PLoS ONE: MicroRNA-493 Undertrykker tumorvækst, invasion og metastase af lungekræft ved Regulering E2F1

Abstrakt

miRNA er blevet foreslået at være vigtige regulatorer af progression og metastase i kræft. Imidlertid er en forståelse af deres roller og molekylære mekanismer nødvendig for at give dybere indsigt for bedre terapeutiske muligheder. I dette studie undersøgte vi den rolle og mekanismen for miR-493 i udviklingen og progressionen af ​​nonsmall-cellet lungekræft (NSCLC). Vore data viser, at ekspressionen af ​​MIR-493 blev markant reduceret i pulmonal carcinom. Den ektopiske ekspression af MIR-493 svækket cellevækst og invasion in vitro og in vivo. Mekanisk, MIR-493 almindeligvis direkte målrettet E2F1, hvilket resulterede i en robust reduktion af ekspressionen af ​​mRNA og protein. Denne virkning igen faldt væksten, invasion og metastase af lungecancerceller. Vores resultater fremhæve betydningen af ​​miR-493 dysfunktion i at fremme tumor progression, og implicere miR-493 som en potentiel terapeutisk mål i lungekræft

Henvisning:. Gu Y, Cheng Y, Song Y, Zhang Z, Deng M, Wang C, et al. (2014) MicroRNA-493 Undertrykker tumorvækst, invasion og metastase af lungekræft ved Regulering E2F1. PLoS ONE 9 (8): e102602. doi: 10,1371 /journal.pone.0102602

Redaktør: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Indien

Modtaget: Marts 28, 2014 Accepteret: 19. juni 2014, Udgivet: 8 August, 2014

Copyright: © 2014 Gu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra Kina Postdoc Science Foundation (Project Code: 2012M521588), https://jj.chinapostdoctor.org .cn /V1 /Program1 /default.aspx. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest udbredte histologiske kræft undertype verdensplan [1]. Fordi størstedelen af ​​patienter stede med invasiv, metastatisk sygdom [2], forstå grundlaget for lungekræft progression er afgørende. Mange faktorer, herunder tumor undertrykkere og onkogener, er involveret i pulmonal tumorgenese eller progression. [3], [4]. For nylig er de klassiske medlemmer af protein-kodende gener blevet udvidet til at omfatte en form for ikke-protein-kodende RNA-molekyle kendt som microRNA (miRNA) [5], [6], [7]. miRNA er 19-24 nukleotider i længden, og de regulerer genekspression via ufuldkommen baseparring med komplementære sekvenser lokaliseret hovedsageligt, men ikke udelukkende, i 3 ‘utranslaterede regioner (UTR’er) af mål-mRNA’er. Derfor miRNA repræsenterer en af ​​de vigtigste regulatoriske familier af gener i eukaryote celler, og de virker ved at inducere translationel undertrykkelse og transkript nedbrydning [8], [9]. Hurtigt spirende tyder stærkt på, at miRNA spiller afgørende roller i tumorigenese og progression [10], [11], [12]. For eksempel MIR-34 sigende forebygger kræft initiering og progression i lunge adenocarcinom [13]. miRNA-218, en ny regulator af HMGB1, angiveligt undertrykker celle migration og invasion i ikke-småcellet lungecancer [14]. Ikke desto mindre er der behov for yderligere viden om de molekylære mekanismer i miRNA til at give dybere indsigt til at udvikle bedre terapeutiske muligheder for patienter med lungekræft.

I vores seneste undersøgelse (Chen et al. Upubliceret papir), brugte vi en miRNA microarray at finde, at mIR-493-ekspression blev markant reduceret i 95D-celler, en meget metastatisk lungecancer-cellelinje sammenlignet med HBE, en immortaliseret human bronchial epitelcellelinje. Således har vi en hypotese, at miR-493 kan spille en vigtig rolle i lungekræft tumorigenese og progression.

For at teste denne hypotese undersøgte vi ekspressionen af ​​miR-493 ved hjælp af QRT-PCR i 6 lunge cancer cellelinjer og 65 lungekræft vævsprøver i nærværende undersøgelse. Dataene viste, at ekspressionen af ​​MIR-493 blev markant reduceret i lungekræft celler og væv. Funktionel in vitro og in vivo assays indikerede, at MIR-493 inhiberede lungekræft celleproliferation, invasion og metastase ved direkte målretning 3′-UTR af E2F1 at fremkalde en specifik og robust knockdown af proteinet. Vores resultater fremhæve betydningen af ​​miR-493 dysfunktion i at fremme tumor progression og tumorigenese; og implicere miR-493 som en potentiel terapeutisk mål i lungekræft.

Resultater

miR-493 nedreguleres i lungekræft og negativt forbundet med overlevelse

For at identificere dysregulering af miRNA-493 i lungekræft, undersøgte vi ekspressionen af ​​miR-493 ved hjælp af real-time PCR i 6 cellelinjer afledt af lungekræft og en lunge fibroblast linje (MRC5); samt en immortaliseret human bronchial epitelcelle (HBE). Dataene viste, at MIR-493 ekspression blev signifikant reduceret i lungecancerceller, især i 95D, en højt metastatisk lungecancer-cellelinje (figur 1A). Desuden har vi sammenlignet de miRNA-493 ekspressionsniveauerne i 65 friske lungekræft væv ved real-time PCR. Tilsvarende ekspressionen af ​​MIR-493 var signifikant lavere i lungekræft væv end i tilsvarende normale lungevæv (figur 1B). For at bestemme hvorvidt nedregulering af MIR-493 virkninger, en lungekræft fænotyper eller kliniske patologiske træk, anvendte vi en korrelationsanalyse og fandt, at MIR-493 ekspressionsniveauet omvendt var korreleret med tumormetastase (p = 0,038), men ikke andre patologiske parametre som det kliniske stadium (tabel 1). Desuden blev en Kaplan-Meier overlevelse analyse udført under anvendelse af patientens samlede overlevelse (OS, figur 1C) og sygdomsfri overlevelse (DFS; figur 1 D) til at analysere betydningen af ​​MIR-493 yderligere ud fra klinisk prognose. Resultaterne viste, at patienter med lav MIR-493-ekspression havde en kortere gennemsnitlig OS og DFS end patienter med høj MIR-493-ekspression (P = 0,006 for OS, P = 0,000 for DFS, figur 1C og D). Disse data antyder, at nedregulering af MIR-493 bidrager til lungekræft carcinogenese og prognose.

(A) De relative ekspressionsniveauer af MIR-493 i 6 cellelinjer afledt af lungekræft og en lunge fibroblast linie (MRC5 ), samt en immortaliseret human bronchial epitelcelle (HBE) blev bestemt ved QRT-PCR. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SEM fra mindst 3 separate eksperimenter * p. 0,05, ** p 0,01. (B) MIR-493 ekspressionsniveauer i 65 parrede menneskelige NSLCC og tilsvarende normale væv blev undersøgt ved real-time PCR, hjælp GAPDH som en intern kontrol. Udtrykket værdi (ACt (N) – ACt (T)) er lig med forskellen af ​​de MIR-493 niveauer mellem normalt væv og tumor. En udtrykket værdi 1 viser, at miR-493 niveauer øges i tumorer. En udtrykket værdi 1 viser, at miR-493 niveauer er faldet i tumorer. En parret t-test (univariate) blev anvendt til at sammenligne forskellen mellem den normale gruppe og cancer gruppe. (C) Lave niveauer af miR-493 korrelerer med kortere overlevelse. De OS og DFS kurver for alle undersøgte patienter med høj eller lowmiR-493 udtryk.

Overekspression af miR-493 svækker celledeling og invasion

For at vurdere de biologiske virkninger af overekspression miR-493 i lungekræft celler, stabile ektopisk overekspression celle delmængder 95D /miR-493 og H1975 /miR-493, og deres parrede kontrol celler blev bygget. En QRT-PCR-analyse viste, at transfektion var vellykkede (figur 2A). Vi fastslået, at overekspression af MIR-493 i 95D og H1975-celler markant forringede celleproliferation sammenlignet med kontrollerne ved anvendelse af en celle vækst-assay (figur 2B), cellecyklussen distribution (figur 2C) og en kolonidannelse assayet (figur 2D) . Desuden testede vi, om MIR-493 kunne spille en rolle i tumorvækst ved hjælp nøgne mus xenograftmodeller (seks mus pr gruppe). 95D celler transficeret enten med MIR-493 eller et kodet kontrol blev transplanteret ind i nøgne mus og udviklede sig til faste tumorer i 25 dage. Imidlertid blev tumorvæksten markant reduceret, når MIR-493 blev stabilt udtrykt i 95D-celler (figur 2 E). Disse resultater antydede, at miR-493 stærkt kan undertrykke tumorcellevækst.

A, stabil ektopisk overekspression af miR-493 blev genereret i celle delmængder 95D /MIR-493 og H1975 /miR-493. QRT-PCR blev anvendt til at verificere transfektion. ** Betyder P 0,001 (t-test). B, vækstkurver viste, at lungeceller var i stand til proliferation. Celler blev podet i 12-brønds plader ved de ønskede cellekoncentrationer og opretholdt i medium indeholdende 10% FBS. Absorptionsværdien af ​​celler blev målt ved de angivne tidspunkter i tre eksemplarer og deres vækstrater. * Betyder P 0,05 (t-test). C, The cellecyklus distribution af lunge kræftceller blev analyseret med en FACScan flowcytometer. Proliferationsindekset (PI) blev anvendt til at beskrive mulighederne i celleproliferation. PI = G2 + S fraktion) /(G1 + G2 + S) × 100%. Venstre, repræsentanten billede af cellecyklus procent forandring. Højre, den statistiske analyse af cellecyklus procentdel, er data præsenteret som middelværdi ± SEM af 3 uafhængige forsøg * betyder P 0,05 (t-test). D, kolonidannelse assays blev anvendt til at bestemme virkningen af ​​MIR-493 på langsigtet celleoverlevelse. Venstre, det område, på hver plade af kolonierne blev målt under anvendelse af et billedbehandlingssystem og repræsenteret som procentdelen af ​​det totale areal af pladen. Højre, virkningen af ​​MIR-493 overekspression på kolonidannelse af lungecancerceller: hver kolonne repræsenterer en gennemsnitsværdi af tredobbelte forsøg i hver gruppe. Data er gennemsnit ± SEM. * Betyder P 0,05 (t-test). E, MIR-493 inhiberede pulmonær tumorvækst i mus xenograftmodeller (12 dyr). Venstre, repræsentative tumorer isoleret fra mus 25 dage efter subkutan injektion af 95D-celler, som blev stabilt transficeret med MIR-493-udtrykkende eller kontrol vektor. Right, Data er gennemsnit ± SEM. * P. 0,05, (t-test)

Udover cellevækstinhibering, blev virkningen af ​​MIR-493 på tumorinvasion og metastase også behandlet i denne undersøgelse. En sårhelende assay viste, at MIR-493 dramatisk kunne undertrykke tumorceller mobilitet i 95D-celler sammenlignet med de tomme vektor-transficerede celler (figur 3A). Endvidere blev en invasion assay også udført. Resultatet viste, at MIR-493 kunne undertrykke den invasive evne lungecancerceller (figur 3B). En eksperimentel dyremodel blev anvendt til yderligere at undersøge den undertrykkende effekt af MIR-493 på tumormetastase, blev 95D /MIR-493 celler injiceret i halevenerne hos nøgne mus (fem mus pr gruppe). Tom vektor-transficerede (95D /kontrol) celler blev anvendt som kontroller. Musene blev aflivet, og lungerne blev udskåret, og de metastatiske læsioner i lungen blev derefter detekteret under anvendelse af et Bruker Small Animal Imaging System (Tyskland) efter 28 dage. Områderne metastatiske læsioner dannelse i lungen blev væsentligt reduceret sammenlignet med kontrolgruppen (figur 3C). Selvom synlige metastatiske knuder ikke blev observeret på overfladen af ​​lungen blev metastatiske læsioner påvist i lungen ved hæmatoxylin og eosin-farvning (figur 4D). Disse resultater indikerede, at MIR-493 effektivt kunne undertrykke tumormetastase in vitro og in vivo.

A blev scratch sår assays udført på 95D celler transficeret med MIR-493 og dets parrede kontrol. Resultaterne fra 3 separate assays blev midlet sammen og afbildet grafisk. *, P 0,05 (til venstre). Repræsentative billeder af assays er vist. Oprindelig forstørrelse: x 200 (højre). B blev de invasive egenskaber af H1975 og 95D cellerne analyseret med et Transwell assay under anvendelse af en Matrigel-coated kammer. Migrerede celler blev plottet som det gennemsnitlige antal celler pr synsfelt fra 3 forskellige eksperimenter, som beskrevet i Materialer og Metoder. * P 0,01 (venstre). Repræsentative billeder af assays er vist. Oprindelig forstørrelse: x 200 (højre). C, in vivo metastase assays blev anvendt til at undersøge lunge metastatisk evne 95D /MIR-493 celler mærket med grønt fluorescerende protein (GFP) og dets parrede kontrolcelle 95D /kontrol. Lungecancerceller blev injiceret i halevenerne på fem uge-gamle mus. På dag-28 blev alle dyr aflivet, og lungerne blev udskåret. De lunge metastase billeder blev opnået med en Bruker Mindre Husdyrs Imaging System. Lungevævet blev derefter fjernet, fikseret, paraffin-embedded, serielt i snit, og underkastes hæmatoxylin og eosin (H 0,05 versus scramble. D og E, miR-493 stabil transfektion reducerer E2F1 protein og mRNA-niveauer. F og G, Niveauet af miR-493 omvendt korreleret med E2F1 udtryk. F, The E2F1 ekspressionsniveauer blev målt ved immunohistokemi i tumorvæv. Disse paraffinindlejrede væv prøver var fra samme kilde 65fresh lungekræft væv førnævnte i figur 1. Et repræsentativt billede af ekspressionsniveauerne af E2F1 i humane lunge tumorvæv (200 ×) er vist. G, data er gennemsnit ± S.E.M. * Betyder P. 0,05

miR-493 direkte retter sig mod og hæmmer E2F1

Baseret på den iagttagelse, at miR-493 påvirker celleproliferation, invasion og metastase, søgte vi efter målgener af mIR-493 relateret til motilitet og migration ved hjælp af to target scanning algoritme (Targetscan og microRNA.org). Et stort antal forskellige målgener blev forudsagt. Blandt disse kandidat målgener blev E2F1 udvalgt til yderligere eksperimentel validering, ikke kun fordi det blev identificeret som mål for miR-493 af begge databaser (figur 4A), men også på grund af sin hyppige deregulering i tumorvæv [15], [16 ], [17]. En dual-luciferase reporter analyse viste, at co-ekspression af MIR-493 signifikant inhiberede aktiviteten af ​​ildflueluciferase som bar vildtype men ikke mutant 3′-UTR af E2F1 (figur 4B, C) i 95D og H1975-celler, hvilket indikerer, at mIR-493 kan undertrykke genekspression via dets binding sekvens ved 3′-UTR af E2F1. Endvidere indførelsen af ​​MIR-493 mindsket ekspression af cellulære E2F1 mRNA og protein (figur 4D, E). Men når inhiberende oligonukleotider mod MIR-493 blev transficeret ind lungecancerceller 95D eller H1975, en invers ekspressionsmønster blev ikke observeret mellem MIR-493 og E2F1-protein (data ikke vist). Vi formodede, at denne miRNA behandling bidrog til den minimale endogene udtryk i både lunge kræftceller. Desuden blev fænomenet yderligere valideret af en omvendt korrelation mellem niveauet af E2F1-protein, angivet ved immunhistokemi farvning, og niveauet af MIR-493-ekspression vurderet ved q-PCR i de friske lungekræft væv anvendt i de ovennævnte analyser (figur 4F , G og figur 1B).

E2F1 bidrager til virkningen af ​​at undertrykke proliferation og invasion induceret af mIR-493

Ud konstruerede vi siRNA-fragmenter rettet mod E2F1 at vælte ekspressionen af ​​E2F1 at undersøge bidraget fra E2F1 til virkningen af ​​mIR-493 på disse fænotyper. Vi fandt, at knockdown E2F1 delvis kunne simulation cellevæksten (figur 5 B) og celleinvasion (figur 5C og D) fænotype induceret af overekspression af MIR-493. Efterfølgende blev redningsforsøg udført ved overudtrykker E2F1-Δ3′- UTR vektoren (uden en endogen 3′-UTR) i celle, der udtrykker MIR-493. MIR-493 induceret nedregulering af E2F1 blev reddet på indførelsen af ​​E2F1. Endvidere overekspressionen af ​​E2F1 svækket inhibering af cellevækst (figur 5A) og invasion (figur 5C og E) forårsaget af MIR-493. Disse iagttagelser antyder, at MIR-493 specifikt mål E2F1 specificitet til at bidrage til virkningen af ​​på cellevækst og invasion.

A, The knock-down af E2F1 delvis simuleret vækst kræftceller undertrykkelse lunge induceret af overekspression af mIR-493 i 95D og H1975-celler. Kurverne vækst demonstreret evne lungeceller proliferation. Absorptionsværdien af ​​celler blev målt ved de angivne tidspunkter i tre eksemplarer og deres vækstrater. B, Overekspression af exogen E2F1 (uden 3′-UTR af E2F1) reddet ved spredning suppression induceret af MIR-493 i 95D og H1975-celler. C, T De invasive egenskaber af H1975 og 95D-celler, som var enten knock-down eller overekspression af E2F1were analyseret med et transwell assay under anvendelse af en Matrigel-coated kammer. De migrerede celler blev plottet som det gennemsnitlige antal celler pr synsfelt fra 3 forskellige eksperimenter, som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene er middelværdier ± SD * betyder p. 0,05. D og E, er vist Repræsentative billeder af assays. Original forstørrelse:. × 200

E2F1 regler ERK og PI3K-AKT-pathway i 95D og H1975 celler

E2F1 spiller en kritisk rolle i celle-cyklus progression, hvilket igen fremmer celler proliferation og metastase. Den præcise mekanisme af E2F1 funktion er kompleks og afhænger af cellulær sammenhæng [18]. En nylig undersøgelse viste, at E2F1-afhængig tumorprogression blev udløst ved aktivering af de cytoplasmiske Ras /Raf signaleringskaskader, såsom PI3K-AKT [16] og MEK-ERK pathways [19], hvoraf de fleste regulerer celleproliferation, overlevelse og invasion [20], [21]. Således har vi undersøgt, t om miR-493 regulerer disse veje ved at målrette E2F1. Opregulering af MIR-493, via transfektion af MIR-493, i 95D og H1975-celler faldt phosphoryleringsniveauerne af AKT og dets nedstrømsmål GSK3p (figur 6A). Tilsvarende MIR-493 undertrykte også niveauerne af phosphoryleret ERK (figur 6A). Vi observerede også, at knockdown af MIR-493 via transfektion med anti-MIR-493 i HBE, A549 og H1299-celler, hvor den relative ekspressionsniveau af MIR-493 var højere, steg niveauerne af phosphoryleret AKT, GSK3b og ERK ( figur 6B). Disse western blotting resultater viste, at MIR-493 er negativ regulator af AKT og ERK pathways. Efterfølgende blev redningsforsøg udført ved overudtrykker E2F1-Δ3′- UTR vektoren (uden et endogent 3′-UTR) i MIR-493-behandlede celler. MIR-493-induceret nedregulering af E2F1 blev reddet ved indførelsen af ​​E2F1 (figur 6C), og phosphoryleringsniveauerne af AKT og ERK blev ændret på lignende måde. Disse iagttagelser antyder, at MIR-493 inhiberer AKT og ERK veje ved at målrette E2F1.

(A) MIR-493 overekspression reducerede aktiviteten af ​​AKT og ERK veje i 95D og H1975-celler. (B) Den knockdown af miR-493 med med anti-miR- 493 forøgede aktivitet AKT og ERK signalering i HBE, A549 og H1299 celler. (C) MIR-493 (eller scramble kontrol) transfektion efterfulgt af E2F1 (eller mock vektor) transfektion 24 timer senere i 95D-celler påvirker AKT og ERK-signalering. Den AKT pathway aktivitet blev målt ved at undersøge ekspressionen af ​​fosforyleret AKT (Pakt), mens EKR pathway aktivitet blev målt ved at undersøge ekspressionen af ​​phosphoryleret ERK (pERK).

Diskussion

Selv om en håndfuld undersøgelser har identificeret specifikke miRNA er involveret i human tumorigenese og progression [10], [11], [12]. Vi mener også bør gøres en større indsats for at identificere relevante miRNA samt de specifikke mekanismer, som de udføre deres specifikke opgaver, navnlig med hensyn til onkogenese og progression af forskellige typer af tumorer. Her identificerede vi, at MIR-493, en potentielt kandidat tumor suppressor miRNA [22], [23], blev markant reduceret i lungekræft, og at lavere MIR-493-ekspression var forbundet med tumormetastase og dårlig prognose (figur 1C, D og tabel 1). Ektopisk ekspression af MIR-493 markant svækkede cellernes evne til at proliferere og invadere i lungecancerceller 95D og H1975 in vitro og in vivo.

Til dato karakteriseringen af ​​MIR-493 funktion har ikke været omfattende , selv om der er identificeret flere mål med en central rolle i celle migration og metastase veje, herunder FZD4, Rhoc, MKK7 og IGF1R [22], [23], [24]. Her har vi identificeret en ny målsætning om miR-493, E2F1. E2F1 er en vigtig transkriptionsfaktor som spiller en kritisk rolle i celle-cyklus progression og er stramt reguleret af retinoblastomproteinet (Rb) [25]. Inaktivering af Rb frigiver E2F1 fra den undertrykkende kompleks, som på sin side inducerer den kontinuerlige ekspression af målgener hvis produkter fremme cellecyklusprogression [26]. Den ektopiske udtryk for E2F1 resultater i neoplastisk transformation af gnaver celler [27], [28], og resultater fra transgene modeller viser, at øget E2F1 aktivitet er forbundet med tumor udvikling i flere væv [29], [30], [31] . Abnormiteter i E2F1-genekspression og /eller E2F1 genamplifikation er blevet beskrevet i forskellige cancercellelinier og tumortyper, herunder lungecancer [32], [33]. Notatet er overekspression af E2F1 ofte forbundet med høj kvalitet tumorer og dårlig patient overlevelse prognose [29], [31], [34], hvilket tyder på, at dets onkogene egenskaber strække sig ud over evnen til at stimulere den afvigende vækst af neoplastiske celler. I overensstemmelse med disse resultater, har de seneste beviser afsløret, at E2F1 er mest relevant for kræft metastase og kemoresistens [18], [19], [35]. Her viser vi, at ekspressionen af ​​E2F1 er høj i lungekræft. I mellemtiden har vi bestemt, at miR-493 direkte retter sig mod og hæmmer E2F1protein udtryk. En dual-luciferase reporter analyse viste, at MIR-493 kunne binde til sekvensen ved 3′-UTR af E2F1 (figur 4B). Desuden indførelsen af ​​MIR-493 mindsket ekspression af cellulære E2F1 mRNA og protein (figur 5C, D) .Whereas, når inhiberende oligonukleotider mod MIR-493 blev transficeret ind i HBE, A549 og H1277-celler, en invers ekspressionsmønster var observeret mellem mIR-493 og E2F1-protein (figur 6 B). Fordi E2F1 spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​celleproliferation, overlevelse og invasion, vi undersøgt, om E2F1 bidrager til effekten af ​​miR-493 på disse fænotyper af lungekræft celler. Vi konstruerede siRNA fragmenter målretning E2F1 at vælte ekspressionen af ​​E2F1, og fandt, at knock-down af E2F1 delvis kunne simulere cellevækst (figur 5 A) og celleinvasion (figur 5 D, E) fænotype induceret af overekspression af miR-493. Endvidere overekspressionen af ​​E2F1 (uden et endogent 3′-UTR) reddet inhibering af cellevækst og invasion forårsaget af MIR-493 (figur 5B, D og E).

En nylig undersøgelse viste, at E2F1- afhængig tumorprogression blev medieret af aktiveringen af ​​de cytoplasmatiske Ras /Raf signaleringskaskader [19], såsom MEK-ERK og PI3K /AKT pathway, hvoraf de fleste regulerer celleproliferation, overlevelse og invasion. I denne undersøgelse viste vi, at MIR-493 kan inhibere den konstitutive aktivitet af AKT og ERK veje ved at målrette E2F1. Efterfølgende rednings forsøg indikerede, at MIR-493-induceret nedregulering af E2F1 blev reddet ved indførelsen af ​​E2F1 (figur 3B), og phosphoryleringsniveauerne af AKT og ERK blev ændret på lignende måde. Disse observationer tyder på, at miR-493 hæmmer AKT og ERK veje ved at målrette E2F1.

Samlet set data fra vores undersøgelse foreslået, at miR-493 kan være en potentiel tumor undertrykkende miRNA, der hæmmer celle invasion og spredning af blokering E2F1 i lungekræft, og efterfølgende undertrykker den nedstrøms AKT og ERK signalveje, for at kontrollere celleproliferation, invasion og tumorigenese. Dog vil fremtidige undersøgelser nødt til at opdage flere kandidat mål i andre typer kræft til helt klarlægge funktionen af ​​miR-493 i tumorigenese.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

human lunge cancercellelinier (H1975, A549, H1299, H446), MRC5, en normal diploid human cellelinie af lungefibroblaster, og immortaliserede humane bronkiale epitelceller HBE blev indhentet fra og føres som anbefales af American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA, USA) .Den human lungecancer-cellelinje 95D blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). The H1975, A549, H1299, H446, HBE og 95D-celler blev holdt i RPMI-1640-medium (Hyclone, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, USA). De MRC5 celler blev holdt i DMEM-medium (Hyclone, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum. (FBS; Hyclone, USA) .De celler blev inkuberet i en atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C

Patientprøver

Alle vævsprøver blev indsamlet via kirurgisk resektion fra patienter diagnosticeret mellem marts 2009 og marts 2012 på den Tilknyttet Tumor Hospital i Guangzhou Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kina). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité i Guangzhou Medical University.

Revers transkriptase (RT) -PCR og QRT-PCR

Den samlede RNA blev ekstraheret fra celler eller væv ved hjælp Trizol reagens ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og RT-reaktioner blev udført under anvendelse af et mIR-493 specifik primer. De specifikke stem-loop RT primere for miR-493 og U6 blev købt fra Ribobio co., Ltd (Guangzhou, Kina). Primersekvenserne af E2F1 blev defineret som følger: Forward primer: 5′-CCCATCCCAGGAGGTCACTT-3 ‘; Reverse primer: 5-CTGCAGGCTCACTGCTCTC-3 ‘. Primersekvenserne af GAPDH blev defineret som følger: Forward primer: 5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ‘; Reverse primer: 5’-TGACAAGCTTCCCGTTCTCA-3 ‘. Real-time PCR blev udført under anvendelse af en standardprotokol for SYBR Green PCR-kittet (Toyobo, Osaka, Japan). U6 og GAPDH blev brugt som referencer for de miRNA og mRNA hhv. De 2

-ΔΔCt fremgangsmåde blev anvendt til bestemmelse af de relative mængder af genekspression. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer.

Western blot-analyse

Proteinkoncentrationen i lysaterne blev målt med proteinet BCA Assay Kit (Bio-Rad), og 30 ug af protein blandet med 2 × SDS loading buffer blev påsat pr bane. Proteinerne i lysaterne blev separeret med 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore). Derefter blev membranerne inkuberet i 12 timer ved 4 ° C med et antiserum indeholdende antistoffer mod E2F1, p-ERK, andβ-actin købt fra cellesignalering Technology, Akt, p-Akt, GSK3p og p-GSK3p og ERK indkøbt fra Sigma -Aldrich Technology. En peroxidase-konjugeret sekundært antistof og ECL Western blotting-påvisningsreagenser blev anvendt til visualisethe målproteiner (ECL New England Biolabs), som blev kvantificeret med et Bio billede Intelligent kvantifikator 1-D (Version 2.2.1, Nihon-BioImage Ltd.). En anti-β-actin-antistof blev anvendt som et protein loading kontrol.

Immunhistokemi

væv slides omfattede 65 primære lunge prøver og tilsvarende normale lunge epitelvæv. Immunhistokemi blev udført på formalinfikseret paraffinindlejret væv ved anvendelse af anti-E2F1-antistof (cellesignalering Technology) og standard streptavidin-peroxidase farvningsfremgangsmåde (biotin-streptavidin (ABC) IHC afsløring kits, Abcam Inc, USA). Immunhistokemi resultater blev scoret i henhold til den intensitet (0-4) og procentdelen af ​​positive celler score 0: ingen farvning; 1: 10% positive celler; 2: 11-50% positive celler; 3: 51-75% positive celler; 4: 0,75% positive celler.Varens relativ udtryk blev opnået ved at gange intensiteten med den procentsats

Luciferase reporter assay

En pmirGLO Dual-Luciferase miRNA target ekspressionsvektor blev anvendt til tre. ‘-UTR luciferase assays (Promega). De målgener af miRNA-493 blev udvalgt på grundlag af de mål scan algoritmer [microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/home.do) og Targetscan (https://www.targetscan.org/) ]. Primersekvenserne anvendte defineret som følger: E2F1 fremad primer: GCCTCGAGGAGATGCTCACCTTGTCTCTG, den omvendte primer: CTAGCGGCCGCTGGATCTGCTTTTGAGTT. Mutant E2F1 fremad primer: GAGGTGAGTGGGG

ACAAGG

CTGATGTGGGCAGGAGGGGTG, Mutant E2F1 vender primer: CCTGCCCACATCAGCCTTGTCCCCACTCACCTCTCCCATCTC. Fed angiver XhoI (CTCGAG), og understregning angiver NotI interne hjemmeside. Italic (wild: GACCTTCA, mutant: ACAAGG) angiver målsekvensen. For 3′-UTR luciferase-assayet blev 293T-celler cotransficeret med HSA-MIR-493 og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA målrette ekspressionsvektorer med vildtype eller mutant målsekvens under anvendelse af lipofectamin 2000.The luciferase assay blev udført ved anvendelse af Dual-Luciferase reporter Assay System (Promega) 48 timer efter transfektion. Dataene er præsenteret som middelværdien ± SD for tredobbelte eksperimenter og sammenlignet med niveauet af vildtypesekvensen vektorer opnået i mutant-typen sekvens vektor transficerede celler, som er normaliseret til 100%.

lentivirus produktion og infektion

for at konstruere en vektor, der udtrykker mIR-493, precursor-sekvensen af ​​mIR-493 (MI0003132) blev syntetiseret, annealet og derefter indsat i BamHI-HindIII fragment af pGCI-L3-vektor (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD USA) .De lentivirus plasmider blev co-transficeret med PLP1, PLP2, og PLP /VSVG (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD USA) i 293T-celler (Invitrogen), og de virusholdige supernatanter blev fremstillet ifølge producentens anvisninger. For lentivirus-infektion, blev cellerne inkuberet med virusholdige supernatanter i nærvær af 6 ug /ml polybren. De inficerede celler blev selekteret i nærvær af 2 ug /ml puromycin til at generere to parrede stabile monoklonale cellelinier (en stabil cellelinie, der udtrykker MIR-493, 95D-MIR-493, H1975-MIR-493 og deres kontrol stabil cellelinie, 95D -styring eller H1975- kontrol).