorer, herunder lungecancer, brystcancer, gastrisk cancer og coloncancer, blev udvalgt til at måle

in vivo

ekspression af Nrf2, MRP1, og NQO1 samt ved IHC. For lungekræft, kun de sager, der blev diagnosticeret med småcellet karcinom (SCLC), hvor både H69 og H69AR celler stammer form blev udvalgt. Sammenlignet med det tilstødende ikke-tumorvæv, viste lungekræft væv dramatisk højere ekspression af Nrf2, MRP1 og NQO1 (figur 6, sammenlign panel b2 til A2, B3 til a3, b4 til a4). HE farvning i panel af venstre mest afslørede malignt hyperplasi og tilstødende ikke-tumorvæv, som er nyttigt til at lokalisere det positive signal i IHC-farvede snit. I tilstødende ikke-tumorvæv, Nrf2 primært udtrykkes i kerner af epitelceller (figur 6, panel A2), og ekspressionen af ​​MRP1 blev viste både på cellemembranen og i cytoplasmaet (figur 6, panel a3). For at vise den nukleare lokalisering af Nrf2, et udvalgt område inden for hvert foto af Nrf2 farvning var udvidet og fusioneret ind i det originale foto i øverste venstre hjørne (figur 6, panel a2-h2, sort pil). Det var svært at se nogen indlysende NQO1 ekspression undtagen svagt positivt signal i spredte celler i hosliggende ikke-tumorvæv (figur 6, panel a4). I lungekræft væv, blev ekspressionen af ​​Nrf2 begrænset i kræft celle knuder undtagen nekrotiske center celler. Både cytoplasma og kerner viste Nrf2 ekspression, som var meget stærkere end tilstødende ikke-tumorvæv (figur 6, panel b2). På lignende udtrykke mønster med Nrf2, MRP1 udtrykte også klart og diffust i knuderne på lungekræft (figur 6, panel b3). Som en nedstrøms gen af ​​Nrf2, den udtrykker mønster af NQO var sammenlignelig med Nrf2 (figur 6, panel b4). Det var svært at se nogen udtryk for Nrf2, MRP1 og NQO1 i interstitiel væv. I brystkræft væv, ekspressionen af ​​Nrf2, MRP1 og NQO1 var signifikant høj (figur 6, panel d2, d3 og d4), selv om mild ekspression af dem kan ses i tilstødende ikke-tumorvæv (figur 6, panel c2, c3 og c4). De tre gener i mavekræft og tyktarmskræft var ens i at udtrykke mønster, nemlig udtryk for dem i tumorvæv var meget højere end i tilstødende ikke-tumorvæv (figur 6, panel e1 til H4). Desuden IHC farvning data indikerede den mulige sammenhæng mellem Nrf2 og MRP1 udtryk.

De ufarvede væv slides fra småcellet lungekræft, gastrisk kræft, brystkræft og tyktarmskræft var underlagt HE farvning (a1 til H1) og IHC-farvning med antistoffer mod Nrf2 (A2 til H2), MRP1 (a3 til h3) og NQO1 (a4 at H4). De bar skalaer blev mærket i nederste højre hjørne af hver billeder.

Dernæst IHC farvning sektioner blev analyseret og målt ved hjælp af software, i-Solution at kvantificere ekspression af Nrf2, MRP1 og NQO1 i alle tilfælde. Ekspressionen blev præsenteret som forholdet mellem positive område til hele området. I alle de fire cancervæv, Nrf2, MRP1 og NQO1 viste signifikant højere ekspression i modsætning til den tilstødende ikke-tumorvæv (figur 7, panel A, * P 0,05 vs normalt væv, henholdsvis). For at bekræfte korrelationen af ​​deres udtryk af toere, blev Pearson korrelation testen næste udført. I lungevæv, herunder både tumorvæv og tilstødende ikke-tumorvæv, Pearson korrelationskoefficient (r) mellem Nrf2 og MRP1 lig med 0,899 (figur 7, panel B, øverst til venstre, ** P 0,001), hvilket betyder udtrykket af de to gener var korrelative. Som en af ​​de nedstrøms gener af Nrf2, er udtryk for NQO1 reguleret af Nrf2, så r er lig med 0.820 (figur 7, panel B, øverst til venstre, ** P 0,005), som bekræftede regulering af NQO1 af Nrf2. Ligesom korrelationen af ​​Nrf2 og MRP1 i lungevæv, udviste alle andre 3 væv dette signifikant korrelation også, såsom mave væv (figur 7, panel B, øverst til højre), brystvæv (figur 7, panel B, nederst til venstre) og tyktarm væv (figur 7, panel B, nederst til højre). Derfor er disse farvende og statistisk analyse viste, både Nrf2 og MRP1 blev udtrykt meget højere i tumorvæv end tilstødende ikke-tumorvæv, og mere vigtigt, at ekspressionen af ​​de to gener var korrelative. Salg

Fem tilfældige synsfelter