PLoS ONE: Identifikation af genekspression Forskelle mellem lymfangiogene og Non-lymfangiogene ikke-småcellet lungekræft cellelinier

Abstrakte

Det er velkendt, at lungetumorer inducere dannelsen af ​​lymfekar. Men de molekylære mekanismer, der styrer tumor lymfangiogenese i lungekræft ikke fuldt ud blevet afgrænset. I den foreliggende undersøgelse, vi identificerer et panel af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier, inducerer lymfangiogenese og bruge hele genomet mRNA-ekspression til at karakterisere de molekylære mekanismer, der regulerer tumor lymfangiogenese. Vi viser, at Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, og H2122 NSCLC cellelinjer danne tumorer, der inducerer lymfangiogenese hvorimod Calu-3, H1155, H1975, og H2073 NSCLC cellelinjer danne tumorer, der ikke fremkalder lymfangiogenese. Ved at analysere genom-dækkende mRNA-ekspression data, vi identificerer en 17-genekspression signatur, der adskiller lymfangiogene fra ikke-lymfangiogene NSCLC cellelinier. Vigtigere, VEGF-C er den eneste lymfatiske vækstfaktor i dette udtryk signatur og er ca. 50 gange højere i lymfangiogene gruppen end i den ikke-lymfangiogene gruppe. Vi viser, at tvungen ekspression af VEGF-C ved H1975 celler inducerer lymfangiogenese og at knockdown af VEGF-C i H1993-celler inhiberer lymfangiogenese. Derudover viser vi, at den tredobbelte angiokinase inhibitor, nintedanib (lille molekyle, som blokerer al FGFR’er, PDGFRs, og VEGFRs), undertrykker tumor lymfangiogenese i H1993-tumorer. Sammen antyder disse data, at VEGF-C er den dominerende drivkraft for tumor lymfangiogenese i NSCLC og afslører en specifik behandling, der potentielt kan blokere tumor lymfangiogenese i NSCLC patienter

Henvisning:. Regan E, Sibley RC, Cenik BK, Silva A, Girard L, Minna JD, et al. (2016) Identifikation af genekspression Forskelle mellem lymfangiogene og Non-lymfangiogene ikke-småcellet lungekræft cellelinier. PLoS ONE 11 (3): e0150963. doi: 10,1371 /journal.pone.0150963

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, UNITED STATES

Modtaget: November 15, 2015; Accepteret: 21 februar 2016; Udgivet: 7 marts 2016

Copyright: © 2016 Regan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

datatilgængelighed:. Microarray resultater for NSCLC cellelinier anvendt i dette studie tidligere blevet offentliggjort og arkiveret i Gene Expression Omnibus repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; GEO accessionsnummer: GSE32036).

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af nystartede midler fra Institut for Kirurgi på UT Southwestern Medical center til MTD og ved en karriereudvikling pris fra NCI SPORE P50CA70907 til MTD. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt mænd og kvinder i USA [1] Stater. Lungekræftpatienter typisk dør af effekten af ​​metastaser på fjerntliggende organer. Lung kræftceller normalt vises i regionale lymfeknuder, før de observeres i fjerntliggende organer. Af denne grund er lymfeknuder menes at fungere som “kanariefugle i en kulmine” og evalueres for at afgøre, om kræftcellerne har spredt sig fra deres primære site [2]. Tilstedeværelsen af ​​cancerceller i lymfeknuder er associeret med en dårlig prognose og er en af ​​de vigtigste prædiktorer for patientresultatet for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og andre carcinomer [2, 3]. Denne klinisk observation næring intens forskningsindsats for at identificere processer, der styrer lymphogenous spredning af kræft, og i 2001 blev det rapporteret, at lymfangiogenese, som er spiring af nye lymfekar fra allerede eksisterende fartøjer, letter metastaser til lymfeknuder [4- 6]. Denne skelsættende fund antændt stor interesse afgrænse de molekylære mekanismer, der styrer tumor lymfangiogenese.

I løbet af de seneste 15 år er der sket betydelige fremskridt inden for tumor lymfangiogenese forskning. Vækstfaktorer, såsom Adrenomedullin, angiopoietin-1, angiopoietin-2, HGF, netrin-4, PDGF-BB, VEGF-A, VEGF-C og VEGF-D er alle blevet rapporteret at fremme tumor lymfangiogenese [4-12]. Trods disse fremskridt de præcise mekanismer, der styrer tumor lymfangiogenese forblive ufuldstændigt forstået. Dette er til dels fordi mange undersøgelser af tumor lymfangiogenese anvende cellelinier, er blevet gensplejset til at overudtrykke en lymfatisk vækstfaktor [4-12]. Selv om evalueringen af ​​genetisk modificerede cellelinier har givet værdifuld information om den rolle lymfekar tjene i tumorer, har de ikke belyse de præcise mekanismer, hvormed cancerceller inducerer dannelsen af ​​lymfekar. En bedre forståelse af de molekylære mekanismer, der styrer tumor lymfangiogenese er nødvendig for at udvikle behandlinger, der potentielt kan forhindre udbredelsen af ​​kræft og forbedre det kliniske resultat af patienter med tidlig stadie sygdommen. Derfor satte vi os for at identificere et panel af cellelinjer, der inducerer lymphangiogenese og bruge genom-dækkende mRNA udtryk data til at identificere de molekylære mekanismer, der styrer tumor lymfangiogenese i NSCLC.

Resultater

Identifikation af lymfangiogene og ikke-lymfangiogene NSCLC cellelinier

at identificere NSCLC cellelinier, der inducerer lymfangiogenese farvede vi et panel af 13 NSCLC tumor xenograft prøver fra tidligere dyreforsøg med antistoffer mod Lyve-1 og podoplanin (figur 1). Disse er to almindeligt vurderede markører af lymfatiske endotelceller. Et antistof mod glatmuskelactin (SMA) blev inkluderet i podoplanin pletten for at hjælpe med at skelne podoplanin-positive lymfekar (podoplanin +; SMA-) fra podoplanin-positive fibroblaster (podoplanin +; SMA +). Omfanget af lymfangiogenese blev kvantificeret ved at tælle antallet af intratumorale lymfekar pr mikroskopisk felt og tumorer blev klassificeret som værende lymfangiogene hvis de indeholdt mere end 5 lymfekar pr mikroskopisk felt eller ikke-lymfangiogene hvis de helt manglede intratumorale lymfekar. Gennem denne analyse, var vi i stand til at identificere et panel af lymfangiogene (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, og H2122) og ikke-lymfangiogene NSCLC cellelinier (Calu-3, H1155, H1975, og H2073) (figur 1) .

(A) Repræsentative billeder af lunge tumorxenotransplantater farvet med et antistof mod Lyve-1 (rød) (B) Repræsentative billeder af lunge tumorxenotransplantater farvet med antistoffer mod podoplanin (grøn) og glatmuskelactin (SMA , rød). (C) Graf viser intratumoral lymfekar tæthed for podoplanin og Lyve-1-positive lymfekar i NSCLC xenografter dyrket i mus. Vi klassificerede Calu-1, HCC827, HCC461, H1993 og H2122-celler som værende lymfangiogene og Calu-3, H1155, H1975 og H2073 som værende ikke-lymfangiogene. Graf viser middel ± SEM.

VEGF-C regulerer lymfangiogenese af NSCLC celler

Efter identifikation lymfangiogene og ikke-lymfangiogene NSCLC cellelinjer, vi satte sig for at finde forskellene mellem disse to grupper . Vi fandt, at der ikke var nogen indlysende forskel i vækstraten for lymfangiogene og ikke-lymfangiogene subkutane xenotransplantater (fig 2). Vi fandt også, at evnen hos en cellelinie for at inducere lymfangiogenese ikke var relateret til dets subtype klassificering (adenocarcinom, pladecellecarcinom, eller storcellet), oprindelsesstedet (primær tumor versus metastase), eller mutation status (tabel 1 og 2 ).

(A) graf, der viser væksten af ​​lymfangiogene (Calu-1, HCC827, HCC461, H1993, og H2122) tumorer. (B) Graf, der viser væksten af ​​ikke-lymfangiogene (Calu-3, H1155, H1975 og H2073) tumorer. Grafen viser gennemsnit ± SEM. Vejviser

Vi analyserede derefter genom-dækkende mRNA udtryk data til at identificere gener udtrykkes forskelligt mellem lymfangiogene (Calu-1, H1993, HCC461, HCC827, og H2122 ) og ikke-lymfangiogene (Calu-3, H1155, H1975 og H2073) celler. Denne analyse genereret en 17-genekspression signatur, skelnes lymfangiogene fra ikke-lymfangiogene NSCLC-celler (figur 3). Vaskulær endotelvækstfaktor C (VEGF-C), en ligand af receptortyrosinkinaser VEGFR2 og VEGFR3, var den eneste gen i denne underskrift rapporteret at stimulere lymfangiogenese og var ca. 50 gange højere i lymfangiogene gruppe end den ikke-lymfangiogene gruppe . Vi bekræftede, at VEGF-C blev udtrykt på et højere niveau i lymfangiogene celler end ikke-lymfangiogene celler ved kvantitativ PCR (figur 3).

(A) Microarray resultater, der viser gener udtrykkes forskelligt mellem lymfangiogene (Calu-1, HCC827, HCC461, H1993 og H2122) og ikke-lymfangiogene (Calu-3, H1155, H1975 og H2073) celler. (B) Kvantitativ PCR-resultater viser, at VEGF-C udtrykkes på et højere niveau i lymfangiogene end i ikke-lymfangiogene NSCLC cellelinjer. VEGF-C-værdier er normaliseret til husholdning gen GAPDH. Værdier for NSCLC cellelinier er normaliseret til en udødeliggjort human bronchieepithelceller cellelinie (HBEC3KT).

For at bestemme, om VEGF-C-ekspression var tilstrækkelig til at fremkalde lymfangiogenese af NSCLC celler, vi gensplejsede H1975 celler til stabilt udtrykker enten rødt fluorescerende protein (RFP; H1975-Ctrl) eller fuld længde human VEGF-C (H1975-VEGFC). Revers-transkription-PCR-analyse viste, at H1975-VEGFC celler udtrykte et højt niveau af VEGF-C (figur 4). Derudover kvantitativ PCR-analyse viste, at niveauet af VEGF-C-mRNA er ca. 3 gange højere i H1975-VEGFC celler end H1993 celler (data ikke vist). Vi injicerede disse celler i flankerne af NOD /SCID-mus og fandt, at H1975-VEGFC tumorer voksede lidt hurtigere end H1975-Ctrl tumorer (Fig 4). Densiteten af ​​intratumorale blodkar var ikke signifikant forskellig mellem H1975-VEGFC tumorer (16,18 ± 1.998, n = 7) og H1975-Ctrl tumorer (13,75 ± 1.263, n = 7, Fig 4). Men tætheden af ​​intratumorale lymfekar var signifikant større i H1975-VEGFC tumorer (11,83 ± 3,125, n = 7) end H1975-Ctrl tumorer (0,4286 ± 0.4286 n = 7; fig 4). Disse data viser, at tvungen ekspression af VEGF-C er tilstrækkelig til at inducere lymfangiogenese af en NSCLC cellelinje.

(A) RT-PCR resultater, der viser, at H1975-VEGFC celler, men ikke H1975-Ctrl-celler, udtrykker VEGF C. (B) Tumor vækstkurver for mus injiceret subkutant med enten H1975-Ctrl eller H1975-VEGFC celler. (C, D) Repræsentative billeder af H1975-Ctrl og H1975-VEGFC tumor sektioner farvet med et anti-endomucin antistof. (E) Antallet af blodkar pr mikroskopisk felt er ikke signifikant forskellig mellem H1975-Ctrl tumorer (13,75 ± 1,263, n = 7) og H1975-VEGFC tumorer (16,18 ± 1.998, n = 7). (F, G) Repræsentative billeder af H1975-Ctrl og H1975-VEGFC tumor snit farvet med et anti-Lyve-1-antistof. (H) Der er betydeligt mere lymfekar pr mikroskopisk felt i H1975-VEGFC tumorer (11,83 ± 3,125, n = 7) end i H1975-Ctrl tumorer (0,4286 ± 0,4286 N = 7). **

P

0.01

For at bestemme, om VEGF-C-ekspression var påkrævet for NSCLC celler til at fremkalde lymfangiogenese, vi gensplejsede H1993 celler stabilt udtrykke enten grønt fluorescerende protein. (GFP; H1993-Ctrl) eller en shRNA mod VEGF-C (H1993-shVEGFC). Effektiv knockdown af VEGF-C i H1993-shVEGFC celler blev vist ved kvantitativ PCR (figur 5). Vi fandt, at der ikke var nogen forskel i vækst mellem H1993-shVEGFC og H1993-Ctrl tumorer (figur 5), og at tætheden af ​​intratumorale blodkar var ikke signifikant forskellig mellem H1993-shVEGFC tumorer (10,42 ± 1,182, n = 7) og H1993 -Ctrl tumorer (11,17 ± 0.7817, n = 6; fig 5). Men tætheden af ​​intratumorale lymfekar var signifikant lavere i H1993-shVEGFC tumorer (0,61 ± 0,400, n = 7) end H1993-Ctrl tumorer (27.61 ± 1.391, n = 6; Fig 5). Disse resultater viser, at VEGF-C er påkrævet for NSCLC-celler til at inducere tumor lymfangiogenese.

(A) qPCR resultater, der viser, at H1993-shVEGFC celler udtrykker et lavere niveau af VEGF-C end H1993-Ctrl-celler. (B) Tumor vækstkurver for mus injiceret subkutant med enten H1993-Ctrl eller H1993-shVEGFC celler. (C, D) Repræsentative billeder af H1993-Ctrl og H1993-shVEGFC tumor sektioner farvet med et anti-endomucin antistof. (E) Antallet af blodkar pr mikroskopisk felt er ikke signifikant forskellig mellem H1993-Ctrl tumorer (11,17 ± 0,7817, n = 6) og H1993-shVEGFC tumorer (10,42 ± 1,182, n = 7). (F, G) Repræsentative billeder af H1993-Ctrl og H1993-shVEGFC tumor snit farvet med et anti-Lyve-1-antistof. (H) Densiteten af ​​intratumorale lymfekar er betydeligt lavere i H1993-shVEGFC tumorer (0,61 ± 0,400, n = 7) end H1993-Ctrl tumorer (27.61 ± 1,391, n = 6). ****

P

0,0001.

Nintedanib hæmmer tumor lymfangiogenese

Dernæst søgte vi at afgøre, om hæmning af VEGF-C /VEGFR3 signalering akse med en klinisk relevante forbindelser kunne undertrykke tumor lymfangiogenese. Nintedanib er et lille molekyle-hæmmer, som blokerer alle FGFR’er (IC

50 = 37-108 nM), PDGFRs (IC

50 = 59-65 nM), og VEGFRs (IC

50 = 13-34 nM ) ved binding til ATP-bindingsstedet i kinasedomænet af receptorerne [13]. Nintedanib er tidligere blevet vist at blokere tumor angiogenese og vækst i flere musemodeller [13, 14]. Derudover har kombinationsterapi af nintedanib med docetaxel blevet rapporteret at forlænge overlevelsen af ​​fase III /IV NSCLC patienter, der tidligere er behandlet med en platinbaseret behandling [15]. For at afgøre om nintedanib kunne blokere tumor lymfangiogenese, vi analyserede tumorer fra en tidligere undersøgelse, der evaluerede effekten af ​​nintedanib på væksten af ​​H1993 tumorer [14]. Vi fandt, at tætheden af ​​intratumorale lymfekar var signifikant lavere i nintedanib behandlet H1993 tumorer (5,254 ± 2,745, n = 5), end vehikelbehandlede H1993 tumorer (22,19 ± 2,536, n = 6; Fig 6). Disse data viser, at nintedanib er effektiv til at hæmme tumor lymfangiogenese.

(A, B) Repræsentative billeder af Lyve-1-farvede sektioner af H1993 tumorer fra køretøj og nintedanib behandlede mus. (C) Massefylden af ​​lymfekar i H1993 xenotransplantater er betydeligt lavere i nintedanib behandlede mus (5,254 ± 2,745, n = 5) end i vehikelbehandlede mus (22,19 ± 2,536, n = 6). **

P

0.01.

kopiantals variation VEGF-C påvirker VEGF-C-ekspression

Kræftceller ofte undergå genomiske forandringer, der resulterer i forstærkning og sletning af gener. Disse genomiske ændringer kan påvirke ekspressionen af ​​gener. For at afgøre, om

VEGF-C

gen forstærkes eller slettes i lungekræft celler, analyserede vi SNP-array data for 59 lunge cancer cellelinjer. Dette viste, at

VEGF-C

genet blev opformeret i 22% (13/59; interval mellem 3-5 eksemplarer af

VEGFC

), til stede som 2 eksemplarer i 54% (32 /59), og slettes i 24% (14/59) af lungekræft cellelinier, som vi analyserede (Fig 7). For at bestemme, om ændringer i antallet af kopier af

VEGF-C

gen påvirket udtryk for

VEGF-C

, vi evaluerede log forvandlet microarray værdier for

VEGF-C

i dette panel af 59 lunge cancer cellelinjer. Dette viste, at niveauet af

VEGF-C

var signifikant lavere i celler, der havde deletion (3,582 ± 0,3033) i

VEGF-C

gen sammenlignet med celler, der havde enten 2 kopier (7,029 ± 0,5023) eller forstærkning (8,742 ± 0,6856) i

VEGF-C

gen (figur 7). Disse data viser, at

VEGF-C

kopiantals variation kan påvirke ekspressionsniveauet af

VEGF-C

.

(A) Billed viser

VEGFC

kopiantal variation for forskellige lungecancer-cellelinjer. Rækker viser data for individuelle lunge cancer cellelinjer. Kolonner markerer forskellige positioner langs

VEGFC

gen. Forstærkede positioner er farvet rød, diploide positioner er farvet sort, og slettede regioner er farvet grøn eller hvid. (B) Graf viser log forvandlet

VEGF-C

mRNA niveauer fra microarray data for cellelinjer, der har mere end 2 kopier (interval er mellem 3-5 eksemplarer af

VEGFC

), 2 eksemplarer eller mindre end 2 kopier af

VEGFC

gen. Grafen viser middel ± SEM. ****

P

0,0001

Diskussion

Undersøgelsen af ​​molekylært annoterede lungekræft cellelinier har øget vores forståelse af de veje kørsel tumorigenese og har ført til identifikation af nye biomarkører og terapeutiske mål for lungekræft . I den foreliggende undersøgelse, bruger vi et panel af molekylært annoterede NSCLC cellelinier til at undersøge de molekylære mekanismer, der styrer tumor lymfangiogenese. Vi viser, at VEGF-C-ekspression regulerer tumor lymfangiogenese af NSCLC celler, og at hæmning af VEGF-C-induceret signalering med nintedandinb kan blokere tumor lymfangiogenese af NSCLC celler.

VEGF-C har vist sig som en central figur i den inden for lymfangiogenese forskning. VEGF-C har vist sig at være tilstrækkelig til at inducere tumor lymfangiogenese ved melanom [16, 17], brystcancer [4, 12, 18], fibrosarkom [17], og gastriske carcinomaceller [19]. Derudover inhibering af VEGF-C er blevet rapporteret at undertrykke lymfangiogenese af prostata [20, 21], pancreas [22], bryst [23-25], gastriske [26], og lungekræft celler [27]. VEGF-C-ekspression er også blevet rapporteret at korrelere med lymfekar tæthed i mange forskellige humane tumorer, herunder NSCLC [28-31]. Vi viser, at VEGF-C-ekspression skelner NSCLC cellelinjer, der inducerer lymfangiogenese fra NSCLC cellelinier, der ikke fremkalder lymfangiogenese. Derudover viser vi ved overekspression og Knockdown eksperimenter, VEGF-C regulerer tumor lymfangiogenese af NSCLC celler. Disse resultater viser endvidere betydningen af ​​VEGF-C i fremme tumor lymfangiogenese og foreslå, at det er den dominerende drivkraft for tumor lymfangiogenese i NSCLC.

Nintedanib er et lille molekyle-tyrosinkinaseinhibitoren som blokerer al FGF, PGDF, og VEGF-receptorer. Nintedanib blev tidligere vist at vise anti-cancer effekter i en række prækliniske modeller af NSCLC og i NSCLC-patienter [14, 15]. Vi viser, at nintedanib kan blokere tumor lymfangiogenese i en musemodel af NSCLC. Selvom vi vise, at nintedanib har anti-lymfangiogene aktivitet, var dette Forbindelse tidligere rapporteret at ikke hæmme tumor lymfangiogenese i en transgen musemodel af pancreas neuroendokrin tumor (PNET), som blev gensplejset til at overudtrykke VEGF-C [32]. Manglen på en anti-lymfangiogene effekt ved nintedanib i

Rip1-TAG2; Rip1-Vegfc

transgene mus kan skyldes et omfattende netværk af uregelmæssige lymfekar kunne have været til stede i bugspytkirtlen før starten af ​​behandlingen. Det er blevet rapporteret, at nyligt dannede lymfekar kan vare ved i lang tid efter tilbagetrækningen af ​​VEGF-C eller over for anti-lymfangiogene terapi [33]. Derfor eventuelle lymfekar, der dannes i

Rip1-tag2; Rip1-Vegfc

transgene mus før starten af ​​behandlingen potentielt kunne være resistente over for de anti-lymfangiogene effekter af nintedanib. Alternativt kunne forskellen mellem vores resultater og de Bill et al., (2015) være fordi vi undersøgt forskellige tumortyper eller fordi vi brugte en umanipulerede cellelinje og de brugte en gensplejset model at overudtrykke VEGF-C.

De molekylære mekanismer, der styrer

VEGF-C

mRNA-niveauer er ikke godt forstået. Vi viser, at ændringer i antallet af kopier af

VEGF-C

gen påvirker ekspressionen af ​​

VEGF-C

. Vi fandt at lungekræft cellelinier, der har mistet en af ​​deres kopier af

VEGF-C

gen tendens til at udtrykke et lavt niveau af

VEGF-C

. Men yderligere mekanismer også sandsynligt styre ekspressionen af ​​VEGF-C ved NSCLC-celler. MAPK, mTOR, og NF-kB signalveje er alle blevet rapporteret at styre VEGF-C-ekspression med cancerceller [34-37]. Disse veje kan også spille en rolle i at kontrollere ekspressionen af ​​VEGF-C ved NSCLC-celler. Fremtidige studier med vores panel af cellelinjer vil hjælpe med at bestemme den potentielle rolle af disse og andre veje til at kontrollere ekspressionen af ​​VEGF-C ved NSCLC celler.

I konklusion, at resultaterne af denne undersøgelse viser, at VEGF-C er en kritisk regulator af tumor lymfangiogenese i NSCLC og viser, at nintedanib hæmmer tumor lymfangiogenese. Disse resultater belyse de molekylære mekanismer kørsel tumor lymphangiogenese og har potentiale til at påvirke udformningen af ​​fremtidige kliniske forsøg rettet mod at blokere udbredelsen af ​​tidlige stadium NSCLC.

Materialer og metoder

Etik Statement

de dyreforsøg, der er beskrevet i dette manuskript blev udført i overensstemmelse med et dyr protokol (APN 2013-0121) er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af UT Southwestern Medical center. Alle mus i denne undersøgelse blev erhvervet fra en on-campus leverandør. Mus blev holdt i ventilerede microisolater bure i et patogen-fri facilitet og blev fodret med en standard bestrålet diæt ad libitum. Mus blev forudsat nestlets og igloer som berigelse poster. Musene blev overvåget for tegn på lidelse, såsom sløvhed og ændringer i pels udseende. Hvis mus dukkede alvorligt syge eller døende, ville de blive aflivet ved en overdosis af carbondioxid efterfulgt af cervikal dislokation. Ingen mus blev alvorligt syge eller døde før den eksperimentelle endpoint. Fremgangsmåden til eutanasi til de eksperimentelle endpoints bestod af en inhalant overdosis af carbondioxid eller isofluran efterfulgt af cervikal dislokation. Disse metoder er i overensstemmelse med anbefalingerne fra de amerikanske Veterinary Medical Association (AVMA) Retningslinjer for eutanasi.

Cellelinjer

Den menneskelige bronchieepithelceller cellelinie (HBEC3KT) og det meste af den menneskelige NSCLC celle linjer anvendt i denne undersøgelse (H1993, HCC461, HCC827, H2122, H1155, H1975, og H2073) blev etableret i laboratorier Dr. Adi Gazdar og Dr. John Minna [38-40]. De NSCLC cellelinier Calu-1 og Calu-3 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De NSCLC cellelinier blev dyrket i DMEM + 10% FBS under standardbetingelser (5% CO

2 ved 37 ° C). Den HBEC3KT cellelinjen blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium indeholdende 5 ng /ml EGF og 50 ug /ml bovin hypofyse under standardbetingelser (5% CO

2 ved 37 ° C). Alle NSCLC cellelinier blev DNA-fingeraftryk og mycoplasma-testet

Kvantitativ PCR og RT-PCR

RNA blev isoleret fra de forskellige cellelinier med en RNeasy mini kit (Qiagen, cat no.: 74.104) og cDNA blev genereret med en iScript cDNA-syntese kit (BioRad, kat nr: 170-8890). Gen-specifikke TaqMan prober blev brugt til at analysere indholdet af

VEGFC

(Applied Biosystems, Hs01099206_m1) og

GAPDH

(Applied Biosystems, Hs02758991_g1) og den komparative

C

t metode blev anvendt til at beregne relative mRNA ekspressionsniveauer. De følgende primere blev anvendt i RT-PCR-reaktioner til amplifikation

VEGF-C

(5’GTTCGTACATGGCCGTCTGT-3 ‘og 5’GGACCAAACAAGGAGCTGGA-3’) og

GAPDH

(5′ CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 ‘og 5’GTTAAAAGCAGCCCTGGTGA-3’).

Generation af stabile cellelinier

for at overekspression VEGF-C i en ikke-lymfangiogene NSCLC cellelinje, vi inficerede H1975 celler med kommercielt tilgængelige lentivirale partikler, der indeholder et plasmid, der udtrykker fuld længde human VEGF-C (Precision LentiORF VEGFC m /stopkodon; Open Biosystems, kat nr: OHS5899-202618255). For at generere kontrol celler, vi inficerede H1975 celler med lentiviral partikler, der udtrykker RFP (Precision LentiORF RFP Positiv kontrol; Open Biosystems, kat nr: OHS5833). Celler blev dyrket i medier indeholdende blasticidin (30 ug /ml) i flere uger til at selektere for stabilt transficerede celler.

Sådan stabilt knockdown VEGF-C i en lymfangiogene NSCLC cellelinie, vi inficerede H1993-celler med kommercielt tilgængeligt lentiviral partikler, der udtrykker en shRNA målrettet VEGF-C (TRCN0000425238; Sigma, kat nr: SHCLNV-NM_005429). For at generere kontrol celler, vi inficerede H1993 celler med lentiviral partikler, der udtrykker GFP (MISSION® TRC2 pLKO.5-puro-CMV-TurboGFP ™ Positiv kontrol Transduction Partikler; Sigma, kat nr: SHC203V). Cellerne blev dyrket i medier indeholdende puromycin (1 ug /ml) i flere uger til at vælge for stabilt transfekterede celler.

Dyreforsøg

NOD /SCID-mus modtog en subkutan injektion på 1 mio H1975- Ctrl, H1975-VEGFC, H1993-Ctrl, eller H1993-shVEGFC celler. Mus blev vejet og tumorer blev målt to gange om ugen. Tumorvolumener blev beregnet med formlen

V = (a

2

xb) /2

, med

en

b

repræsenterer de små og store tumordiametre hhv. Mus blev aflivet før deres tumorer nåede 1.500 mm

3 og deres væv blev indsamlet til histologisk analyse

Antistoffer

Følgende primære antistoffer blev anvendt til immunhistokemi eller immunfluorescensfarvning af tumorer:. Ged anti-Lyve-1 (R GEO tiltrædelse nummer: GSE32036).

differentielt udtrykte gener mellem to klasser af prøverne blev bestemt ved at beregne fold forandring og T-test

P

værdier og brug af vilkårlige cutoffs for udvælgelse (f.eks 4 gange ændring og

P

0.05.

Tak

Vi takker Rolf Brekken samt medlemmer af JMST og TIG til nyttige diskussioner og kritisk læsning af manuskriptet.