PLoS ONE: HIF-1α Hæmning Fortryder multiresistens i Colon Cancer Cells via nedregulering af MDR1 /P-glykoprotein

Abstrakt

Baggrund

multiresistens (MDR) er en af ​​de vigtigste årsager kemoterapi-baserede behandlinger ikke. Hypoxi er generelt forbundet med tumor kemoresistens. Men sammenhængen mellem de heterodimere hypoxi-inducerbare faktor-1 (HIF-1) og multiresistens (MDR1) gen /transporter P-glycoprotein (P-gp) er fortsat uklar. Denne undersøgelse har til formål at udforske de molekylære mekanismer i at vende tyktarmskræft MDR ved at fokusere på målgenet HIF-1α.

Metoder

Et kemoterapeutisk sensitivitet blev anvendt til at observere effektiviteten af ​​MDR vending i LoVo flercellede sfæroider (MCS). Den apoptotiske niveau induceret af forskellige lægemidler blev undersøgt ved flowcytometri (FCM). Binding af HIF-1α til MDR1 genpromotoren blev evalueret ved chromatin immunoprecipitation (chip). Forholdet mellem HIF-1α /P-gp udtryk og følsomhed over for kemoterapi blev analyseret.

Resultater

følsomhed LoVo MCS til alle fire kemoterapi narkotika blev reduceret i varierende grad under hypoxiske betingelser. Efter tavshed HIF-1α gen blev følsomheden af ​​LoVo MCS til alle fire kemoterapi narkotika genoprettet. De apoptotiske niveauer, at alle lægemidler inducerede var alle faldt i forskelligt omfang i den hypoxiske gruppe. Efter silencing HIF-1α, apoptose niveau induceret af alle fire kemoterapi narkotika steget. Ekspressionen af ​​HIF-1α og P-gp blev signifikant forøget i LoVo MCS efter behandling med hypoxi. Inhiberende HIF-1α faldt betydeligt ekspressionen af ​​MDR1 /P-gp mRNA eller protein i både LoVo monolag og LoVo MCS. Chippen assay viste, at HIF-1α var bundet til MDR1 genpromotoren. Avancerede tyktarmscarcinomceller patienter med ekspression af både HIF-1α og P-gp var mere resistente over for kemoterapi end med ikke ekspression.

Konklusioner

HIF-1α inhibering reverserer multilægemiddelresistens i colon cancerceller via nedregulering af MDR1 /P-gp. Ekspressionen af ​​HIF-1α og MDR1 /P-gp kan anvendes som en prædiktiv markør for kemoterapi modstand i tyktarmskræft

Henvisning:. Chen J, Ding Z, Peng Y, Pan F, Li J, Zou L, et al. (2014) HIF-1α Hæmning Fortryder multiresistens i Colon Cancer Cells via nedregulering af MDR1 /P-glycoprotein. PLoS ONE 9 (6): e98882. doi: 10,1371 /journal.pone.0098882

Redaktør: Michal Zmijewski, Medical University of Gdańsk, Polen

Modtaget: December 7, 2013; Accepteret: 8. maj 2014 Udgivet: 5 juni 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (No.30973430 og No.81101629). (https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantweb/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer i hele verden, og kemoterapi spiller en vigtig rolle i dens behandling. Men følsomheden over for forskellige kemoterapeutiske regimener varierer meget fra person til person. Mange cancerpatienter udvikler resistens, hvilket fører til dårlige behandlingsresultater. Endvidere lægemiddelresistens oftest opstår i faste tumorer in vivo, men ikke i monolag in vitro [1]. Tumormikromiljøet spiller en central rolle i kemoterapi svigt og medikamentresistens [2] -. [4]

Hypoxi er et fælles træk ved mange maligne tumorer, herunder coloncancer. En hypoxisk tumor mikromiljø betragtes i stigende grad en kritisk komponent i fastlæggelsen resistens [5], [6]. Hypoxi-inducerbare faktor-1 (HIF-1) er en nøglefaktor i at ændre de biologiske karakteristika af tumorer. HIF-1α protein overudtrykkes i flere typer af human cancer og er forbundet med dårligere prognose i mange cancertyper. Selv om mange undersøgelser har vist, at hypoxi potenserer tumor resistens mod kemoterapi og strålebehandling [7], [8], hvordan den hypoxiske mikromiljø bidrager til anticancer resistens er endnu ikke fastslået.

multiresistens (MDR) er en af de vigtigste årsager til, at kemoterapi-baserede behandlingssvigt forekommer. Af de mange mekanismer MDR, den høj ekspression af det humane MDR1 genet og P-glycoprotein (P-gp) transportør kodet af MDR1 er et vigtigt fokus for forskning [9]. Tumorceller, som overudtrykker MDR1 /P-gp normalt vise modstand mod forskellige kemoterapeutika [10], [11]. Vores tidligere undersøgelse viste, at HIF-1α-proteinekspression er korreleret med MDR1 /P-gp-ekspression i koloncarcinomvæv og en coloncancer cellelinie, og mRNA ekspressionsniveauer af HIF-1α og MDR1 er markant højere i den samme type af celler i hypoxiske betingelser end i normoxiske forhold [12]. Det er fortsat uklart, om og hvordan HIF-1α er involveret i MDR i tyktarmskræft via interaktionen af ​​MDR1 /P-gp.

Udforskning indflydelse hypoxi på tyktarmskræft MDR vil bidrage til at forbedre effekten af ​​kemoterapi. I hypoxisk mikromiljø, antager vi, at HIF-1α direkte kan inducere ekspression af MDR1 /P-gp, som fører til MDR, og tilbageførsel af tyktarmskræft MDR kan opnås, når HIF-1α udtryk er specielt hæmmet. I den foreliggende undersøgelse, vi sigter mod at udforske de potentielle molekylære mekanismer og muligheden for at vende tyktarmskræft MDR ved at fokusere på målgenet HIF-1α. Vi forventer at give et teoretisk grundlag og eksperimentelt bevis for senere relaterede programmer i klinisk behandling.

Materialer og metoder

Cell Culture

Den menneskelige coloncancercellelinie LoVo blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket i høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (HyClone, USA) og antibiotika (1% penicillin og 1% streptomycin). For hypoxi eksponering blev celler dyrket i 24 timer i en modulator inkubator kammer ved 37 ° C med 1% O

2, 5% CO

2, og 94% N

2. Multicellulære sfæroider (MCS) blev opnået ved anvendelse af den flydende overlay teknik [13]. Kort fortalt, blev eksponentielt voksende LoVo-celler tilsat til dyrkningsmedium plader, der tidligere blev overtrukket med 2% agarose. Pladerne blev forsigtigt og horisontalt hvirvlet i 10-15 minutter pr 2-3 timer i de første 24 timer, og derefter i 10 minutter hver 4. time. Passende medium blev fornyet hver anden dag. For hypoxi eksperimenter blev passende MCS etableret i normoxi i 48 timer og derefter dyrket i hypoxi i yderligere 24 timer.

Kemikalier

Adriamycin (ADR, Hisun Pharmaceutica, Kina), vincristin (VCR, Hisun Pharmaceutica, Kina), 5-fluorouracil (5-FU, Sigma, MO, USA), eller irinotecan (CPT-11, Hengrui Medicin, Kina) blev alle nylavede på dagen for brug ved at opløse den nødvendige koncentration i DMEM med 10% føtalt bovint serum.

Chemotherapeutic Følsomhed Assay

LoVo celler blev trypsinbehandlet, resuspenderet og talt, og 1000 celler blev podet i plader med 96 brønde, der tidligere er overtrukket med 2% agarose for at opnå MCS i normoksi. For hypoksi eksperimenter blev passende MSC overført til hypoxi i 24 timer og derefter inkuberet med gradient koncentrationer af lægemidler i yderligere 24 timer i hypoxi. Cellelevedygtighed blev målt ved 3- (4, 5-dimethylthiazol-z-yl) -3, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, BD Biosciences, NJ, USA) assay. Plader blev inkuberet med MTT ved 37 ° C i 4 timer, og absorbansen ved 490 nm blev målt ved Model 550 Microplate Reader (Bio-Rad, CA, USA).

kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med TRIZOL-reagens (Invitrogen, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. De anvendte primere var: 5′-GTTTGATTTTACTCATCCAT-3 ‘og 5′-TTCATAGTTCTTCCTCGG-3′ for HIF-1α; 5’-CTTGGCAGCAATTAGAAC-3 ‘og 5′-TCAGCAGGAAAGCAGCAC-3′ for MDR1; 5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA -3 “og 5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC -3” for 18sRNA. Den første streng cDNA-syntese blev udført med cDNA-syntese kit (Takara, Dalian, Kina). Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green real-time PCR kit (Takara). Alle normalizations blev udført ved hjælp af 18sRNA niveauer, og de fold ændringer blev beregnet af delta-delta Ct-metoden. Alle eksperimenter blev udført i tre biologiske replikater.

Western blot-analyse

totalt protein (50 ug) blev separeret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese. Efter protein overførsel til polyvinylidenfluorid mikroporøse membraner (Bio-Rad), blev membranerne blokeret med 5% fedtfri tørmælk og inkuberet sekventielt med primære antistoffer (HIF-1α 1:500; P-gp 1:200; p-actin 1 :5000), efterfulgt af inkubation med fluorescein-koblede anti-muse (anti-kanin) IgG (1:1000) og derefter inkubering med anti-fluorescein alkalisk phosphatase-konjugeret antistof (1:5000). Alle antistoffer blev købt fra Santa Cruz, CA, USA. Immunkomplekserne blev påvist med forøget kemiluminescens-reagens (Pierce, USA). For kvantificering, signaler var densitometrisk normaliseret til p-actin ved Mængde Ét billede analyse software (Bio-Rad).

HIF-1α siRNA Byggeri og transfektion

Kommende-miRNA RNAi sekvenser for målet genes HIF-1α og MDR1 blev udformet og syntetiseret. Efter at de to specifikke miRNA RNAi ekspressionsvektorer med reportergenet EmGFP targeting den humane HIF-1α og MDR1-generne henholdsvis blev konstrueret og identificeret ved restriktionsenzymfordøjelse og sekventering blev RNAi plasmider af HIF-1α og MDR1 transficeret ind LoVo-celler hjælp liposomet Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA). Stabile positive kloner blev udvalgt ved hjælp blasticidin. De grader af knockdown af HIF-1α og MDR1 blev identificeret ved PCR. De RNAi plasmider med bedre undertrykkelse effekter blev udvalgt til efterfølgende konstruktion af miRNA lentivirus udtryk kloner. To miRNA lentivirus ekspressionssystemer kloner, pLenti6 /V5-GW /EmGFP-MIR-HIF-1α og pLenti6 /V5-GW /EmGFP-MIR-MDR1, blev konstrueret ved anvendelse Gateway rekombinationsteknikker (Invitrogen) og co-transficeret ind 293FT celler med ViraPower emballagemix (Invitrogen). Titeren blev undersøgt efter infektion af NIH /3T3-celler med virus supernatant. Derefter blev LoVo-celler inficeret med de to lentivirale vektor-medieret miRNA RNAi systemer og stabilt udvalgt af blasticidin.

chromatin immunoprecipitation (chip)

Celler blev udpladet i skåle 100-mm-diameter og efter 24 timer, inkuberet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C til tværbinding proteiner til DNA. Tværbindingen reaktionen blev standset ved tilsætning af en tiendedel volumen på 1,25 mol /l glycin. Celler blev vasket to gange med iskold 1 × PBS; resuspenderet i radioimmunudfældning assaypuffer og holdt på is i 30 minutter. Derefter blev cellelysater sonikeret på is med en Hielscher UP200S ultralyd sonikator (Hielscher Ultrasonics GmbH, Tyskland), indtil de tværbundne kromatin blev klippet til opnåelse af DNA-fragmenter mellem 200 og 1000 bp. Supernatanter blev inkuberet med laksesperm DNA /protein-50% agarose opslæmning for at reducere ikke-specifik baggrund. Immunpræcipitation blev derefter udført natten over ved 4 ° C med 5 ug af anti-HIF-1α-antistof (Santa Cruz, CA, USA). Disse supernatanter blev suppleret med 5 mol /l NaCl og opvarmet natten over ved 65 ° C til revers protein-DNA-tværbindinger. Immunkomplekserne blev yderligere behandlet med DNase-fri og RNase-frit proteinase K, og DNA’et blev oprenset ved phenol /chloroformekstraktion og ethanolpræcipitation. PCR blev udført med primere specifikke for regionen som indeholder hypoxi enhancer (5′-GCGTG-3 ‘) af MDR1-promotoren [14]. De anvendte primere var som følger: 5’-GGAGCAGTCATCTGTGGTGA-3 ‘og 5′-CTCGAATGAGCTCAGGCTTC-3’. Som tidligere rapporteret [24], human vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF, en etableret HIF-1 målgen) blev anvendt som en positiv kontrol og primere flankerer hypoxi enhancer af VEGF-promotoren var 5′-GCCTCTGTCTGCCCAGCTGC-3 ‘og 5 ‘-GTGGAGCTGAGAACGGGAAGC-3’. Immunopræcipitation med ikke-specifikt IgG (Santa Cruz) blev udført som negativ kontrol. En prøve repræsenterer lineær amplifikation af det samlede input DNA blev anvendt som input kontrol.

Påvisning af apoptose ved flowcytometri (FCM)

Celler blev fremstillet og behandlet som beskrevet ovenfor og derefter farvet med allophycocyanin (APC) -konjugeret annexin V og propidiumiodid (PI) i 10 minutter ved stuetemperatur, i overensstemmelse med producentens instruktioner (annexin V-APC /PI Apoptose Detection Kit, Jingmei Biotech, Kina). Bestanden af ​​annexin V-negative levedygtige og annexin V-positive apoptotiske celler blev evalueret ved FCM. Data blev indsamlet i en FACSCalibur instrument (BD Biosciences) og analyseret ved hjælp CellQuest software (BD Biosciences).

Patienter og Tumor Prøver

Et hundrede og tyve patienter med histologisk bekræftet fremskreden coloncarcinom og som gennemgik 5-FU-baseret kemoterapi på Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, Kina, mellem 2004 og 2008 var berettiget til denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af den etiske og protokol Review Committee of the Southwest Hospital, Third Military Medical University, og alle patienter skal have skriftlig samtykkeerklæring. Patienterne var i alderen 30 til 79 år (gennemsnitsalder, 54 år); 73 var mænd, og 47 var kvinder. Kemoterapi respons blev vurderet ved CT-scanning eller andre radiografiske midler efter to cyklusser af behandlingen, vedtage de svar evalueringskriterier i solide kræftsvulster Group kriterier. Baseret på deres kemoterapi respons blev patienterne klassificeret som respondenter eller ikke-respondenter. Vævsprøver blev fikseret i 10% formalin, indlejret i paraffin og skæres i 4-um serielle snit. Ekspressionen af ​​HIF-1α og P-gp blev undersøgt ved immunohistokemi som tidligere beskrevet [12]. Klar brun-gul farvning begrænset til kerner, cytoplasma, eller cellemembranen angivne positiv ekspression af HIF-1α eller P-gp. Positiv udtryk blev registreret som (+) og negative udtryk som (-).

Statistisk analyse

Alle data er angivet som gennemsnit ± SD. Resultaterne blev analyseret ved chi-square test, Students t-test, og envejs variansanalyse (ANOVA).

s

0,05 blev betragtet som signifikant. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS version 13.0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

LoVo MCS er mere modstandsdygtige over for kemoterapi end monolag i hypoxiske betingelser

for at efterligne den hypoxiske mikromiljø af en tumor in vivo [15], [16], LoVo MCS blev opnået ved hjælp af flydende overlay teknik. LoVo celler agglomereret med hinanden og prolifererede hurtigt. Efter dyrkning i 48 timer blev LoVo MCS sammensat af et antal af agglomererede celler (Figur 1B). Kvantitativ realtids-PCR viste, at ekspression af HIF-1α var signifikant højere i LoVo MCS end i LoVo monolag, ikke kun i hypoxiske betingelser, men også i normoxi (

s Restaurant 0,05) (figur 1C). Drug følsomheder til 5-FU blev evalueret, og resultaterne viste, at LoVo MCS var mere resistente over for 5-FU end var monolag i hypoxi (

s Restaurant 0,05). Desuden er både LoVo MCS og monolag var mere resistente over for 5-FU i hypoxiske betingelser end i normoxi (figur 1D).

(A) Morfologien af ​​LoVo monolag. Scale bar = 50 um. (B) morfologi LoVo MCS. Scale bar = 50 um. (C) Kvantitativ realtids-PCR detekterede HIF-1α mRNA-ekspression i LoVo MCS og i monolag under normoxiske og hypoxiske betingelser. De 18sRNA niveauer blev anvendt som intern kontrol og fold ændringer blev beregnet af delta-delta Ct-metoden. Eksperimenterne blev udført i tre biologiske replikater og PCR for hvert gen blev gjort i dubletter (*

s Restaurant 0,05). (D) Drug følsomheder (gennemsnit ± SD, n = 3) af LoVo MCS og LoVo monolag til 5-FU i hypoxi eller normoxi (*

s

0,05, N: normoxi, H: hypoxi).

HIF-1α Hæmning Fortryder multiresistens i LoVo MCS

Fordi LoVo MCS viste mere resistens mod kemoterapi end monolag gjorde i hypoxi, ønskede vi at undersøge, om resistens ændres, når HIF- 1α ekspression inhiberes specifikt. Vi succes etableret en LoVo MCS model og stabil LVV-HIF-1α og LVV-MDR1 miR-inficerede grupper. I hypoxiske betingelser, følsomheden af ​​LoVo MCS til kemoterapi med hver af de fire lægemidler faldt i varierende grad. De 50% hæmmende koncentration (IC

50) værdier i hypoxiske gruppe var alle højere end i normoxisk gruppe (ADR, VCR, og 5-FU,

s

0,01; CPT 11,

s

0,05) (Figur 2). Efter tavshed HIF-1α gen blev følsomheden af ​​LoVo MCS til alle fire kemoterapi lægemidler restaureret i forskelligt omfang. Den relative vending forhold mellem LVV-HIF-1α miR-inficerede gruppe (hypoxi) og MCS (hypoxi) for hvert lægemiddel var som følger: ADR, 82,8% (

s

0,01); VCR, 83,8% (

s

0,01); 5-FU, 70,7% (

s

0,01); og CPT-11, 48,5% (

s

0,05). Efter tavshed MDR1-genet, den relative tilbageførsel forholdet mellem LVV-MDR1 miR-inficerede gruppe (hypoxi) og MCS (hypoxi) for hvert lægemiddel var som følger: ADR, 74,2% (

s

0,01) ; VCR, 70,9% (

s

0,01); 5-FU, 58,1% (

s

0,05); og CPT-11, 15,2% (

s

0,05)

(A) ADR.. (B) VCR. (C) 5-FU. (D) CPT-11. (E) IC50 forskellige LoVo MCS grupper kemoterapeutika (gennemsnit ± SD, n = 3, **

s

0,01, *

s

0,05, N: normoxi, H :. hypoxi)

HIF-1α Hæmning Forbedrer apoptose induceret af kemoterapi narkotika i LoVo MCS

Vi derefter observerede apoptose induceret af kemoterapi narkotika i LoVo MCS når HIF-1α udtryk blev specifikt inhiberet. Analysen af ​​apoptose ved FCM viste, at (figur 3), sammenlignet med LoVo MCS under normoxiske betingelser, de apoptotiske niveauer induceret af de fire stoffer var alle lavere i varierende grad i hypoxiske gruppe (ADR, VCR, og 5-FU,

s

0,01; CPT-11,

s

0,05). Efter effektivt silencing målgenet HIF-1α, den inducerede apoptose niveau ved ADR, video og 5-Fu blev bemærkelsesværdigt forøget (

s Restaurant 0,01) og var 9,2-fold, 7,4-fold, og 2,6 fold henholdsvis i modsætning til den for LoVo MCS (hypoxi gruppe). Ikke desto mindre apoptose niveau induceret af CPT-11 var kun 1,1-fold for hypoxi-gruppe, med ingen statistisk signifikans (

s Restaurant 0,01, N: normoxi, H: hypoxi)

MDR1 /P-gp Protein Expression reduceres i LoVo MCS efter LVV-HIF-1α miR transfektion i Hypoxi

at udforske de potentielle molekylære mekanismer i at vende MDR ved at fokusere på målgenet HIF- 1α, detekteres vi ekspressionen af ​​MDR-beslægtede gener i LoVo MCS når HIF-1α ekspression inhiberes specifikt. Western blot viste, at ekspressionen af ​​HIF-1α og P-gp i LoVo MCS blev væsentligt forbedret efter behandling i 24 timer i hypoxi (

s Restaurant 0,01). Når HIF-1α blev slået ned i LVV-HIF-1α miR inficerede MCS, både HIF-1α og P-gp proteinekspression blev nedreguleret sammenlignet med den negative kontrolgruppe (

s

0,01). Og i LVV-MDR1 miR inficerede MCS proteinet ekspressionsniveauet af HIF-1α viste ingen forskel, mens P-gp blev reduceret væsentligt i forhold til den negative kontrolgruppe (figur 4). Resultaterne viste, at MDR1 var den nedstrøms gen af ​​HIF-1α og MDR1 /P-gp-ekspression reduceres i LoVo MCS mens HIF-1α blev inhiberet.

(A) blev udført Western blot analyser. β-actin blev anvendt som intern kontrol. (B) Relative proteinniveauer (gennemsnit ± SD, n = 3) af HIF-1α og P-gp blev bestemt i hver gruppe (**

s Restaurant 0,01, N: normoxi, H: hypoxi) .

MDR1 /P-gp mRNA og protein Expression er reduceret i LoVo monolag efter LVV-HIF-1α miR transfektion i Hypoxi

Da MDR1 /P-gp proteinekspression blev reduceret i LoVo MCS efter LVV-HIF-1α miR transfektion, yderligere detekteret vi ekspressionen af ​​MDR-beslægtede gener i LoVo monolag i hypoxi. Efter stabilt inficere LoVo monolag med LVV-HIF-1α miR og LVV-MDR1 miR, Kvantitativ realtids-PCR og Western blot (figur 5) viste, at i hypoxi, mRNA og protein ekspressionsniveauer af HIF-1α og MDR1 i LVV -HIF-1α miR gruppe var signifikant lavere end de ikke-behandlede og negative kontrol MIR-grupper (

s

0,01). Men i LVV-MDR1 miR gruppe, kun de mRNA og protein ekspressionsniveauer af MDR1-genet var statistisk lavere end de ikke-behandlede og negative kontrol MIR-grupper i hypoxi (

s Restaurant 0,01) , hvorimod ingen forskelle i HIF-1α mRNA og protein blev noteret (

s

0,05).

(A, B) Kvantitativ realtids-PCR opdaget HIF-1αor MDR1 mRNA-ekspression i LoVo monolag (hypoxi) med LVV-HIF-1α miR (A) eller LVV-MDR1 miR (B) stabilt transduceret. Ikke-behandlede monolag i normoxi blev anvendt som normoxisk kontrol. De 18sRNA niveauer blev anvendt som intern kontrol og fold ændringer blev beregnet af delta-delta Ct-metoden. Eksperimenterne blev udført i tre biologiske replikater og PCR for hvert gen blev gjort i dubletter (**

s Restaurant 0,01). (C-F) Western blot detekteret HIF-1α og P-gp proteinekspression i LoVo monolag (hypoksi) med LVV-HIF-1α miR (C) eller LVV-MDR1 miR (E) stabilt transduceret. Ikke-behandlede monolag i normoxi blev anvendt som normoxisk kontrol. (D, F) Sammenligning af ekspressionsniveauer (gennemsnit ± SD, n = 3) af HIF-1α og MDR1-protein i hver gruppe (**

s Restaurant 0,01).

Binding af HIF-1α til MDR1 genpromotoren

Vi derefter udnyttet en chip assay til at vurdere i LoVo MCS (både i normoxi og hypoxi) hvorvidt HIF-1α bundet til promotorområdet af MDR1-genet. Efter udfældning af cellelysater med et specifikt anti-HIF-1α antistof, blev MDR1 genpromotoren og VEGF genpromotoren (en etableret HIF-1 målgen) amplificeret ved PCR med specifikke primere. Resultaterne (Figur 6) viste, at HIF-1α var bundet til MDR1 genpromotor i LoVo MCS ikke kun i hypoxiske betingelser, men også i normoxiske betingelser.

Bindingen af ​​HIF-1α på MDR1 og VEGF-gen promotorer blev målt ved chippen. PCR-analyse for MDR1 genpromotorregion blev udført på immunpræcipitation prøver (IP) med anti-HIF-1α-antistof og med oprenset samlede input DNA fra LoVo MCS (normoxi og hypoxi). VEGF-genpromotoren (en etableret HIF-1 målgen) blev anvendt som en positiv kontrol. Immunopræcipitation med ikke-specifikt IgG blev udført som negativ kontrol. En prøve, der repræsenterer lineær forstærkning af det samlede input DNA blev anvendt som input kontrol.

Patienter med HIF-1α (+) /P-gp (+) er mere modstandsdygtige over for kemoterapi

Vores tidligere undersøgelse har vist, at HIF-1α og MDR1 /P-gp ekspressionsniveauerne korrelerer i tumorvæv af colon carcinom [12]. For at bestemme om ekspressionen af ​​HIF-1α og MDR1 /P-gp hos patienter med tyktarmskræft adskiller, samt den tilknyttede følsomhed over for kemoterapi, blev immunohistokemiske teknikker anvendes til at detektere ekspression af HIF-1α og P-gp i tumorvæv af 120 patienter med fremskreden kolon carcinoma, der fik 5-FU-kemoterapi. Vi fandt, at 73 ud af 120 tilfælde (60,8%) udtrykte både HIF-1α og P-gp, og dette HIF-1α (+) /P-gp (+) patientpopulation var mere resistente over for kemoterapi, end det var HIF-1α ( -) /P-gp (-.) population (

s

= 0,001, OR 5,647, 95% CI 1,920 til 16,606) (tabel 1)

diskussion

Vores tidligere undersøgelse viste, at HIF-1α-proteinekspression er korreleret med P-gp-ekspression i colon carcinom væv og coloncancer-cellelinjer, og HIF-1α og MDR1 mRNA’er blev fundet at være signifikant højere i de samme celler under hypoxiske betingelser end under normoxiske betingelser [12]. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at HIF-1α direkte kan påvirke ekspressionen af ​​MDR1 /P-gp i hypoxisk mikromiljø og derefter medierer kemoterapi modstand ikke kun i dyrkede cellemonolag men også i multicellulære sfæroider, og HIF-1α hæmning kan vende multilægemiddelresistens modstand via nedregulering af MDR1 /P-gp. Meget beviser har vist, at en hypoxisk mikromiljø er befordrende for udvikling og vedligeholdelse af kræft [17]. Desuden kræftceller i hypoxiske betingelser viser mere modstand til antineoplastiske lægemidler [18], [19]. Nogle undersøgelser, der har forsøgt at forklare dette fænomen har fundet, at celler i hypoxiske betingelser generelt opdele langsommere end i normoxiske betingelser, rendering terapier, der målretter hurtigt voksende celler mindre effektivt [17]. I mellemtiden har en undersøgelse viste at hypoksi kunne inducere en række gener, herunder MDR1 /P-gp, i multicellulære sfæroider [16]. I vores undersøgelse fandt vi, at HIF-1α bundet til MDR1 genpromotor i LoVo MCS ikke kun i hypoxiske betingelser, men også i normoxiske betingelser.

Vi succes etableret en LoVo MCS model til at efterligne den hypoxiske mikromiljø af tumorer in vivo. Den kemoterapi følsomhed og apoptotiske ændringer i LoVo MCS til ADR, VCR, 5-FU, og CPT-11 blev undersøgt i normoxi og hypoxi. Resultaterne viste, at kemoterapi følsomheder og apoptose af LoVo MCS som reaktion på de fire lægemidler blev alle faldt i forskellig grad i hypoxiske betingelser. Af de fire cytotoksiske lægemidler, 5-FU og CPT-11 er de mest almindeligt anvendte i coloncancer, hvorimod resistens over for ADR og VCR menes at være nært beslægtet med MDR1 /P-gp [20]. Deaktivering af HIF-1α gen restaureret følsomheden af ​​LoVo MCS til ADR, VCR, og 5-FU og inducerede en markant stigning i apoptotiske for hver tilsvarende lægemiddel (

P

0,01). Disse resultater viser, at kan vendes lægemiddelresistens af LoVo MCS med en kombination af de LVV-HIF-1α miR systemet og ovenstående lægemidler. Dette fund er enig med de tidligere resultater, at hæmme HIF-1α kan øge følsomheden over for kemoterapeutiske stoffer i kræftceller, såsom fibrosarkom, mavekræft, og bryst carcinom [21] – [23]. Da Unruh

et

al.

[24] fandt, at antiproliferative effekt af carboplatin og etoposid er væsentligt forbedret ved inaktivering af HIF-1α i muse embryonale fibroblaster, bidrag HIF-1α til medikamentresistens er blevet observeret i forskellige typer neoplastiske celler i de senere år [21], [25] – [29]. Men de tilgængelige data om forholdet mellem HIF-1α og kemoresistens af kræftceller er modstridende. For eksempel har nogle undersøgelser vist, at inaktivering af HIF-1α i normoxi har ingen effekt på drug responser i neuroblastom- og lunge adenocarcinomceller [30], [31]. Nylige undersøgelser har også argumenteret for en modstand-medierende effekt af HIF-1α, i det mindste i nogle menneskelige kræftformer [4]. Derudover fandt vi var der en tendens til mere følsomhed efter HIF-1α eller MDR1 inhibering, men kemoterapi følsomheder til CPT-11 var ikke signifikant forskellige i de LoVo MCS grupperne. Resultatet viste, at den mekanisme af kemoresistens til CPT-11 ikke afhang af P-gp, men snarere gik gennem en anden vej, såsom CPT-11 metabolisk produkt SN-38 [32] – [34].

Den mekanisme, hvorved HIF-1α bidrager til MDR er kompleks og forblev uklar. HIF-1α kan mediere MDR ved at regulere lægemiddel efflux, ændring celleproliferation og overlevelse, inhibering DNA-skade, eller omprogrammere metabolisme. Som en af ​​de vigtigste medlemmer af ABC transporter familien, MDR1 /P-gp reducerer de intracellulære koncentrationer af cytotoksiske lægemidler ved aktivt at pumpe lægemidlerne ud af cellerne og derved beskytte cancerceller fra deres antitumorvirkninger [35]. MDR1 er et målgen af ​​HIF-1. I de senere år er bidraget af HIF-1-medieret P-gp-ekspression for hypoxi-induceret lægemiddelresistens er blevet observeret i mange tumorceller, såsom gastrisk cancer, gliomer og brystcarcinomer [14], [21], [26 ], [36]. I denne undersøgelse viste vi, at ekspressionen af ​​HIF-1α og P-gp blev signifikant forøget i LoVo MCS efter behandling i hypoxi. HIF-1α inhibering ved transfektion af celler med en specifik siRNA for HIF-1α faldt betydeligt ekspressionen af ​​MDR1 /P-gp mRNA og protein i både LoVo monolag og LoVo MCS. Endvidere blev HIF-1α bundet til MDR1 genpromotoren direkte. Vi viste, at HIF-1α aktivering direkte kan inducere ekspression af MDR1 /P-gp og så føre til MDR.

For at bestemme, om ekspression af HIF-1α og MDR1 /P-gp i tyktarmskræft adskiller patienter samt den tilknyttede følsomhed over for kemoterapi, blev immunohistokemi anvendes til detektion af ekspressionen af ​​HIF-1α og P-gp i tumorvæv af 120 patienter med fremskreden coloncarcinom som fik 5-FU-baseret kemoterapi. Vi fandt, at 73 ud af 120 tilfælde (60,8%) udtrykte både HIF-1α og P-gp, og dette HIF-1α (+) /P-gp (+) patientpopulation var mere resistente over for kemoterapi, end det var HIF-1α ( -) /P-gp (-) befolkning. Derfor HIF-1α /MDR1 kan være et lovende mål i tyktarmskræft behandling, og tilbageførsel af tyktarmskræft MDR kan opnås, når HIF-1α /MDR1 udtryk er specielt hæmmet. Vi foreslår, at ekspression af HIF-1α og MDR1 /P-gp kan anvendes som en prædiktiv markør for kemoterapi modstand i tyktarmskræft.

Afslutningsvis rapporterer vi, at HIF-1α inhibering reverserer MDR i coloncancer celler, som er forbundet med nedregulering af MDR1 /P-gp. Vores resultater kan have bred klinisk betydning for kolon patienter med HIF-1α (+) /P-gp (+) ekspressionsmønstre og kombinationsterapier formål at modulere HIF-1α ekspression i koncert med standard kemoterapi kan tilvejebringe en strategi til at overvinde tumor resistens.