PLoS ONE: diosgenin, en steroide saponin, Forhindrer Migration og Invasion of Human Prostata Cancer PC-3 Cells ved at reducere matricemetalloproteinaser Expression

Abstrakt

Baggrund

diosgenin, en steroid saponin fås fra bukkehorn (

Trigonella foenum graecum

), viste sig at udøve anti-kræftfremkaldende egenskaber, såsom at hæmme proliferation og inducere apoptose i en række forskellige tumorceller. Men virkningen af ​​diosgenin på cancermetastase fortsat uklar. Formålet med undersøgelsen er at undersøge effekten af ​​diosgenin om migration og invasion i human prostatacancer PC-3 celler.

Metoder og vigtigste resultater

diosgenin hæmmede spredning af PC-3 celler i en dosisafhængig måde. Ved behandling med ikke-toksiske doser af diosgenin, blev cellemigration og invasion markant undertrykt ved in vitro sårheling assay og Boyden kammer invasion assay, hhv. Endvidere diosgenin reducerede aktiviteter matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) og MMP-9 ved gelatinezymografi assay. MRNA-niveauet af MMP-2, -9, -7 og ekstracellulær inducer af matrixmetalloproteinase (EMMPRIN) blev også undertrykt, mens vævsinhibitor af metalloproteinase-2 (TIMP-2) blev forhøjet med diosgenin. Desuden diosgenin afskaffet ekspressionen af ​​vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) i PC-3-celler og rør-dannelse af endotelceller. Vores immunoblotting assays indikerede, at diosgenin kraftigt undertrykt phosphoryleringen af ​​phosphatidylinositide-3-kinase (PI3K), Akt, ekstracellulært signal regulering kinase (ERK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK). Desuden diosgenin faldt betydeligt den nukleare niveau af nuklear faktor kappa B (NF

κ

B), tyder på, at diosgenin hæmmede NF-KB-aktivitet.

Konklusion /Betydning

resultaterne antydede, at diosgenin inhiberede migration og invasion af PC-3-celler ved at reducere MMP’er ekspression. Det hæmmede også ERK, JNK og PI3K /Akt signalveje samt NF-

κ

B aktivitet. Disse resultater afslører ny terapeutisk potentiale for diosgenin i anti-metastatisk terapi

Henvisning:. Chen PS, Shih YW, Huang HC, Cheng HW (2011) diosgenin, en steroide saponin, Forhindrer Migration og Invasion of Human Prostata Cancer PC-3-celler ved at reducere matrixmetalloproteinaser Expression. PLoS ONE 6 (5): e20164. doi: 10,1371 /journal.pone.0020164

Redaktør: Robert E. Midler, Yale Medical School, USA

modtaget: 1 februar, 2011; Accepteret: 14. april, 2011; Udgivet: 23. maj 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

diosgenin er et naturligt forekommende steroid saponin til stede i en. række planter, herunder bukkehorn (

Trigonella foenum graecum

) og rødder af vilde Yams (

Dioscorea villosa

) [1]. Diosgenin har været brugt i traditionel medicin som en antihypercholesterolemia, antihypertriacylglycerolemia, mod diabetes og antihyperglycemia agent [1], [2], [3], [4]. Adskillige rapporter har vist, at diosgenin inhiberer proliferation og inducerer apoptose i en lang række forskellige tumorceller af human colon [5], osteosarkom [6], leukæmi [7], erythroleukæmi [8], bryst [9], og lever [10] . Den anti-cancer virkning diosgenin er påvist gennem cellecyklusstandsning [7], [11], aktivering af p53 og caspase-3 [5], [7], [8], [12]. Desuden diosgenin inhiberer NF-KB-aktivitet og NF-KB-reguleret genekspression og efterfølgende reducere proliferation, invasion og osteoklastogenese [6], [13]. Diosgenin afskaffer også cyclooxygenase-2 [11] og lipoxygenase [14], som er impliceret i carcinogenese og som vigtige mål for kræft kemoprævention og terapi. Derfor kan diosgenin besidder canceren kemoterapeutisk potentiale og dets aktivitet involverer flere cellulære og molekylære mål.

Prostatacancer er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret tumorer hos mænd, og den anden førende årsag til dødelighed kræft i USA [ ,,,0],15]. Selvom prostatakræft på det tidlige stadium kan behandles med kirurgi og androgen-deprivation terapi, det til sidst videre til mere malign, metastase, og hormon refraktær prostatacancer (HRPC), for hvilke der ikke er nogen helbredende terapi [16], [17] . Der er således behov udvikling af innovative terapier til behandling af prostatacancer. Fordi fremskreden prostatacancer celle med stærkt invasive potentiale medfører høje sygelighed og dødelighed, kan inhibering af invasion og metastase være en god fremgangsmåde til behandling af HRPC.

cancermetastase er et meget koordineret trinvis proces, som omfatter frigørelse af celler fra den primære tumor, lokal proteolyse af den ekstracellulære matrix (ECM), penetration gennem basalmembranen kapillær og lymfekar, intravasation, og derefter invasion i nyt væv og vækst [18], [19]. Processen med metastase fremmes ved at udtrykke og udskille forskellige proteolytiske enzymer, som kan nedbryde de fleste ECM komponenter. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er), en familie af Zn-afhængige endopeptidaser, er de store proteaser deltager i tumorcellemigration, spredning, vævsinvasion og metastase [20]. Blandt de MMP’er, MMP-2 og MMP-9 er vigtige enzymer til nedbrydning af type IV-kollagen og bidrage til processen med metastase [21], [22]. MMP-2 og MMP-9 er også i stand til at spalte type I collagen [23], [24], hovedkomponenten danner en gitterstruktur i stroma [25]. Aktiveringen af ​​disse enzymer er blevet forbundet med stigende tumormetastase, hvilket tyder på en central funktionelle rolle for disse proteaser i den metastatiske proces [26]. Proteolytisk nedbrydning af stromale mikromiljø spiller en afgørende rolle i at fremme invasion. At erhverve detaljerede oplysninger om cancercelleinvasion på stroma, er type I collagen anvendes i Boyden kammer invasion assay i den foreliggende undersøgelse.

Desuden kan proteolytisk nedbrydning af ECM i tumormetastase reguleres af andre proteiner, såsom som ekstracellulær inducer af matrixmetalloproteinase (EMMPRIN) og væv inhibitor af metalloproteinaser (TIMP’er). EMMPRIN er et multifunktionelt glycoprotein, der kan ændre tumor mikromiljø ved at aktivere proteinaser, overtalelse angiogene faktorer i tumor og stromale celler. EMMPRIN er i stand til at regulere MMP og være involveret i invasionen og metastase processer prostata kræftceller [27]. Aktiviteterne i de fleste MMP’er er reguleret af TIMP’er. Balancen mellem MMP og TIMP-niveauer er en vigtig determinant for den proteolytiske netto aktivitet [28].

mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway har været kendt til at deltage i talrige signaleringskaskader, der spiller vigtige regulatoriske roller i cellevækst, apoptose, differentiering og metastase [29]. De forskellige MAPK medlemmer aktiveres som reaktion på forskellige ekstracellulære stimuli og har forskellige downstream mål og derved stimulere celle migration, proteinase-induktion, og angiogenese, begivenheder, der er afgørende for metastaser [30]. Ekstracellulær signal regulering kinase (ERK1 /2) og c-Jun N-terminal kinase (JNK), to store pattedyr MAP-kinaser, er blevet impliceret i celle migration og proteinase-induktion, begivenheder, der er væsentlige for metastase [30]. ERK1 /2 og JNK spiller en central rolle i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​MMP’er [20]. Inhibering af MAPK-vejen kan have potentiale til at forhindre angiogenese, proliferation, invasion og metastase til en bred vifte af tumorer [31], [32], [33]. Metastase er også reguleret af PI3K /Akt signalvejen, som er involveret i mange cellulære processer, herunder celle overlevelse, celleadhæsion og metastase [34], [35]. Inhibering af MAPK og PI3K /Akt pathways kan have potentiale til at forebygge kræft celleproliferation, invasion og metastase [31], [33]. Desuden PI3K /Akt og MAPK signalveje spiller en central rolle i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​MMP’er ved transskriptionelle faktorer, herunder NF-KB [34], [36], [37]. NF-KB er holdt i en inaktiv form i cytoplasmaet af inhibitoriske proteiner kaldet inhibitorer af KB (IKB). Som reaktion på et aktiveringssignal, er NF-KB frigivet fra kBa og translokerer fra cytoplasmaet til kernen, hvor det binder til beslægtede sekvenser i promotorområdet af et antal målgener og efterfølgende letter celleproliferation, angiogenese, og metastase. Blokering PI3K /Akt og MAPK pathways samt NF-KB give potentielle mål for tumor terapeutiske strategier.

Selvom diosgenin er impliceret som et nyt multitarget-baserede kemoforebyggende middel mod flere cancerceller, rolle diosgenin mod tumor metastasering og angiogenese er stadig uklart. Formålet med dette arbejde er at undersøge de hæmmende effekter og molekylære mekanismer i diosgenin på metastaser. Da human prostatacancer PC-3-celler udviser særdeles invasiv og metastatisk aktivitet og har været anvendt til undersøgelse af biokemiske forandringer i avancerede prostatacancerceller og det evalueres deres reaktion på kemoterapeutiske midler [38], blev PC-3-celle anvendes til de foreliggende forsøg .

Materialer og metoder

Reagenser og Cell Culture

diosgenin, dimethylsulfoxid (DMSO), Tris-HCI, EDTA, SDS, phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Nonidet P -40, deoxycholsyre og natriumorthovanadat, blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Proteinassaykit blev opnået fra Bio-Rad Labs (Hercules, CA). Pulveriseret Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) blev indkøbt fra Gibco /BRL (Gaithersburg, MD). Total RNA-ekstraktion kit og PCR-kittet var fra Viogene (Sunnyvale, CA). Antistoffer mod ERK, JNK, Akt, NF-KB (p65), C23 og phosphorylerede proteiner blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer mod PI3K og phosphoryleret PI3K blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Human prostatacancer-cellelinier PC-3 og blev opnået fra BCRC (Food Industry Research and Development Institute, Taiwan). Celler blev holdt i DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og inkuberet i en CO 5%

2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Human navlevene endotelcelle (HUVEC), venligst stillet til rådighed fra Dr. Hua-Lin Wu [39], blev isoleret fra humane navlestrengen vener som tidligere beskrevet [39], og dyrket på 0,1% gelatine-overtrukne skåle og holdt i M199-medium suppleret med 16% FBS, endotelcellevækst supplement og heparinsulfat (Upstate Biotechnology). HUVEC’er mellem passager 2 og 6 blev anvendt i alle eksperimenter. For diosgenin behandling blev diosgenin opløst i ethanol og fortyndet med dyrkningsmedium (slutkoncentrationen af ​​ethanol var under 0,2%).

Cell Levedygtighed Assay

Analysen blev udført som tidligere beskrevet [ ,,,0],40]. Kort beskrevet blev celler podet i en 96-brønds plade og behandlet med diosgenin i tre eksemplarer. Efter 24 og 48 timers inkubation blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende 0,5 mg /ml MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid]. Efter 4 timer blev supernatanterne fjernet, og den resulterende MTT formazan blev solubiliseret i DMSO og måles spektrofotometrisk ved 570 nm.

Sårheling Migration Assay

Analysen blev udført som tidligere beskrevet [41] . PC-3-celler blev udpladet i en plade med 12 brønde og voksede til konfluens. Den monolagskultur blev derefter skrabe-såret med en steril mikropipette tip til at oprette en blottede zone (mellemrum) med konstant bredde. Efter fjernelse af cellulære rester med PBS blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer af diosgenin efter 24 timer. PC-3 celler migreret til de sårede region blev observeret af Olympus CK-2 omvendt mikroskop og fotograferet (100 × forstørrelse). Sårområdet blev målt ved programmet billede J (https://rsb.info.nih.gov/ij/). Procentdelen af ​​sårlukning blev estimeret ved den følgende ligning: Sårlukning% = [1- (sårområde ved T

t /sårområde ved T

0) × 100%, hvor T

t er det tid efter sårede og T

0 er tiden umiddelbart efter såret.

Boyden Chamber invasion assay

Boyden kammer invasion assay blev udført som tidligere [41]. Kort fortalt polycarbonatfilter (8 um porestørrelse) blev præ-coatet med type I-kollagen (10 ug /ml). Efter behandling med diosgenin i 24 timer, celler (1 x 10

4 celler /brønd) blev tilsat til det øvre kammer i serum-frit medium. Det komplette medium (indeholdende 10% FBS) blev påført på det nedre kammer som kemoattraktant. Kammeret blev inkuberet i 6 timer ved 37 ° C. Ved slutningen af ​​inkubationen blev cellerne i den øvre overflade af membranen forsigtigt fjernet med en vatpind og celler, der invaderede til den nedre overflade af membranen blev fikseret med methanol og farvet med 5% Giemsa opløsning. De invaderede celler på den nedre overflade af membranfilteret blev scoret fra fem tilfældige felter ved mikroskopi (200 ganges forstørrelse).

Tube Formation Bestemmelse

Dannelsen rør assay blev udført som beskrevet. Kort fortalt blev en 15-brønd μ-Slides (ibidi, Tyskland) overtrukket med 10 pi Matrigel der fik lov at størkne ved 37 ° C. For at evaluere effekten af ​​diosgenin, blev PC-3-celler behandlet med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer og det konditionerede medium blev opsamlet og udsat for dannelse rør assay. HUVEC blev podet på Matrigel og dyrket i konditioneret medium af PC-3 celler i 6 timer. De vedlagte net af komplette rør blev talt og fotograferet under et inverteret mikroskop. De rørformede længder af cellerne blev målt ved anvendelse af programmet Billede J.

RNA-ekstraktion og revers transkription-PCR og kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev ekstraktion anvendelse af total RNA-ekstraktion kit ifølge den producentens anvisninger. Totalt RNA (1 ug) fra hver prøve blev underkastet revers transkription med oligo (dT) primere ved PCR kit ifølge producentens anvisninger. Det syntetiserede cDNA blev anvendt til PCR-amplifikation med de følgende primere [41]: MMP-9, 5′-gcacgacgtcttccagtacc-3 ‘(For), 5′-tcaactcactccgggaactc-3′ (Rev); MMP-2, 5’-ggactatgaccgggataagaaatatg-3 ‘(For), 5′-gggcaccttctgaatttcca-3′ (Rev); β-actin: 5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ‘(For), 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’ (Rev). cDNA’er blev amplificeret i 35 cykler og hver PCR-reaktion tilstand var som følger: forberedelse ved 94 ° C i 5 minutter, denaturering ved 94 ° C i 30 sek, annealing trin ved 56 ° C i 30 sekunder og polymerisering ved 72 ° C i 30 sek. PCR-produkter blev analyseret ved agarosegelelektroforese. MRNA udtryk for MMP-2, -9, -7, EMMPRIN og TIMP-1, -2 blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR som udføres i StepOne systemet (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Kort fortalt, hver amplifikation blanding (50 pi) indeholder 10 ng cDNA og 25 pi SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). PCR-betingelser var som følger: 95 ° C i 2 min, 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 45 s. Primersekvenserne for β-actin, MMP-2, MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1, TIMP-2 og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) blev udledt fra PrimerBank og anført i tabel 1. PCR-resultater var udledt ved hjælp af sammenlignende

metode C T.

Analyse af MMP-2 og MMP-9 aktiviteter ved gelatinezymografi

aktiviteter MMP-2 og MMP-9 blev analyseret ved gelatinezymografi som tidligere beskrevet [41]. Kort fortalt blev subkonfluente PC-3-celler inkuberet med serum-frit medium med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer. Det konditionerede medium blev derefter høstet og koncentreret ved ultrafiltrering centrifugering. Prøven (20 ug) blev blandet med ladningsbuffer og underkastet 10% SDS-polyacrylamid-gel indeholdende 0,1% gelatine. Elektroforese blev udført ved 100 V i 3 timer ved 4 ° C. Geler blev derefter vasket med vaskebuffer (2,5% Triton X-100 dd H

2O) ved stuetemperatur for at fjerne SDS, efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i reaktionsbuffer (40 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM CaCl

2, 0,02% NaN

3). Efter 16 timer blev gelerne farvet med Comassie blue R-250 (0,125% Comassie blue R-250, 50% methanol, 10% eddikesyre) i 1 time og affarvet med Affarvningsopløsningen (20% methanol, 10% eddikesyre, 70% ddH

2O), indtil de klare bånd blev visualiseret.

Nuclear Protein Extraction

nukleare proteiner blev fremstillet som tidligere beskrevet [41]. Kort fortalt blev cellerne vasket med iskold PBS, centrifugeret og resuspenderet i hypotonisk puffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl

2, 10 mM KCI, 0,05% NP-40, 0,5 mM DTT og 0,5 mM PMSF). Kernerne blev centrifugeret i 10 min ved 3000 rpm ved 4 ° C. Pelleten blev derefter resuspenderet i kerneekstrakt buffer (20 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl

2, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF og 25% glycerol) og inkuberes i 30 minutter på is. Efter endnu centrifugering ved 14.000 rpm i 10 min blev supernatanten indeholdende det nucleære protein overført til en forafkølet mikrocentrifuge rør. Ekstrakterne blev opbevaret ved -80 ° C.

Western Blot

Efter at være blevet behandlet med diosgenin, PC-3-celler blev vasket to gange med PBS og behandlet med ekstraktionsbuffer (50 mM Tris-CI , pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40 og 0,5% deoxycholsyre). Celle- ekstraktioner blev opsamlet og centrifugeret ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev opsamlet som cellelysater. Cellelysaterne blev underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, Bedford, MA). Membranerne blev blokeret med 5% (w /v) fedtfri mælk i PBS indeholdende 0,1% Tween-20, og derefter blottet med primært antistof. Efterfølgende blev membranerne inkuberet med et passende sekundært antistof (peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-muse eller anti-kanin IgG). De immuno-opdaget proteiner blev derefter afsløret ved forøget kemiluminescens.

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistisk signifikans blev analyseret ved envejs ANOVA. Hvis der blev observeret betydning blev Dunnetts post-hoc test, der anvendes til at bestemme forskellen mellem behandlingsgrupper og ubehandlede gruppe, med værdier på

p

. 0,05 betragtet som statistisk signifikant

Resultater

cytotoksiske virkning af diosgenin i PC-3-celler

Vi først belyst den cytotoksiske virkning af diosgenin på prostatacancerceller PC-3 (fig. 1). Vi viste, at behandlet af diosgenin ved koncentration under 20 uM i 24 eller 48 timer påvirkede ikke levedygtighed PC-3 cell betydeligt. Levedygtighed PC-3 cell blev signifikant reduceret med diosgenin ved 30 uM. Data indikerer, at behandling med diosgenin ved doser på ikke mere end 20 uM i 24 og 48 timer forårsagede ikke cytotoksicitet PC-3-celler.

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer og 48 timer . Cellernes levedygtighed præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse af fire uafhængige forsøg.

*** p

. 0,001 sammenlignet med den ubehandlede kontrol

diosgenin Forhindrer Migration i PC-3 Celler

Fordi en højere koncentration af diosgenin var giftige undersøger vi den hæmmende virkning af diosgenin om migration og invasion af PC-3 celler ved hjælp af ikke-toksiske doser. Efter inkubation med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer, diosgenin undertrykt migration af PC-3-celler til det blottede område på en dosis-afhængig måde (Fig. 2, A og B). Disse resultater viste, at diosgenin inhiberede motiliteten af ​​PC-3-celler betydeligt. Salg

cellemonolag skrabet af en steril mikropipette spids og cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer. (A) Celler migreret til de sårede region blev fotograferet (100 × forstørrelse). (B) Sårområdet af cellekulturer blev kvantificeret i fire felter i hver behandling, og data blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Data er præsenteret som som middelværdi ± S.D. af tre uafhængige forsøg.

* p

0,05,

** p

. 0,01, sammenlignet med den ubehandlede kontrol

diosgenin Forhindrer Invasion i PC-3 celler

for at belyse den inhiberende virkning af diosgenin på invasionen af ​​PC-3-celler i hele den ekstracellulære matrix, blev de celler, der invaderede gennem type i-collagen-coatede polycarbonat filter i Boyden kammer analyseret. Resultaterne viste, at diosgenin undertrykt invasion af PC-3-celler over type I-collagen-coatede filter på en dosis-afhængig måde. Behandling med diosgenin på 10 og 20 uM hæmmede 22% og 40% af celle invasion henholdsvis (fig. 3, A og B). Resultaterne indikerede, at diosgenin markant inhiberede invasion af PC-3-celler.

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer og celleinvasion assay blev udført. (A) De invaderede celler blev fotograferet (200 × forstørrelse). (B) De invaderede PC-3-celler blev talt i fem tilfældige felter i hver behandling, og data blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. af tre uafhængige forsøg.

* p

0,05,

** p

. 0,01, sammenlignet med den ubehandlede kontrol

diosgenin Forhindrer aktivering og ekspression af MMP-2 og MMP-9 i PC-3-celler

Da aktiveringen af ​​MMP’er er afgørende for ECM-nedbrydning, som er nødvendig for celleinvasion, virkningen af ​​diosgenin på aktiveringen af ​​MMP’er blev undersøgt. Efter PC-3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer i serum-frit medium, blev det konditionerede medium opsamlet, koncentreret og analyseret for MMP-aktivitet ved gelatinezymografi. Resultaterne viste, at MMP-9 og MMP-2-aktiviteterne markant reduceret med 20 uM af diosgenin (fig. 4A). Vi påviste yderligere, at diosgenin undertrykt ekspression af MMP-9 og MMP-2-mRNA og protein bestemt ved RT-PCR og Western blotting, (fig. 4, B og C). Resultaterne indikerede, at begge enzymaktiviteter og udtryk af MMP-9 og MMP-2 blev inhiberet af diosgenin.

(A) PC-3-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af diosgenin i 24 timer og aktiviteterne af MMP -9 og MMP-2 blev bestemt ved gelatinezymografi. Udtrykkene for MMP-9 og MMP-2-mRNA (B) og protein (C) blev analyseret ved RT-PCR og Western blotting hhv. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (D) Niveauerne af MMP-2, -9, -7, EMMPRIN og TIMP-1, -2 mRNA blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg.

* p

0,05,

** p

. 0,01, sammenlignet med den ubehandlede kontrol

diosgenin inhiberer mRNA ekspression af MMP-2, MMP -9, MMP-7 og ekstracellulær inducer af matrixmetalloproteinase (EMMPRIN) mens inducerer TIMP-2 Expression

for at belyse virkningen af ​​diosgenin på ekspression af gener involveret i ECM-nedbrydning, mRNA niveauer af MMP-2 , MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1 og TIMP-2 blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR. Resultaterne viste, at diosgenin inhiberede mRNA-ekspression af MMP-2, MMP-9, MMP-7 og EMMPRIN på en dosis-afhængig måde. Diosgenin forhøjet også ekspressionen af ​​TIMP-2, som er kendt for at blokere den proteolytiske potentiale MMP’er (fig. 4D). Resultaterne antydede, at diosgenin kan påvirke ekspressionen af ​​gener involveret i proteolytisk aktivering.

diosgenin inhiberede PC-3 cell induceret human navlevene endotelcelle (HUVEC) kanaldannelse

Tube formation endotelcelle er en af ​​de afgørende skridt på angiogenese associeret med cancer progression og metastase. For at undersøge den inhiberende virkning af diosgenin på PC-3 cell induceret angiogenese, udførte vi in ​​vitro-dannelse af HUVEC ved konditioneret medium af PC-3-celler. HUVEC dyrket på Matrigel blev behandlet med de konditionerede medier fra PC-3-celler behandlet med diosgenin i 24 timer, og dannelse rør blev evalueret. Resultaterne viste konditioneret medium af PC-3-celler induceret rør dannelsen af ​​HUVEC, og konditionerede medier fra celler udsat for diosgenin undertrykt rør dannelsen af ​​HUVEC på en dosis-afhængig måde (Fig. 5, A og B). Resultaterne antydede, at diosgenin kan undertrykke PC-3 cell induceret angiogenese in vitro. Fordi PC-3-celler inducerer angiogenese gennem udtrykke angiogene faktorer, såsom VEGF, vi evaluere, om diosgenin inhiberer ekspression af VEGF i PC-3-celler. Resultaterne viste, at mRNA-ekspression af VEGF i PC-3-celler markant reduceret med diosgenin på en dosis-afhængig måde (Fig. 5C). Vore data antydede, at diosgenin inhiberer PC-3 cell induceret angiogenese ved at undertrykke VEGF-ekspression.

(A) HUVEC’er podedes på Matrigel og inkuberet med konditioneret medium fra PC-3-celler behandlet med diosgenin i 24 timer. Efter 6 timer blev de vedlagte net af komplette rør fotograferet (100 ganges forstørrelse). (B) De rørformede længder af cellerne blev målt ved anvendelse Billede J software. (C) mRNA ekspression af VEGF blev bestemt og præsenteret som gennemsnit ± S.D. af tre uafhængige forsøg.

* p

0,05,

** p

. 0,01, sammenlignet med den ubehandlede kontrol

diosgenin Hæmmer fosforylering af PI3K, Akt, ERK og JNK

Flere undersøgelser har indikeret, at de signalproteiner herunder PI3K, Akt og MAPK medlemmer er involveret i ekspression af MMP og fremkalde metastaser [30], [34], [35]. Virkningerne af diosgenin på phosphorylerede status PI3K, Akt, ERK1 /2, JNK1 /2 og p38 i PC-3-celler blev undersøgt. Data viste, at diosgenin reducerede phosphorylering af PI3K og Akt på en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 6, A og B). Desuden diosgenin undertrykt phosphoryleringen af ​​ERK1 /2 og JNK1 /2 på en dosis- og tidsafhængig måde, mens den ikke ændrede phosphorylering af p38 (fig. 7, A og B).

PC-3-celler blev behandlet med forskellige doser af diosgenin i 24 timer (A) eller 20 uM diosgenin for 3, 6, 12, 18 og 24 timer (B). Phosphoryleringen af ​​PI3K og Akt blev bestemt ved SDS-PAGE og Western blotting. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

PC-3-celler blev behandlet med forskellige doser af diosgenin i 24 timer (A) eller 20 uM diosgenin for 3, 6, 12, 18 og 24 timer (B). Phosphorylering af ERK1 /2, JNK1 /2 og p38 blev bestemt ved SDS-PAGE og Western blotting. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

For yderligere at undersøge, om inhiberingen af ​​celleinvasion og MMP-2/9-ekspression var gennem hæmning af ERK1 /2, JNK1 /2 og PI3K-signalering forureningsveje PC-3-celler blev behandlet med en PI3K-inhibitor (LY294002; 20 pM), ERK-inhibitor (U0126, 20 uM) og JNK-inhibitor (SP600125; 20 pM) i 24 timer. Resultaterne viste, at behandling af LY294002, U0126 og SP600125 reduceret celleinvasion og MMP-2/9 ekspression markant (fig. 8, A og B), hvilket antyder, at inhibering af celleinvasion og MMP-2/9-ekspression ved diosgenin delvist kunne forekomme gennem undertrykke PI3K, ERK og JNK pathways.

(A) Celler blev behandlet med LY294002, U0126 og SP600125 i 24 timer og cellen invasive evner blev udført af Boyden kammer invasion assay. (B) Udtrykket af MMP-2, blev -9 mRNA bestemt og udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg.

** p

0,01,

*** p

0,001, sammenlignet med den ubehandlede kontrol

diosgenin nedregulerer Nuclear indhold NF. KB i PC-3-celler

for at undersøge den inhiberende virkning af diosgenin på aktiviteten af ​​NF-KB, er mængden af ​​kBa i cytosoliske ekstrakter og NF-KB i cellen kerneekstrakter blev målt ved Western blotting. Data viste, at diosgenin-behandlede PC-3-celler viste en stigning i det cytosoliske protein niveau af kBa og et fald i den nukleare proteinniveauet af NF-KB (Fig. 9). Resultaterne impliceret, at diosgenin signifikant inhiberede NF-KB-aktivitet.

PC-3-celler blev behandlet med forskellige doser af diosgenin i 24 timer. (A) Den cytosoliske og nukleare ekstrakter blev fremstillet og analyseret for kBa nedbrydning og NF-KB p65 translokation. β-actin og C23 blev anvendt som en cytosolisk og kontrol kerneprotein loading hhv. (B) fastlagte niveauer for kBa og NF-KB blev kvantificeret ved densitometrisk analyse. De densitometriske Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± S.D. af tre uafhængige forsøg.

* p

0,05,

** p

0,01,

*** p

. 0,001, sammenlignet med den ubehandlede kontrol

diskussion

diosgenin er blevet vist at have anti-kræftfremkaldende potentialer, såsom cellevækst hæmmes og inducere apoptose af forskellige cancercellelinier [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. I den foreliggende undersøgelse, vi forudsat beviser, diosgenin var i stand til at hæmme metastaser

in vitro

, såsom migration og invasion i menneskelige prostatakræft PC-3 celler, hvilket antyder, at diosgenin kan besidde anti-metastatisk potentiale.

Vi viste, at diosgenin undertrykt proliferation af PC-3-celler betydeligt i en koncentration på 30 uM. Når PC-3-celler blev behandlet med diosgenin ved ikke-toksiske doser (under 20 pM), blev migration og invasion inhiberes. Disse resultater antydede, at de inhiberende virkninger af diosgenin på PC-3 cellemigration og invasion ikke var på grund af dets cytotoksiske virkning.

cancermetastase kræver migration af cancerceller. Under cellemigrering, pericellulære proteolyse af ECM er vigtig for celle fremspring. Den proteolytiske nedbrydning af ECM medieret af ekstracellulære proteaser, såsom MMP’er, er påkrævet for prostatacancer cellemigrering og invasion. Blandt dem, MMP-2, MMP-9 og MMP-7 spiller en kritisk rolle i prostatakræft progression. Ekspression af MMP-2 og MMP-9 er associeret med prostatacancer progression [42], [43]. Inhibering af MMP-2 og MMP-9-ekspression undertrykke metastatiske potentiale af prostatacancer [32], [44]. MMP-7 besidder proteolytisk aktivitet mod en række forskellige ECM substrater, herunder collagener, proteoglycaner, elastin, laminin, fibronectin og casein. MMP-7 er også fremstillet af flere maligne tumorceller, herunder prostata, mave, hoved og hals, lunge, hepatocellulær, og colorektale carcinomer [45], [46]. Overekspression MMP-7 fremmer invasion af prostatacancerceller [47]. Desuden EMMPRIN er i stand til at regulere MMP og være involveret i invasionen og metastase processer prostata kræftceller [27]. Inhibering af EMMPRIN ekspression reducerer tumorcelleinvasion i human prostatacancer celle [48]. TIMP’er, regulator af MMP’er, er også involveret i tumor progression, invasion, metastase og angiogenese [49], [50]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at diosgenin inhiberede migration og invasion af PC-3-celler. Behandling med diosgenin på 10 og 20 pM i 24 timer formindsket aktiviteter og ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 betydeligt. Diosgenin inhiberede også mRNA-ekspression af MMP-7 og EMMPRIN i PC-3-celler. Desuden blev ekspressionen af ​​TIMP-2 steget med diosgenin.