PLoS ONE: Potente Sensibilisering af kræftceller til Anticancer Drugs af en Quadruple mutant af menneskelige deoxycytidin Kinase

Abstrakt

Identifikation enzymer,, når disse er indført i kræftceller, føre til en øget effektivitet i behandling udgør en vigtig mål for biomedicinske anvendelser. Hjælp af en original fremgangsmåde, hvorved mutantgener genereres baseret på anvendelsen af ​​betingede lentivector genom mobilisering, vi for nylig beskrevet, for første gang, identifikation af en human deoxycytidinkinase (dCK) mutant (G12), der sensibiliserer et panel af cancercellelinjer til behandling med DCK analog gemcitabin. Her starter fra G12-varianten selv, genereret vi et nyt bibliotek og identificeret en mutant (M36), der udløser endnu større sensibilisering til gemcitabin end G12. Med hensyn til G12, M36 er en yderligere mutation placeret i området, der udgør grænsefladen af ​​DCK dimer. Den blotte tilstedeværelse af denne mutation halvdele både IC50 og andelen af ​​resterende celler er resistente over for behandlingen. Endvidere er anvendelsen af ​​vektorer med selvinaktiverende LTR’er fører til en forøget følsomhed over for behandling, et resultat forenelig med et relief af den transkriptionelle interferens udøves af U3-promotoren på det interne promotor, som driver ekspressionen af ​​M36. Vigtigere, er en bemærkelsesværdig effekt også observeret i behandlinger med anticancer sammensatte cytarabin (AraC), for hvilke en 10.000 gange fald i IC50 indtraf. Ved at udløse sensibilisering af forskellige cancer celletyper med dårlig prognose til to almindeligt anvendte anticancer forbindelser M36 er en lovende kandidat til selvmord gen tilgange

Henvisning:. Coulibaly ST, Rossolillo P, Vinter F, Kretzschmar FK, Braye M Martin DP, et al. (2015) Potent Sensibilisering af kræftceller til anticancerlægemidler ved en Quadruple Mutant af Human deoxycytidinkinase. PLoS ONE 10 (10): e0140741. doi: 10,1371 /journal.pone.0140741

Redaktør: Jean-Luc EPH Darlix, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, FRANCE

Modtaget: Juni 11, 2015; Accepteret: September 30, 2015; Udgivet: 20 oktober 2015

Copyright: © 2015 Coulibaly et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Ligue Contre le Cancer (https://www.ligue-cancer.net), appel d’offre konference de Koordinering Interregionale du Grand Est 2012 til MN. S. Coulibaly er modtager af et fællesskab fra det franske “Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche”

Konkurrerende interesser:. Den retrovolution metode og mutanterne beskrevet i nærværende dokument var omfattet af patenter, for mere information om licenser kan du kontakte den tilsvarende forfatter.

Introduktion

Induktion død af kræftceller via genterapi er et vigtigt mål for biomedicinske anvendelser. Den største hindring for denne præstation er muligheden for at levere specifikt til kræftceller transgener, der fører til celledød: en proces opnås med dårlig effektivitet

in vivo

[1]. En yderligere vanskelighed udgøres af effektiviteten, hvormed transgenet inducerer død af den modificerede celle. Celledød kan induceres enten konstitutivt eller som reaktion på udsættelse for kemiske forbindelser, såsom en anticancer narkotika [1]. Metoden med et gen med en inducerbar toksicitet har den fordel at være af interesse også inden for sikkerheds-gener, der tillader negativ selektion af transplanterede celler i genterapifremgangsmåder. I disse tilfælde er tilstedeværelsen af ​​en sikkerhed gen er væsentlig i tilfælde af en neoplastisk transformation efter transplantation af celler eller, til adoptiv immunterapi, i tilfælde af at udvikle en graft versus host reaktion [2]. Den selvmordsgen mest hyppigt anvendt hidtil til disse formål har været thymidinkinasegenet fra herpes simplex virus (hsTK) koblet med gancyclovir behandling [3-5]. Men på grund af sin viral oprindelse, den hsTK præsenterer er ulempen ved at inducere et immunrespons på TK-afledte epitoper [6], hvilket tyder på, at den erstattes af mindre immunogene proteiner potentielt kan øge effektiviteten af ​​denne fremgangsmåde. Af disse grunde vil en humane enzym udgør en ideel kandidat.

I denne henseende har den menneskelige deoxycytidinkinase (dCK) tiltrak en masse interesse. Udover at være involveret i frelsesyntesevejen der konverterer genanvendte deoxyribonucleosider i dNTP [7], dette enzym katalyserer det første hastighedsbegrænsende, phosphorylering trin til aktivering af forskellige deoxycytidinanaloger (DCA), der anvendes i kliniske behandlinger af forskellige kræftformer. Gemcitabin er et af disse stoffer. Det er almindeligt anvendt til behandling af flere kræftformer, såsom kræft i bugspytkirtlen, metastatisk ikke-småcellet lunge- og brystcancer, samt ovariecancere; som alle er forbundet med dårlig prognose [8-13]. DCK’en er også involveret i aktiveringen af ​​andre forbindelser, som er strukturelt relateret til deoxycytidin og anvendes som anti-cancer- eller anti-virale lægemidler. En sådanne lægemidler er AraC (cytosinarabinosid), som for det meste anvendes til behandling af leukæmier, såsom akut myeloid leukæmi (AML) [14].

I mange tilfælde DCK’en bestemmer graden af ​​følsomhed af celler til behandling med gemcitabin eller AraC. En korrelation mellem niveauet af dCK udtryk og følsomhed over for behandling med DCA faktisk er blevet observeret hos patienter behandlet for hårcelleleukæmi og kronisk lymfatisk leukæmi [15] og i forskellige brystkræft cellelinjer [16]. Et link mellem ekspression af dCK, ophobning og fastholdelse af intracellulære gemcitabin pool niveauer og gemcitabin inkorporering i DNA er også blevet rapporteret [17-19], samt en sammenhæng mellem før behandling niveauer af intracellulær dCK og følsomhed over for gemcitabin [ ,,,0],20]. En tilsvarende sammenhæng er blevet rapporteret for AraC [21]. Desuden exogene overekspression af dCK i gliomaceller af retrovirale eller adenovirale vektorer fører til forøget følsomhed over for den cytotoksiske virkning af cytosinarabinosid

in vitro

in vivo

[22]. Omvendt mangler i dCK aktivitet fører til resistens over for behandling med enten gemcitabin [18, 23, 24] eller med AraC [25-27].

Dermed nærmer muligheden for at forudse genterapi baseret på indsættelse af ekstra kopier af DCK-genet i cancerceller synes lovende og muligheden for at frembringe varianter af dCK med forbedret DCA phosphorylering aktivitet er et vigtigt mål på området. Rationelle forsøg på at designe DCK mutanter med sådanne egenskaber er foretaget tidligere, enten baseret på strukturel information [28] eller på virkningen af ​​post-translationelle modifikationer af proteinet, der er blevet observeret at forbedre dets enzymatiske aktivitet

in vivo

[29, 30]. Selv om disse undersøgelser lykkedes at få dCK varianter med forbedret evne til at phosphorylere og aktivere gemcitabin, blev denne aktivitet parallelt med en langt mere markant forøgelse af phosphorylering af det naturlige substrat dC [28, 30]. Da konkurrencen om dCK enzymet mellem naturlige substrat og indgående medikamentmolekyler er afgørende for effektiviteten af ​​celledød induktion [31, 32], denne funktion foreslået, at sådanne mutanter engang indført i kræftcellerne ikke ville have fremkaldt en sensibilisering på behandlingen. For en af ​​disse (den tredobbelte mutant A100V, R104M, D133A) [28], blev det faktisk rapporteret, at dens indførelse i Messa10K celler, uterine sarcomaceller resistente over for gemcitabin [33], resulterede ikke sensibilisering til dette stof [34].

Vi har for nylig udviklet en eksperimentel fremgangsmåde (retrovolution) når et gen af ​​interesse indsættes i betingede replikationsdefekte VSV-pseudotype HIV-1 afledte vektorer, der anvendes til at efterligne multiple infektiøse cyklusser, hvorunder sekvensen af ​​interesse akkumuleres mutationer som følge af fejlbehæftede karakter af HIV-1 replikation maskiner [34]. Dette genererer et bibliotek af varianter af genet af interesse, der allerede er indsat i en biologisk vektor passende for en effektiv levering af transgenet til humane celler, som derefter kan direkte screenes for den ønskede fænotype. Under anvendelse, som en sekvens af interesse, den cDNA, der koder for den humane dCK, isoleret vi en mutant, opkaldt G12, som inducerer en 300-fold sensibilisering over for gemcitabin i celler oprindeligt er resistente over for dette lægemiddel (Messa 10K), en effekt 60 gange stærkere end hos kontroller celler, hvor en ekstra kopi af den vægt dCK var blevet indsat [34]. Denne mutant er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​tre mutationer, der ligger i positioner af proteinet fjernt fra det aktive sted, og som derfor sandsynligvis ikke have været forudsagt på et rationelt grundlag. En af disse mutationer, E171K, er beliggende i en region involveret i frembringelsen af ​​grænsefladen af ​​DCK dimer. De andre to mutationer (E247K og L249M) i stedet er placeret i “base-sensing loop”, som modulerer foldningen af ​​proteinet ved binding af phosphatdonoren (ATP eller UTP), (S1 Fig) [28]. Ingen ændring af graden af ​​dimerisering blev dog observeret

in vitro

for mutanten, hvilket tyder på, at årsagen til den øgede gemcitabin følsomhed, at det inducerer ikke kan henføres til en ændring i sit udtryk udtrykket niveau [34], men skyldes muligvis en ændring af den overordnede struktur af enzymet.

G12 blev isoleret efter screening af biblioteket er resultatet af 17 på hinanden følgende cyklusser af retrovolution [34]. Herved blev mutationer indført tilfældigt i genet med nogen ekstern selektionstryk anvendt under den procedure, der favoriserer isoleringen af ​​den ønskede fænotype. Spørgsmålet om muligheden for at isolere en mutant med en endnu større grad af gemcitabin overfølsomhed aktivitet end G12 er udgangspunktet for den foreliggende undersøgelse.

Materialer og Metoder

Cellelinjer

HEK-293T-celler blev opnået fra American Type Culture Collection og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) suppleret med 10% FBS og 100 U /ml pennicillin-100 mg /ml streptomycin . Messa10K celler blev venligst stillet til rådighed af LPJordheim (Lyon, Frankrig) og dyrket i RPMI medium suppleret med 10% FBS og penicillin-streptomycin.

Retrovolution cyklusser ved lentivector partikler

Til at starte eksperimenterne førende til generation af F27-RL (hvor RL står for tilfældig bibliotek), otte 10-cm plader indeholdende 5×10

6 celler fra populationen af ​​HEK 293T-celler, der blev brugt til at identificere G12 klon (F16, reference [34 ]) blev transficeret under anvendelse af calciumphosphat-protokollen, med 10 ug pCMVΔR8.91 plasmid [35] og 5 ug pHCMV-G-plasmid [36], for at generere den virale-lignende population F17-RL. Den samme fremgangsmåde blev anvendt til at starte eksperimenterne fører til frembringelse af F11-DL, men i dette tilfælde den indledende transfektion med pCMVΔR8.91 og pHCMV-G plasmider blev udført på en HEK 293T cellelinie tidligere dannet til stabilt at udtrykke den lentivector genomiske RNA kodende G12 [34]. I dette tilfælde frembragte den virale-lignende population blev kaldt F1-DL (hvor DL ​​står for styret bibliotek). Disse virale-lignende populationer (F17-RL og F1-DL) blev derefter anvendt til selvstændigt at transducere friske HEK 293T-celler til at fortsætte med retrovolution procedure parallelt hermed, som beskrevet i reference [34]. Vi udførte yderligere 11 retrovolution cykler, hvilket fører til frembringelsen af ​​F27-RL og af F11-DL cellepopulationer hhv. Transfektioner i cyklusserne af retrovolution blev opnået med 10 ug pCMVΔR8.91 og 5 ug pHCMV-G plasmid på 8 10-cm plader indeholdende 5×10

6 celler fra populationen af ​​HEK 293T celler fra den foregående retrovolution cyklus . For proceduren transduktion under cyklusser af retrovolution blev lentivector supernatant opsamlet 48 timer efter transfektion, filtreret gennem et 0,45 um filter og koncentreret 40 gange i VIVASPIN 20-søjler (MWCO 50 kDa, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, Frankrig). Transduktion betingelser afveg når de udføres for at generere genetisk diversitet (retrovolution cykler) og når de udføres for at isolere enkelte kloner til screening af biblioteket. For retrovolution cyklusser, 5×10

6 HEK-293T-celler blev transduceret med 1 ml koncentreret lentivirale vektorer (se ovenfor) og puromycinselektion blev påført 24 timer efter transduktion. Under disse betingelser 90-100% af de transducerede celler var resistente overfor puromycin, hvilket indikerer, at i det mindste for størstedelen af ​​cellerne, flerheden af ​​transduktion var højere end en. Transduktioner til isolering af enkelte kloner var i stedet udføres ved varierende fortyndinger af lentivirale vektorer baseret på titerne anslået ved ELISA rettet mod HIV-1 p24 capsidprotein (Innotest HIV-antigen-mAb, Innogenetics, Gent, Belgien). Hundrede celler blev derefter podet per brønd i plader med 96 brønde i DMEM. Puromycinselektion blev påført 24 timer efter transduktion ved tilsætning puromycin ved koncentrationer på 0,6 ug /ml for HEK-293T-celler, 0,6 ug /ml for HEK-293T-CD4

+ celler, 0,5 ug /ml for Messa10K celler. Vi valgte betingelser, hvor i gennemsnit 5 brønde per plade resulterede positivt at cellevækst i nærvær af puromycin. Under disse betingelser, mangfoldigheden af ​​transduktion var 5×10

-4 per celle sikre, at i hver brønd cellepopulationen blev genereret ved transduktion med en enkelt lentiviral vektor.

Amplifikation og sekventering af DCK-kodende del af det provirale DNA

Puromycinresistente kloner fra F27-RL og F11-DL generationer blev isoleret ved begrænsende fortynding og ekspanderet i 6-brøndsplader. Celler fra de enkelte kloner blev derefter isoleret og lyseret med 250 pi Cell Direkte PCR (Viagen Biotech, Los Angeles, CA, USA). DCK transgen blev amplificeret fra 1 pi af lysatet med oligonukleotider på vektoren, EF1 (5′-gatgtcgtgtactggctccg-3 ‘) og PGK (5-gatgtggaatgtgtgcgagg-3’), som flankerer transgenet. Sekventering af PCR fragmentet blev udført af GATC sekventering tjeneste (GATC Biotech, Konstanz, Tyskland).

Beregning af frekvensen af ​​mutationer i bibliotekerne

For F27-RL og F11- DL biblioteker antallet af mutationer fundet i DCK-kodende sekvens blev beregnet ud fra dataene i tabel 1 som: (m /(783 xc)) /y, hvor m er antallet af muterede positioner, 783 er størrelsen af ​​den dCK kodende-sekvens i basepar, c er antallet af kloner sekventeret og y er antallet af cyklusser af retrovolution udført. For F11-DL bibliotek start sekvens for beregning af mutationsrater var rækkefølgen af ​​G12.

permutation test for forekomst af synonyme og ikke synonyme mutationer langs dCK protein

En permutation test blev udført ved at simulere forekomsten af ​​mutationer i de to halvdele af den proteinkodende sekvens (dvs. på begge sider af codon 130) baseret på den konstaterede hyppigheden af ​​forekomsten af ​​tilfældige mutationer og af præferentielle mutationer i APOBEC3F konsensussekvenser (29,1 og 70,9% henholdsvis se tabel 1). Den relative forekomst af synonyme og ikke-synonyme mutationer opnået eksperimentelt blev sammenlignet med den for 10.000 simulerede datasæt. Andelen af ​​simulerede datasæt med ikke synonyme /synonyme (dn /DS) mutation forhold lavere end eller lig med dem af den reelle datasæt blev derefter taget som sandsynligheden for, at der var en signifikant tendens i regionen anses for forekomsten af ​​mere synonyme mutationer end forventet på en stokastisk basis. Omvendt blev andelen af ​​simulerede datasæt med dn /dS-forhold højere end eller lig med dem af den reelle datasæt derefter taget som sandsynligheden for, at der var en signifikant tendens i regionen anses for forekomsten af ​​flere ikke-synonyme mutationer end forventet på en stokastisk basis.

Test af følsomhed over for lægemidler mod cancer

celler huser integrerede lentivirale vektor genomer (G12, M36, enkelt eller dobbelt-mutanter) blev podet ved 5 000 celler per brønd i en 96 brønds plade og dyrket natten over ved 37 ° C. For hver population blev udført in duplo. Tolv timer efter podning stigende koncentrationer af gemcitabin (0-400 nM) eller AraC (0-10 mM) blev tilsat til hver brønd og efterladt i kultur i en yderligere 72 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af MTT testen (CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Fitchburg, WI, USA) og antallet af levende celler i hver brønd blev vurderet ved måling af OD ved 570 nm. For hver population, blev den del af levende celler beregnet som OD570 koncentration X perle /OD570 koncentration 0 perle, at estimere følsomheden af ​​befolkningen til prodrug.

Test af følsomhed over for antivirale lægemidler

Lentivirale vektorer blev genereret ved transfektion under anvendelse af calciumphosphat-protokol, HEK-293T-celler med 10 ug pCMV ΔR8.91 plasmid [35], 5 ug pHCMV-G-plasmid [36], og 10 ug af genomisk plasmid SDY-dCK (beskrevet i Rossolillo et al. [34]) i sin sIN version (se resultater), der koder enten for vildtypesekvensen af ​​det humane dCK eller M36 variant. Adskillige transduktioner, under anvendelse af forskellige mængder af lentiviral vektor, blev udført på 1×10

6 HEK-293T-CD4 + celler [37] og transducerede celler blev selekteret i nærværelse af 0,6 ug /ml puromycin, tilsat 24 timer efter transduktion. Kun transduktion betingelser, der giver 50 til 200 individuelle puromycin-resistente kloner (hver klon afledt fra en celle transduceret med en enkelt lentiviral vektor) blev lagret, og alle klonerne blev samlet og udvidet til opnåelse af et polyklonalt HEK-293T-CD4 + cellepopulation enten udtrykker et ekstra kopi af wt dCK enzym eller en kopi af M36 (HEK 293T /CD4

+ – SINvec-wtdCK eller HEK 293T /CD4

+ – SINvec-M36, henholdsvis). Vektorer til overvågning af effektiviteten af ​​transduktion i nærvær af antivirale lægemidler blev genereret ved transfektion af tolv 10-cm plader indeholdende 5×10

6 HEK 293T-celler med 10 ug pTOPO plasmidet i hvilken der koder for HIV-1 hylster ADA [38] var blevet indsat [39], og 10 ug pNL4.3-Env

-Luc +, der koder for ildflueluciferase, som tidligere beskrevet [40]. De resulterende lentivectors blev opkoncentreret som beskrevet tidligere [34]. Transduktion af 2.5×10

5 HEK 293T /CD4

+ – SINvec-wtdCK celler og HEK 293T /CD4

+ – SINvec-M36-celler blev udført parallelt ved anvendelse af 1 ml hver af koncentreret lentiviral vektor. Fem timer efter transduktion celler blev podet ved 5×10

4 celler /brønd i en 6-brønds plade i nærværelse af stigende koncentrationer af den anti-virale forbindelser ddC eller 3TC. Effektiviteten af ​​transduktionen blev derefter overvåget 48 timer efter transduktion gennem ekspression af luciferasegenet. Til dette, blev mediet fjernet, cellerne blev vasket to gange i PBS, lyseret, centrifugeret, og supernatanten blev derefter anvendt til at måle luciferaseaktivitet ifølge producentens protokol (Promega, Fitchburg, WI, USA) med en Glomax luminometer (Promega, Fitchburg, WI, USA), som tidligere beskrevet [40].

Western blot-analyser

Messa10K cellelinjer, der udtrykker enten M36, både i forbindelse med en lentiviral vektor-DNA med en funktionel LTR eller med en inaktiveret LTR blev lyseret i 1X RIPA-buffer (25 mM Tris-HCI, 1% IGEPAL, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholat 150 mM NaCl, proteaseinhibitor) og 30, 60 og 120 pg totalt protein (bedømt ved Bradford-assay) for hver celle type blev sat på en 12% bis-tricin-gel (Invitrogen, Carlsbad, NM, USA). Efter overførsel på PVDF-membran blev DCK proteiner analyseret ved Western blot med 1: 4000 fortynding af et polyklonalt anti-dCK antistof (kanin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 1: 3000 fortynding af et anti kanin HRP-konjugeret sekundært antistof (BioRad, Hercules, CA, USA) med binding blive opdaget af kemoluminescens (Pierce ECL vestlige Blotting substrat, Thermo Scientific).

Produktion og oprensning af rekombinante DCK proteiner

WT-DCK og M36 sekvenser blev klonet i pET14b plasmid og udtrykkes i

E

.

coli

celler BL21 DE3 pLysE. Proteinekspression blev induceret ved tilsætning af 0,1 mM IPTG, og cellerne blev opsamlet efter 4 timer af vækst ved 37 ° C. Hans-mærkede proteiner blev elueret med 250 mM imidazol fra His-Trap TM FF Kolonner (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, UK), at histidin tag blev fjernet ved hjælp af S-Tag Thrombin Purification Kit (Novagen, Madison, WI, USA ), og dCK og M36 blev yderligere renset ved gelfiltrering på S-200 Sephacryl søjler (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, UK).

fosforylering test

in vitro

effektiviteten af ​​phosphorylering af det naturlige substrat deoxycytidin og prolægemidler gemcitabin og AraC blev målt for oprenset wt-dCK og M36 i en NADH-baseret assay som tidligere beskrevet [41]. Alle reagenser blev købt hos Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bortset gemcitabin (Lilly, Indianapolis, IN, USA). Enzymer blev analyseret ved stuetemperatur i en koncentration på 0,9 uM for dC, og 0,3 uM for både gemcitabin og AraC. dC blev anvendt ved koncentrationer mellem 5 og 50 uM, gemcitabin ved koncentrationer mellem 20 um og 1 mM og AraC ved koncentrationer mellem 10 pM og 0,5 mM. ATP blev anvendt i en koncentration på 4 mM.

statistiske analyser

For at vurdere, om de gennemsnitlige mængder af celledød, der forekommer i de Messa10K befolkninger, der indeholder forskellige DCK varianter var signifikant forskellige fra værdien vist ved Messa10K vægt-dCK blev en to prøve t-test anvendt for de forskellige koncentrationer af Gemcitabin.

Resultater

Bidrag af de enkelte mutationer af G12 til oplysningsprogrammer at gemcitabin

ved hjælp af en ny metode til styret humant gen evolution som vi har udviklet i vores laboratorium, vi tidligere beskrevet isolering og karakterisering af en dCK mutant, opkaldt G12, der inducerer sensibilisering af cancerceller til behandling med anticancer forbindelse gemcitabin [34]. G12 er karakteriseret ved tre mutationer i forhold til vildtype dCK enzym. Det har imidlertid været ubestemt, om overfølsomhed aktivitet observeret i G12 afhænger af tilstedeværelsen af ​​alle tre mutationer og i bekræftende fald, hvad den relative bidrag af hver af disse mutationer til G12 fænotype er. For at løse disse problemer, vi bygget seks mutanter, tre indeholdende enten E171K, den E247K, eller L249M mutationen alene, og tre indeholder to mutationer hver, som dækker alle de mulige kombinationer af dobbelte mutanter (E171K /E247K, E171K /L249M, og E247K /L249M). Mutanterne blev indsat i den tidligere beskrevne pSDY plasmid [34], og anvendes til transfektion med transcomplementation plasmider som beskrevet i Materialer og metoder, for at generere lentivirusvektorer. Med hensyn til de pSDY plasmider vi tidligere beskrevet [34], plasmiderne vi brugte (pSDY-SIN) indeholdt en delvist deleteret og derfor ikke-funktionel version af 3’U3-sekvensen (figur 1A). De resulterende lentivirusvektorer vil generere, efter revers transkription, ikke-funktionelle LTR-sekvenser og kaldes derfor selvstændige inaktivere (SIN) vektorer (SDY-SIN i vores tilfælde). Disse lentivectors blev valgt til denne test til deres relevans for biomedicinske anvendelser. Som kontroller blev G12 og wt DCK sekvenser også indsat i pSDY-SIN plasmid. For hver variant af dCK blev lentivectors anvendt til at etablere en polyklonal population af Messa 10K celler. Disse polyklonale populationer (SINvec-G12 population for G12, SINvec-wt dCK for wt dCK, SINvec-E171K for E171K mutanter, og så videre) blev dannet ved at transducere 10

6 HEK 293T celler med forskellige mængder af lentiviral vektor i for at opnå, efter puromycinselektion, 50 til 200 individuelle kloner. Denne måde, hver klon blev næsten helt sikkert afledt af en celle, der indeholder en enkelt integreret kopi af proviral DNA. Klonerne blev derefter poolet sikre, at den resulterende population bestod af celler, der bærer samme transgen, men med genet integreret på forskellige steder i genomet, hvorved gennemsnit over mulige virkninger, som kan være henføres til integration site. Det faktum, at cellerne indeholdt en enkelt kopi af transgenet tillod udelukkelse, når man sammenligner populationer med hinanden, af mulige dosis virkninger på grund af antallet af transgen integreret. Sensibilisering til gemcitabin blev derefter vurderet ved MTT test. Til dette formål blev de forskellige Messa 10K polyklonale populationer μded i 96-brønds plader, udsættes for varierende koncentrationer af gemcitabin, og celleoverlevelse blev målt for hver tilstand som tidligere beskrevet [34].

Panel A. Struktur af det genomiske RNA genereret af transkription efter transfektion af celler med pSDY-SIN plasmider. R, gentaget sekvens fra HIV-1-genomet; U5, 5 ‘unik sekvens af HIV-1 LTR; Cis-virkende, sekvenser, der kræves til pakning og revers transkription af det genomiske RNA; EF1-alfa, human elongation faktor 1-alpha-promotoren; hPGK, human phosphoglyceratkinase promotor; Puro, puromycin N-acetyl-transferase-genet; AU3, delvist deleteret version af 3’unik sekvens af HIV-1 LTR. Paneler B og C. Andelen af ​​levende celler i det samlede antal celler som funktion af koncentrationen i gemcitabin gives som et forhold med hensyn til de levende celler observeret i fravær af lægemiddel. Hvide symboler repræsenterer referencepopulationer i begge paneler og. grå symboler repræsenterer enkelt og dobbelt mutanter (som beskrevet i hovedteksten). Da enkelte og dobbelte mutanter blev testet parallelt i det samme forsøg. Dataene er gennemsnittet af 3 uafhængige forsøg. Fejl barer er ikke vist for overskuelighedens skyld.

De tre enkelte mutanter (grå symboler Fig 1B) gav respons kurver i samme område som reference wt dCK population (hvide firkanter). De samme resultater blev opnået for de dobbelte mutanter E171K /E247K, og E247K /L249M (grå trekanter og cirkler i figur 1C, henholdsvis). Alle tre af de enkelte mutanter og to af de tre dobbelte mutanter, der blev testet var ude af stand til at inducere gemcitabin sensibilisering mere effektivt end var opnåeligt med en ekstra kopi af wt dCK genet. Den tredje dobbelt mutant, E171K /L249M (grå firkanter i figur 1C), gav et resultat svarende til den observeret for wt Messa 10K-celler (hvide trekanter i figur), hvilket tyder på, at en inaktivering af dCK aktivitet fandt sted for denne mutant, forlader celler frataget dCK aktivitet (som det er tilfældet med den originale Messa 10K linje). Afslutningsvis, da ingen af ​​de enkelt og dobbelt mutanter viste en respons-kurve, der svarer til G12 (hvide cirkler i figur), den samtidige tilstedeværelse af de tre mutationer tilsyneladende kræves for at opnå den overfølsomhed fænotype observeret med G12.

Generering af biblioteker ved hjælp af “tilfældig” versus “instrueret” evolution

G12 mutant var blevet isoleret, startende fra wt dCK sekvens, fra et bibliotek af dCK varianter opnået efter 17 generationer af retrovolution (kaldet F16 den første generation udgøres af den parentale vektorer P [34]). Her undersøgte vi, om udførelse retrovolution startende fra G12-sekvensen i stedet for den wt dCK sekvens, ville give mutanter med en yderligere forbedret fænotype. Til dette formål HEK 293T cellelinie stabilt udtrykker G12, som vi tidligere genererede [34], blev anvendt til at starte 11 cyklusser af retrovolution, ved transfektion med transcomplementation plasmider pCMVΔR 8.91 og pHCMV-G [35, 36] som beskrevet i Materialer og Metoder og skitseret i figur 2. Dette førte til dannelsen af ​​befolkningen i HEK 293T-celle bibliotek vi kalder F11-DL (for F11 rettet bibliotek). Parallelt med henblik på at vurdere muligheden for at isolere mutanter med en forbedret fænotype i forhold til G12 simpelthen ved at fortsætte retrovolution procedure, der førte til isoleringen af ​​G12, udførte vi også yderligere 11 cykler af retrovolution på hele F16 population, G12 blev isoleret [34], således at nå F27 generation (vi kalder F27-RL, for F27 random bibliotek).

den generelle opbygning af de genomiske RNA’er, der anvendes til retrovolution gives i toppen, på venstre for F16 befolkning og til højre for befolkningen, der kun indeholder den G12 variant. Proceduren er tidligere blevet beskrevet [34] og består i gentagne transduktion af HEK 293T celler med lentivirusvektorerne efterfulgt af udvælgelse, med puromycin, af cellepopulationer, der har stabilt integreret den provirale DNA, der er blevet produceret ved revers transkription. Transfektion af denne population med transcomplementation plasmiderne pHCMV-G og pCMVΔ8.91 (se hovedteksten) muliggør fremstilling af den næste vektor generation, anvendes derefter til at transducere friske HEK 293T-celler under gentagne cyklusser af udvælgelse, transfektion og transduktion. Til screening, er målceller transduceres af mindre end en lentivector partikel per celle, og individuelle kloner blev isoleret i nærvær af puromycin. Screening for sensibilisering til forskellige forbindelser udføres som beskrevet i hovedteksten.

For at isolere de enkelte kloner fra hvert bibliotek, for den sidste cyklus af retrovolution F10-DL og F26-RL viruslignende populationer blev anvendt til selvstændigt at transducere friske HEK 293T-celler ved en multiplicitet på vektorpartikler per celle, der var væsentligt lavere end 1. transducerede celler blev podet i plader med 96 brønde, og selektion med puromycin blev påført som beskrevet i materialer og metoder, sådan en måde, at hver klon indeholdt en enkelt kopi af transgenet. Individuelle kloner blev ekspanderet og anvendt til sekventering analyse. For den funktionelle screening af bibliotekerne blev HEK 293T kloner isoleret ved denne fremgangsmåde transficeres med transcomplementation plasmider, og de resulterende viruslignende populationer blev anvendt til at transducere Messa 10K celler til at generere polyklonale populationer, som beskrevet ovenfor. De resulterende populationer blev anvendt til at teste for sensitivitet over for anticancer og antivirale forbindelser.

Sekventering af de biblioteker

At evaluere kompleksiteten af ​​biblioteket og karakterisere arten af ​​mutationerne genereret under 11 cykler af retrovolution der blev udført i DL og i RL-biblioteker, 41 HEK 293T kloner fra F27-RL og 43 fra F11-DL blev sekventeret i DCK-kodende region, efter PCR amplifikation fra proviralt DNA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.