PLoS ONE: Disturbed Expression af Splejsning Faktorer i nyrekræft Påvirker Alternativ splejsning af apoptose Regulators, onkogener og tumor dæmpere

Abstrakt

Baggrund

Ryd celle renalcellecarcinom (ccRCC) er den mest almindelige form for nyrekræft. En af de processer forstyrres i denne cancer type er alternativ splejsning, selv om fænomener for disse forstyrrelser fortsat ukendt. Alternativ splejsning består af selektiv fjernelse af introner og sammenføjning af resterende exons af det primære transkript, til frembringelse af mRNA-molekyler med forskellig sekvens. Splejsning aberrationer kan føre til tumoral transformation grund syntese af værdiforringede splejsningsvarianter med onkogent potentiale. I dette papir hypotese vi, at forstyrret alternativ splejsning i ccRCC kan skyldes forkert udtryk for splejse faktorer, mediatorer af splejsning reaktioner.

Metode /vigtigste resultater

Brug real-time PCR og Western blot analyse, vi analyserede udtryk for syv splejsningsfaktorer tilhører SR proteiner familie (SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55 og 9G8), og en ikke-SR faktor, hnRNP A1 (heterogen nukleare ribonucleoprotein A1) i 38 par tumor-kontrol ccRCC prøver. Desuden har vi analyseret splejsning mønstre af fem gener involveret i carcinogenese og delvist reguleret af analyserede splejsning faktorer:. RON, CEACAM1, Rac1, caspase-9, og GLI1

Konklusioner /Betydning

Vi fandt at mRNA ekspression af splejsningsfaktorer blev forstyrret i tumorer sammenlignet med parrede kontroller, på samme måde som niveauer af SF2 /ASF og hnRNP A1-proteiner. Korrelationskoefficienterne mellem ekspressionsniveauer af specifikke splejsning faktorer blev forøget i tumorprøver. Desuden blev alternativ splejsning af fem analyserede gener også forstyrret i ccRCC prøver og splejsningsmønster af to af dem, Caspase-9 og CEACAM1 korreleret med ekspression af SF2 /ASF i tumorer. Vi konkluderer, at forstyrret udtryk for splejsning faktorer i ccRCC muligvis kan føre til nedsat alternativ splejsning af gener der regulerer tumorvækst og på denne måde bidrage til processen med carcinogenese

Henvisning:. Piekielko-Witkowska A, Wiszomirska H, ​​Wojcicka A , Poplawski P, Boguslawska J, Tanski Z, et al. (2010) Disturbed Angivelse af Splejsning Faktorer i nyrekræft Påvirker Alternativ splejsning af apoptose Regulators, onkogener og tumor dæmpere. PLoS ONE 5 (10): e13690. doi: 10,1371 /journal.pone.0013690

Redaktør: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Spanien

Modtaget: Indtil 30. juni, 2010; Accepteret: 7 oktober 2010; Udgivet: 27 oktober 2010

Copyright: © 2010 Piekielko-Witkowska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af: den polske stat udvalget for videnskabelig forskning Grants NN401354733 (til APW) og NN401073636 (til AN), og The Medical Centre of Postgraduate Uddannelse giver 501-2-25-01 /09 (til APW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Renalcellecarcinom (RCC) er den mest almindelige faste læsion i nyrerne og repræsenterer -3% af alle humane maligniteter. Hvert år i Europa omkring 40 000 nye tilfælde af RCC er diagnosticeret og ca. 20 000 patienter dør af sygdommen [1]. Langt størstedelen (80%) af RCC tilfælde histologisk klassificeres som clear cell nyrecellecancere (ccRCC) med oprindelse fra proksimale tubuli i nyren. Den molekylære basis for ccRCC er ikke fuldt forstået. Selv om der er foreslået flere molekylære markører, har ingen af ​​dem er blevet godkendt til rutinemæssig klinisk anvendelse [2].

En af de cellulære processer, der ofte forstyrret i cancere, er alternativ splejsning, processen med selektiv fjernelse af introner og sammenføjning af resterende exons, hvori mRNA-molekyler af forskellige sekvenser produceres. Uregelmæssig alternativ splejsning kan føre til tumoral transformation [3]. Nedsat alternativ splejsning af flere gener blev også rapporteret i ccRCC. For eksempel, i vores tidligere arbejde fandt vi ccRCC-specifikke ubalanceret udtryk for type 1 iodothyroine deiodinase (DIØ1) splejsningsvarianter [4], [5] og utranslaterede regioner af thyreoideahormon receptor TRβ1 [6]. Flere andre rapporter, der viser ccRCC-specifikke forstyrrelser af alternativ splejsning omfatter ændringer i mRNA behandling af Mcl-1 [7], TCF-4 [8], survivin [9], og OGG1 [10]. Unormalt splejsede varianter af gener beskrevet ovenfor, er sjældent virkninger af mutationer i gener, der koder for splejsede afskrifter og kilderne til forstyrrelser i alternativ splejsning er normalt ukendt.

Alternativ splejsning er en kompliceret proces, der involverer et betydeligt antal proteiner, herunder splejsning faktorer kaldet serin-arginin rige proteiner (SR proteiner) [11]. Familien af ​​SR proteiner består af mindst tyve medlemmer, hvoraf syv: SF2 /ASF (kodet af genet: SFRS1), SC35 (gen: SFRS2), SRp20 (gen: SFRS3), SRp75 (gen: SFRS4), SRp40 (gen : SFRS5), SRp55 (SFRS6), og 9G8 (SFRS7) udgør gruppen af ​​”klassiske” SR proteiner. Disse faktorer binder til sekvenser kaldet splejsning forstærkere, som ligger i exoner (Eses, exoniske splejsning forstærkere) eller i introns (ISES, intron splejsning forstærkere). Binding af SR proteiner til splejsning enhancere fremmer exon integration. Splejsningsreaktionen er også reguleret af en lang række ikke-SR faktorer såsom hnRNPs (heterogene nukleare ribonucleoproteiner), som primært binder til sekvenser af splejsning lyddæmpere og fungerer som splejsning repressorer [12]. Således det endelige resultat af alternativ splejsning er en effekt af koncerten virkning af antagonistisk virkende splejsningsfaktorer. Et par af splejsningsfaktorer udviser modsatte aktiviteter er SF2 /ASF (en SR protein) og hnRNP A1 (heterogen nukleare ribonukleoprotein A1; en ikke-SR protein) [13]. Overskud af SF2 /ASF fremmer proksimale 5′-splejsningssted udvælgelse mens af hnRNP A1 favoriserer distal 5′-splejsningssted. Specifikke medlemmer af SR familie kan også fungere antagonistisk (fx SF2 /ASF og SRp20 [14], eller SF2 /ASF og SC35 [15]). Således relative niveauer af specifikke splejsningsfaktorer bidrager til regulering af alternativ splejsning, er specifikt for vævstype og udviklingsstadiet.

Det er kendt, at forstyrrelser i alternativ splejsning kan bidrage til carcinogenese skyldes produktionen af ​​tumor-undertrykkende eller onkogen varianter af gen-udskrifter, der påvirker spredning, celle motilitet og apoptose modtagelighed [16]. Forkert splejsede udskrift varianter kan også tjene som tumor biomarkører [17]. Den voksende mængde beviser tyder på, at splejsning faktorer kan være direkte involveret i processen med carcinogenese, som proto-onkogener [18] eller regulering splejsning og aktivitet af proto-onkogener [19], tumorsuppressorer [18] og apoptose regulatorer [20 ]. Forstyrret ekspression af splejsningsfaktorer blev rapporteret i flere typer af cancere [11]. I vores seneste papir viste vi, at ekspressionen af ​​to splejse faktorer, er SF2 /ASF og hnRNP A1 forstyrret ccRCC [4], men vores viden udtryk for splejsning faktorer som en gruppe aldrig var blevet analyseret i ccRCC.

i dette papir hypotese vi, at de observerede forstyrrelser for alternativ splejsning i ccRCC kan være en konsekvens af ændringer i ekspressionen af ​​splejsning faktorer, især, aberrationer af kvantitative relationer mellem dem. For at løse dette problem, vi analyserede udtryk for syv klassiske splejsning faktorer: SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55, 9G8 og en ikke-SR faktor, hnRNP A1. Desuden at undersøge konsekvenserne af forstyrret ekspression af splejsningsfaktorer, analyserede vi tilstedeværelsen og ekspression af transkripter af fem gener involveret i tumorigenese, der er kendt for at være alternativt splejsede og delvist reguleret af de analyserede splejsningsfaktorer. Vi fandt, at ekspressionen af ​​splejsningsfaktorer samt alternativ splejsning af analyserede gener blev forstyrret i størstedelen af ​​analyserede vævsprøver. Vi konkluderer, at forstyrret udtryk for splejsning faktorer i ccRCC muligvis kan føre til nedsat alternativ splejsning af gener der regulerer tumorvækst og derfor bidrager til processen med carcinogenese.

Materialer og metoder

Vævsprøver

Vævsprøver blev opnået fra ensidige nephrectomies udført på patienter med klar celle renalcellecancer (38 patienter) med tilladelse fra Etisk Udvalg for Human Studies (The Medical Centre of Postgraduate Uddannelse). Prøver blev opdelt i to grupper: cancervæv (n = 38, T) og kontrol-væv (parret normalt væv fra den modsatte pol af den maligne nyre uden histologiske tegn på tumor; n = 38, C). Clear celle renalcellecancer blev diagnosticeret ved histologi ifølge WHO kriterier [21]. Tumorer blev inddelt i tre grupper, alt efter graden af ​​differentiering:. G1 (godt differentieret), G2 (mellemliggende kvalitet af differentiering), G3 (dårligt differentierede kræftformer)

RNA isolering

I alt cellulært RNA blev isoleret fra -100 mg af frosset væv under anvendelse GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit (EURx, Gdansk, Polen) ifølge producentens protokol.

Reverse transcription

600 ng af total RNA blev revers transkriberet under anvendelse RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Vilnius) og oligo-dT-primere ifølge fabrikantens protokol. For efterfølgende PCR-analyse blev anvendt 1 ul cDNA. For real time PCR reaktioner 1 ul af 5x fortyndet cDNA blev taget.

PCR-analyse af alternative splejsning

PCR-reaktion blev udført på en pi på 5x fortyndet cDNA hjælp Perpetual OptiTaq DNA Polymerase HOT START ( EURx, Gdansk, Polen) under forhold 95 ° C, 10 min. (Indledende denaturering) efterfulgt af 35 cykler: [95 ° C, 30 s; 58 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s], sidste forlængelse: 61 ° C, 10 min. Sekvenser af specifikke primere (tabel S1) blev taget fra de tidligere offentliggjorte rapporter for: RON [19], Caspase-9 [22], CEACAM-1 [23], Rac1 [24], og GLI1 [25]. PCR-produkterne blev elektroforesebehandlet i 1-2% agarosegel farvet med ethidiumbromid.

Real-time PCR

Semi-kvantitativ realtids-PCR blev udført ved anvendelse LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i tre eksemplarer i henhold til producentens protokol. Sekvenserne af primerne er vist i tabel S2. Betingelser for real-time PCR var som følger: indledende denaturering: 95 ° C, 10 min, 45 cyklusser:. (95 ° C, 15 s, 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s); efterfulgt af smeltekurveanalyse: (95 ° C, 5 min; 65 ° C, 1 min; kontinuerlig læsning af fluorescens fra 65 ° C til 97 ° C med 0,11 ° C /s ramp rate og 5 erhvervelser pr hver ° C). Resultaterne blev normaliseret til ekspressionen af ​​18sRNA host-genet

RN18S1

. Stabiliteten af ​​ekspressionen af ​​18sRNA blev valideret og bekræftet i indledende foranalyse af 32 par af kontrol- og tumor prøver ved sammenligning med ACTB udtryk (figur S1). De ACTB primere blev offentliggjort andetsteds [6].

Protein ekstraktion og Western blot-analyse

For Western-analyse, blev tolv repræsentative par af tumor og kontrolprøver taget. Vævsprøver blev homogeniseret i en buffer indeholdende 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, proteaseinhibitorcocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og 0,5 mM PMSF. Homogenatet blev inkuberet med omrystning i 2 timer ved 4 ° C og centrifugeret ved 12.000 rpm i 20 min, ved 4 ° C. Den opnåede supernatant blev anvendt til proteinkoncentration analyse med Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ifølge standardprotokol. Proteinekstrakterne blev inddelt i 30 pi alikvoter og opbevaret ved -70 ° C.

I SF2 /ASF Western blotting, 30 ug protein ekstrakt blev opløst ved 10% SDS-PAGE. Efter elektroforese blev proteinerne overført til nitrocellulosemembraner, som efterfølgende blev blokeret natten over ved 8 ° C i 5% fedtfri mælk i TBS-T-buffer (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20; pH 7,6) . Membranerne blev vasket tre gange i TBS-T i 10 minutter ved stuetemperatur og inkuberet natten over ved 8 ° C med anti-SF2 /ASF antistof fortyndet 1 (kat nr .: 32-4500, Invitrogen, Carlsbad, CA).: 500 i TBS-T puffer med 5% fedtfri mælk. Efter vask 3 gange i 10 min med TBS-T, blev membranerne inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med peberrodsperoxidase-konjugeret ged anti-mus sekundært antistof (1:10000, DakoCytomation, Glostrup, Danmark), og vasket 3 gange i 10 min med TBS-T.

Western blotting af hnRNP A1 blev udført som for SF2 /ASF-analyse under anvendelse af 15 ug af proteinekstrakt og anti-hnRNP A1 antistof (kat. nr .: ab10685, Abcam plc, Cambridge, UK).

Proteiner blev påvist ved en forøget-kemiluminescens påvisningssystem (Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ifølge standardprocedurer. Efterfølgende blev membranerne strippet, blokeret og inkuberet med anti-β-actin-antistof (kat. Nr. Ab6276, Abcam plc, Cambridge, UK) fortyndet 1:10000 i TBS-T buffer i 1 time ved stuetemperatur, vasket tre gange i TBS-T buffer og behandles yderligere som beskrevet for SF2 /ASF procedure.

mængden af ​​specifikt protein blev anslået densitometrisk efter normalisering til udtryk for β-actin.

forudsigelse af splejsning faktor bindende motiver

Analyse af CEACAM1 exon 7 sekvens blev udført med ESE finderen software [26]. Til forudsigelse af SF2 /ASF bindingssteder blev to matricer anvendes: “SF2 /ASF /IgM-BRCA1” og “SF2 /ASF”. Disse to matricer blev afledt i anden sammenhæng (forskellige minigener og størrelse af tilfældig sekvens-biblioteker i SELEX [27]). De tærskler, der anvendes til forudsigelse var: 1,956 (SF2 /ASF), 1,867 (SF2 /ASF /IgM-BRCA1), 2,383 (SC35), 2,670 (SRP40), og 2,676 (SRp55). Sekvensen af ​​exon 7 blev afledt fra CEACAM1 transkript variant 1 (Acc. Nr. NM_001712.3).

Statistisk analyse

Shapiro-Wilk testen blev anvendt til bestemmelse normalitet distribution data. Normalfordelte data blev analyseret ved parret t-test og ikke-parametriske data ved Wilcoxon matched pair test.

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Visualisering af korrelation matrix blev gjort ved hjælp corrplot på R-platform [28].

Resultater

mRNA udtryk for splejsning faktorer er forstyrret i mindst halvdelen af ​​ccRCC prøver

Splejsning faktorer, der tilhører gruppen af ​​SR proteiner omfatter et stort antal strukturelt og funktionelt beslægtede proteiner [11]. I vores undersøgelse har vi fokuseret på gruppen af ​​”klassiske” SR proteiner, dvs. SF2 /ASF (kodet af genet: SFRS1), SC35 (SFRS2), SP20 (SFRS3), SRp75 (SFRS4), SRp40 (SFRS5), SRp55 (SFRS6 ), og 9G8 (SFRS7). Vi har også analyseret ekspression af et ikke-SR splejsning faktor, hnRNP A1, der generelt menes at virke som antagonist for SR proteiner.

Brug real-time PCR vi fandt, at mønstret for ekspression af splejsningsfaktorer afveg mellem enkelte patienter, såvel som mellem kontrol- og tumor- prøver af en bestemt patient. mRNA-ekspression af alle analyserede splejsningsfaktorer blev forstyrret i ca. 50-60% (afhængigt af splejsning faktor analyseres) af tumorprøver sammenlignet med parrede normale væv (fig. 1). Disse ændringer af ekspression skyldtes ned-eller opregulering af de analyserede gener og tilladt os at opdele alle tumorprøver i tre puljer: D, U, og N, hvor ekspressionen af ​​gener blev nedreguleret, opreguleres eller ikke ændret henholdsvis. Retningen af ​​ændringer korrelerede ikke med tumorklassificering af differentiering (fig. 1A).

A. Ændringer i ekspressionen af ​​bestemte par af kontrol- og tumorprøver. Diagrammet blev udført baseret på data fra realtids-PCR-analyse (figur S2). Farver repræsenterer ekspression forholdet mellem kontrol- og tumorprøver. Grøn: nedregulering i tumorprøver. Rød: opregulering i tumorprøver. Hvid: ingen forskel i ekspressionsniveauer. Tumor grading (G1, G2, G3) er vist. B. Fordeling af ændringer i mRNA-ekspression af splejsningsfaktorer. D: gruppe af prøver med tumor-specifikke nedregulering af udtryk; U: gruppe af prøver med tumor-specifikke opregulering af udtryk; N: gruppe af prøver, der ikke adskiller sig i udtryk mellem kontrol- og tumorprøver. Tærsklen på 30% forskel i udtryk mellem kontrol- og tumorprøver blev brugt til at klassificere prøver.

Antallet af prøver i hver pulje varierede fra n = 8 for D og n = 14 for U (for hnRNP A1) til n = 17 for D og n = 4 for U (for SRp40) (fig. 2). For flertallet af prøver med ændret ekspression, var pool D den mest udbredte (34-45% af alle analyserede prøver). Den eneste undtagelse var udtryk for hnRNP A1, der blev nedreguleret i kun 21% af prøverne og opreguleret i 37% af alle analyserede prøver. Nedregulering af gener i puljer D, varierede fra 1,9 gange (SRp20) til 2,6 gange (SC35 ad SRp75) sammenlignet med kontrolprøver. Gener i puljer U blev opreguleret fra 1,4 fold (9G8) til 2,4 gange (SF2 /ASF) sammenlignet med kontrolprøver

Ekspression af hver splejsning faktor er vist i to grupper af prøver:. Med tumorspecifik nedregulering (D) (til venstre) og opregulering (U) (højre). Tærsklen på 30% forskel i udtryk mellem kontrol- og tumorprøver blev brugt til at klassificere prøver. C: kontrolprøver, T: tumor prøver. Dataene er angivet som middelværdi ± S.E. .. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af parrede t-test. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001

Kvantitative relationer mellem splejsning faktorer varierer mellem tumor og kontrolprøver

For at undersøge, om ændringer i ekspressionen af ​​splejsning faktorer er korreleret, vi analyserede nøgletal mellem ekspressionsniveauer af splejsningsfaktorer samt forholdet mellem specifikke par af splejsningsfaktorer (Fig. 3). Vi fandt, at mønstret for korrelationer afveg mellem kontrol- og tumor prøver, med generel tendens til øget korrelationskoefficienter i tumor prøver (Fig. 3A). De stærkeste ændringer i korrelation blev observeret for hnRNP A1. For eksempel var der ingen signifikant korrelation mellem hnRNP A1 og SRp20, hnRNP A1 og SRp75, og hnRNP A1 og 9G8 i kontrolprøver, mens i tumorprøver ekspressionen af ​​disse gener korreleret betydeligt. Også sammenhængen mellem SF2 /ASF og den resterende seks analyserede splejsningsfaktorer var stærkere i tumorprøver.

A. Matrix viser korrelationskoefficienter mellem mRNA-ekspression analyserede splejsningsfaktorer. Plottet blev genereret baseret på Pearson korrelationskoefficienter mellem udtryk værdier af splejsning faktorer. Patient nummer 16 blev fjernet fra analysen på grund af afvigelse fra normalfordeling. For SC35 (gen: SFRS2) Spearman parametrisk korrelation blev brugt som data ikke var normalt fordelt i denne gruppe. Værdierne af Pearson eller Spearman R er givet nedenfor dot diagram. Splejsningsfaktorer genet navne er vist i parentes. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. B. mRNA-ekspression forhold af splejsningsfaktorer kendt for at virke antagonistisk. Dataene er givet som gennemsnit ± S.E. (Til SF2 /ASF: hnRNP A1 og hnRNP A1: SC35) eller som medianværdier og 95% CI (for SC35: SRp55 som data blev ikke normalt fordelt i denne gruppe). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af parrede t-test (for for SF2 /ASF: hnRNP A1 og hnRNP A1: SC35) eller Wilcoxon parret test (for SC35: SRp55). . N = 37 for C, n = 37 for T, ** p 0,01

Der er par af splejsningsfaktorer, der vides at virke antagonistisk [13] – [15], [29] . Derfor analyserede vi forhold mellem følgende specifikke splejsning faktorer: SF2 /ASF: hnRNP A1, SF2 /ASF: SRp20, SF2 /ASF: SC35, SRp40: SRp55, SC35: SRp55, og hnRNP A1: SC35. Vi fandt, at de tre par splejsning faktorer forholdene afveg betydeligt i tumorprøver i sammenligning med kontrolprøver (fig. 3B). Den SF2 /ASF: hnRNP A1-forholdet blev reduceret i tumorprøver med omkring 26% (1,07 ± 0,06 S.E. for C vs 0,78 ± 0,06 S.E. for T; p = 0,0022). Forholdet mellem SC35: SRp55 blev forøget i tumorprøver med ca. 40% (median 1,12, interval 0,60-5,91 for C; median 1,57, interval 0,59 til 12,29 for T; p = 0,0073). For forholdet hnRNP A1: SC35 var der en lille (15,3%), men statistisk signifikant stigning i tumorer sammenlignet med kontrolprøver (0,77 ± 0,05 SE for C vs 0,89 ± 0,064 SE for T; p = 0,0197)

protein udtryk for SF2 /ASF og hnRNP A1 forstyrres i ccRCC

for at kontrollere, om ændringer i mRNA-niveau resultat i samtidige forstyrrelser af protein-ekspression vi udførte Western blot analyse af to splejse faktorer, SF2 /ASF og hnRNP A1 på tolv repræsentative par af kontrol- og tumorprøver (fig. 4). Faktisk fandt vi signifikante forskelle mellem protein niveauer af splejsning faktorer i kontrol- og tumorprøver. Tilsvarende som i tilfælde af mRNA analyse, var ændringerne variabel, men korrelerede ikke med mRNA-ekspression. I størstedelen af ​​analyserede parrede vævsprøver udtryk for splejsning faktor blev reduceret i prøver T i forhold til prøverne C (SF2 /ASF: 9 par; hnRNP A1: 8 par).

Tumor kvaliteter af differentiering er vist ( G1, G2, G3). Western blots af SF2 /ASF (A) og hnRNP A1 (B) blev anvendt til semikvantitativ analyse af proteinbånd efter normalisering til p-actin. Grå søjler repræsenterer kontrolprøver. Sorte søjler repræsenterer tumorprøver.

I flere prøver yderligere eller flyttet bånd var synlige, især i blots af SF2 /ASF (fig. 4A). En sådan et billede er karakteristisk for forskelligt phosphorylerede molekyler af SF2 /ASF protein [30].

Alternativ splejsning af gener involveret i tumorigenese og reguleret af splejsning faktorer forstyrres i ccRCC

SF2 /ASF regulerer alternativ splejsning af et betydeligt antal gener, herunder RON proto-onkogen [19], apoptose regulator Caspase-9 [22], og Rac1, et medlem af Ras-familien af ​​proto-onkogener (reguleret af SF2 /ASF og SRp20) [14 ]. For at undersøge om ændringer i mængderne af splejsningsfaktorer følges af ændringer i alternativ behandling af målgener, vi analyserede deres splejsning mønstre (fig. 5). Desuden analyserede vi splejsning profiler af to yderligere gener:. GLI1 onkogen [25] og CEACAM1 tumor suppressor [23], hvis forstyrret splejsning er kendt for at bidrage til tumorudvikling

A. PCR-analyse af alternativ splejsning mønstre i tolv par af kontrol (C) og tumor (T) vævsprøver. 1) RON; 2) CEACAM-1; 3) Rac1; 4) Caspase-9; 5) GLI1. Positioner af primere anvendt til PCR er vist i forhold til exoner. Alternativt splejsede exoner er skraveret. Sorteringer af tumor differentiering er vist (G1, G2, G3). B. Graf, der viser ekspressionsniveauer forhold af splejsningsvarianter som bestemt ved densitometrisk analyse af elektroforese-PCR-produkter. Bemærk forskellige akseskalaer. Grå søjler repræsenterer kontrolprøver. Sorte søjler repræsenterer tumorprøver.

Vi fandt, at niveauet af forskellige splejsning varianter af analyserede gener varierede mellem flertallet af de tolv analyserede par af kontrol og tumor prøver, hvor protein niveau af SF2 /ASF og hnRNP A1 blev analyseret (fig. 5B). Ekspression af RON proto-onkogen splejsning varianter Ron og ΔRon afveg mellem prøver af specifikke kvaliteter af differentiering. I alle G3 tumorprøver forholdet ΔRon /Ron var højere end i parrede kontrolprøver. I prøver var G1 tumor-specifikt forhold ΔRon /Ron højere eller lignende i sammenligning med kontrolprøver. I prøver fra patient nummer 13 begge isoformer var fraværende i tumor og kontrolprøver. I tumorprøver klassificeret som G2 forholdet ΔRon /Ron var variabel: to tumorprøver det var den samme som i parrede kontroller i en prøve det var højere end i parret kontrol og i én prøve det var lavere end i parret kontrol. Splejsning mønstre af CEACAM1 ikke afhænge af differentiering kvalitet af tumor prøve. I syv prøvepar var forholdet CEACAM1-S /CEACAM1-L højere i tumorer end i kontrolprøver. I to sample par blev CEACAM1-S ikke fundet. Splejsningsmønster af Rac1 var den samme i de fleste analyserede prøver. Forholdet Rac1b /Rac1 var højere i kontrolprøver end i parrede tumorer i elleve analyserede væv par. Syv af analyserede prøve par afslørede højere andel af Caspase-9b /Caspase-9a i tumorer end i kontrolprøver uafhængigt af differentiering kvaliteter. Splejsningsmønster af GLI1 var den mest variable. Forholdet mellem GLI1-FL /GLI1-AN i syv tumorprøver var højere end i parrede kontroller. I to par prøver var der ingen forskelle mellem forhold mellem analyserede splejsningsvarianter; dog yderligere bånd var synlige, hvilket tyder på tilstedeværelse af ikke identificerede splejsningsvarianter.

For at finde mulige forbindelse mellem ændringer i ekspression af SF2 /ASF og splejsning af SF2 /ASF-regulerede gener, vi udførte Pearson korrelationsanalyse mellem ekspression af splejsningsfaktorer og mål-exon splejsning (fig. 6). Positiv korrelation (r = 0,6915, p = 0,0127) mellem caspase-9a og SF2 /ASF protein blev observeret i tumor, men ikke i kontrolprøver (r = 0,004644, p = 0,9886). Vi fandt også en positiv korrelation (r = 0,6187, p = 0,0320) mellem CEACAM1-L og SF2 /ASF protein i tumorer, men ikke i kontrolprøver (r = 0,4482, p = 0,1439). Vi fandt ikke nogen sammenhæng mellem ekspressionen af ​​SF2 /ASF (eller hnRNP A1) proteiner og splejsning varianter af Ron, Rac1 eller GLI-1 (data ikke vist).

Pearson korrelation analyse blev udført på data fra tolv par af kontrol- og tumor- vævsprøver. P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Selv om det er kendt, at SF2 /ASF regulerer splejsning af Caspase-9 [22], er der ingen data, der viser, at CEACAM1-L er et mål om SF2 /ASF eller enhver splejsning faktorer. Imidlertid blev det konstateret, at exon 7 i CEACAM1 indeholder cis-agerende splejsning regulatoriske elementer [23]. Derfor har vi analyseret sekvensen af ​​CEACAM1 exon 7 ved hjælp af matricer til forudsigelse sekvenser, der kræves for binding af splejsning faktorer SF2 /ASF, SC35, SRp40, OG SRp55 (fig. 7). Denne analyse viste flere high-score-motiver til SF2 /ASF, to motiver til SC35, tre motiver til SRp40, og en motiv for SRP55.

Forudsigelse af motiver blev udført med ESE Finder software [26] ved hjælp af matricer til forudsigelse af sekvenser nødvendige for binding af splejsningsfaktorer. Til forudsigelse af SF2 /ASF bindingssteder blev to matricer anvendes: “SF2 /ASF /IgM-BRCA1” (hvide søjler) og “SF2 /ASF” (grå søjler). Disse to matricer blev afledt i anden sammenhæng (forskellige minigener og størrelse af tilfældig sekvens-biblioteker i SELEX [27]). Kun høj score motiver over tærskelværdierne for SF2 /ASF (1,956), SF2 /ASF /IgM-BRCA1 (1,867), SC35 (2,383), SRP40 (2,670), og SRp55 (2,676) er vist. Nucleotidsekvensen for CEACAM1 exon 7 gives på x-aksen.

Diskussion

I dette papir viser vi, at mRNA ekspressionen af ​​otte splejsningsfaktorer forstyrres i ccRCC. Proteinet ekspression af to splejsningsfaktorer, der vides at virke antagonistisk, er SF2 /ASF og hnRNP A1 også forstyrret. Disse afvigelser er ledsaget af nedsat alternativ splejsning af SF2 /ASF afhængige gener, RON, Caspase-9, og Rac1. Tumor-specifikke forstyrrelser af alternativ splejsning blev også fundet for GLI1 onkogen og CEACAM1 tumor suppressor.

Ændringer i præ-mRNA splejsning er et almindeligt fænomen i humane maligniteter. Ifølge vores fund, af afvigelser i ekspression af splejsningsfaktorer forekommer i mindst halvdelen (50-60%) af analyserede prøver, selv om forstyrrelser er forskellige og skyldes både up- og nedregulering af splejsningsfaktorer (fig. 1 og 2). Retningen af ​​ændringer er ikke specifik for tumor kvaliteter af differentiering da både op- og nedregulering blev observeret i alle sorteringer. Det er bemærkelsesværdigt, at selv om de fleste af de publikationer henviser til tumor-specifik forhøjelse af splejsningsfaktorer ekspression, er den procentdel af prøver, hvor den forstyrrede ekspression forekommer sjældent vist. Karni et al. [18] rapporterede, at blandt 50 analyserede ccRCC prøver mere end 2-fold overekspression af SF2 /ASF mRNA blev observeret i mindre end 5% af prøverne. Ifølge vores analyse andel af prøver med mere end 2-fold overekspression var lidt højere (8%), men denne forskel kan skyldes relativt lille antal analyserede prøver.

Interessant fandt vi, at mønstre af mRNA og protein ekspression af splejsningsfaktorer afveg mellem individuelle patienter og også mellem kontrol- og tumor- prøver af en given patient. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse, der viser tumor-specifikke og patient-specifik splejsning mønstre af type 1 iodothyronin deiodinase [4] og med andre undersøgelser, der viser, at ccRCC er kendetegnet ved molekylær heterogenitet og kan adskilles i genekspression undergrupper [31] – [33]. I undersøgelsen af ​​Zhao et al. [33] De ekspressionssystemer undergrupper korreleret med overlevelse efter kirurgi, men, på samme måde som i vores undersøgelse, korrelerede ikke med tumor kvaliteter. Desværre, i tilfælde af vores undersøgelse blev patienterne ikke fulgt op således er det ikke muligt at analysere eventuelle korrelationer mellem udtryk profiler og overlevelse patienter. Klein et al. [34] analyserede enkelt tilbageværende tumorceller fra flere typer af tumorer (men ikke af nyre oprindelse) og fandt stor heterogenitet af genekspression mellem bestemte kræftceller. Disse celler var heterogene, uanset om de boede i samme rum eller inden for forskellige målsøgende sites. Patientspecifik variation i genekspression blev også rapporteret for bryst- og prostatacancer [35], [36]

Denne genekspression variabilitet er et interessant spørgsmål, og mindst to mulige oprindelser bør overvejes:., At variationerne afspejle tumorspecificitet eller at de afspejler den enkelte patients funktioner, der resulterer i et specifikt billede af genekspression i tumoren. Den første situation blev beskrevet for leverkræft, hvor separate tumorer fra en enkelt patient viste dramatiske forskelle i genekspression mønstre [37]. På den anden side, Perou et al. [35] rapporterede, at genekspression mønstre af forskellige brysttumorceller prøver taget fra en patient var mere ligner hinanden end til prøver fra andre patienter. Det er ikke klart, hvilken situation vedrører vores undersøgelse, da vi analyserede enkelte prøver pr patient. Som vi for nylig har imidlertid vist, ccRCC tumorer kan også afsløre mere homogene genekspressionsmønstre [6]. I den undersøgelse, hvor vi brugte delvis det samme materiale som i dette papir, fandt vi meget konsekvent ccRCC tumor specifikke forstyrrelser af thyreoideahormon vej: fald i thyreoideahormon receptor β1 (TRβ1) mRNA og protein, tab af type 1 iodothyonine deiodinase protein og sænket niveau af thyreoideahormon, triiodothyronin (T3).