PLoS ONE: β-lapachon Markant øger effekten af ​​ioniserende stråling til Årsag Mitochondriel Apoptose via JNK Aktivering i cancerceller

Abstrakt

Baggrund

β-lapachon (β-lap), har været kendt for at forårsage NQO1-dependnet død i cancerceller og sensibilisere cancerceller for ioniserende stråling (IR). Vi undersøgte mekanismerne bag strålingssensibilisering forårsaget af β-lap

Metodologi /vigtigste resultater

β-lap forbedret effekten af ​​IR til at forårsage klonogene celler i NQO1

+ -. MDA- MB-231-celler, men ikke i NQO1

– MDA-MB-231-celler. β-lap forårsagede apoptose kun i NQO1

+ celler og ikke i NQO1

– celler og det markant øgede IR-induceret apoptose kun NQO1

+ celler. Kombineret behandling af NQO1

+ -celler induceret ROS-generering, udløst ER stress og stimuleret aktivering af ERK og JNK. Inhibering af ROS-generering af NAC dæmpet effektivt aktiveringen af ​​ERK og JNK, induktion af ER stress, og efterfølgende apoptose. Vigtigere, hæmning af ERK afskaffet ROS generation og ER stress, mens hæmning af JNK ikke gjorde det, hvilket indikerer, at positiv feedback regulering mellem ERK aktivering og ROS generation udløser ER stress som reaktion på kombineret behandling. Endvidere forebyggelse af ER stress blokerede fuldstændigt kombinationsbehandling-induceret JNK-aktivering og efterfølgende apoptotisk celledød. Derudover kombineret behandling effektivt inducerede mitokondrier translokation af spaltet Bax, forstyrret mitokondrielle membranpotentiale, og den nukleare translokation af AIF, som alle effektivt blev blokeret ved en JNK-inhibitor. Caspaser 3, 8 og 9 blev aktiveret ved kombineret behandling, men hæmning af disse caspaser ikke afskaffe apoptose indikerer caspaseaktivering spillede en mindre rolle i induktion af apoptose.

Konklusioner /Betydning

β- lap forårsager NQO1-afhængig strålingssensibilisering af cancerceller. Når NQO1

+ celler behandles med en kombination af IR- og β-lap, positiv feedback regulering mellem ERK og ROS fører til ER stress forårsager JNK aktivering og mitokondrie translokation af kløvet Bax. Den resulterende fald i mitokondrie membran fører til translokation af AIF og apoptose

Henvisning:. Park M-T, Song M-J, Lee H, Oh E-T, Choi B-H, Jeong S-Y, et al. (2011) β-lapachon Markant øger effekten af ​​ioniserende stråling til Årsag Mitochondriel Apoptose via JNK Aktivering i kræftceller. PLoS ONE 6 (10): e25976. doi: 10,1371 /journal.pone.0025976

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 1, 2011; Accepteret: 14. september 2011; Udgivet: 6 oktober 2011

Copyright: © 2011 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Korea Health 21 R 0,05. (B) Celler blev behandlet med 2 pM β-lap og derefter udsat for stigende doser af IR 30 min efter behandling med β-lap. Efter 14 dage blev cellerne bedømt for kolonidannelse. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (C) Celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller kombinationen af ​​IR- og β-lap i de angivne tidsrum. Procentdelen af ​​celler med sub-G1 DNA-indhold blev bestemt ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdier ± SEMs

Vi analyserede virkningen af ​​β-lap på IR-induceret klonogen død NQO1

-. MDA-MB-231 og NQO1

+ – MDA-MB-231-celler. Celler blev udsat for forskellige doser af IR i nærvær eller fravær af 2 uM β-lap og klonogene overlevelse blev bestemt som vist i fig. 1B. De stråling Overlevelseskurverne til kombineret behandling blev normaliseret til døden ved β-lap alene. Strålingen overlevelse kurven for kombineret behandling med IR og β-lap var identisk i NQO1

+ – MDA-MB-231-celler. På den anden side, strålingen overlevelseskurve til kombineret behandling af NQO1

+ – MDA-MB-231-celler var signifikant stejlere især ved de lavere stråledoser end for IR-behandling alene resulterede i signifikant fald i skulderen af ​​overlevelse kurve. Reduktionen af ​​skulderen viste, at β-lap inhiberede reparation af subletale stråleskader i NQO1

+ -celler, men ikke i NQO1

-. Celler

Vi undersøgte den kombinerede virkning af IR og β-lap på apoptotisk celledød i NQO1

– MDA-MB-231 og NQO1

+ – MDA-MB-231-celler. Cellerne blev behandlet med 10 Gy IR alene, blev 2 pM β-lap alene, eller en kombination af IR og β-lap for forskellige længder af tid og apoptotisk celledød vurderet. Mens apoptose af NQO1

+ – MDA-MB-231-celler induceret af IR alene var omkring 13 og 14% efter 24 og 48 timer henholdsvis β-lap alene-induceret apoptose i ca. 18 og 40% af cellerne ved 24 og 48 timer, (fig. 1C). Kombineret behandling med IR og β-lap bemærkelsesværdigt forøget apoptotisk celledød i NQO1

+ – MDA-MB-231-celler; ca. 58 og 87% af cellerne apoptotiske efter 24 og 48 t. Tværtimod i NQO1

– MDA-MB-231-celler, ingen signifikant apoptose forekom efter behandling med IR eller β-lap alene eller endda med en kombination af IR- og β-lap, mest sandsynligt på grund af NQO1 mangel og et mutant form af p53 udtrykt i NQO1

-. MDA-MB-231 celler [13]

kombineret behandling med IR og β-lap markant inducerer ROS generation i NQO1

+ – MDA-MB -231 celler

Vi undersøgte inddragelse af ROS i kombineret behandling-induceret apoptotisk celledød i NQO1

– MDA-MB-231 og NQO1

+ – MDA-MB-231 celler. Vi først målte ROS med DCF farvning. Sammenlignet med individuel behandling med IR eller β-lap, kombineret behandling forårsagede langt mere stigning i ROS-niveauer i 3 timer i NQO1

+ – MDA-MB-231 celler, men ikke i NQO1

– MDA-MB-231 (fig. 2A). Vi bekræftede endvidere ROS generation ved kombineret behandling med IR og β-lap bruge en anden ROS afsløring farvestof, dihydroethidium (DHE). Som vist i figur 2B, observerede vi markant stigning i ROS-generering i NQO1

+ – MDA-MB-231-celler, men ikke i NQO1

– MDA-MB-231-celler efter kombineret behandling med IR og β-lap . For at bestemme, om stigningen i intracellulære ROS-niveauer var direkte relateret til apoptotisk celledød, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med antioxidanten NAC, før du udsætter cellerne for IR og β-lap. Som vist i figur 2C, forbehandling med NAC reducerede signifikant apoptotisk celledød forårsaget af kombineret behandling med IR og β-lap. Endvidere forbehandling med NAC effektivt svækkede den klonogene celledød forårsaget af kombineret behandling med IR og β-lap (fig. 2D). Disse iagttagelser antyder, at induktion af ROS kritisk bidrager til den apoptotiske og klonogenisk celledød forårsaget af kombineret behandling med IR og β-lap i NQO1

+ -. MDA-MB-231-celler

(A) og (B) Celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i de angivne tidsrum. Efter 3 timer blev cellerne inkuberet med 10 pM H2DCF-DA og 4 pM DHE henholdsvis i 30 minutter og derefter analyseret ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær af NAC (10 mM). Efter 24 timer blev procentdelen af ​​celler med sub-G1 DNA-indhold bestemt ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med kombinationen af ​​IR (2 Gy) og β-lap (2 uM) i nærvær eller fravær af NAC (10 mM). Celler lodes vokse i 10 til 14 dage og blev farvet med 0,5% krystalviolet og bedømt for kolonidannelse. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. * Signifikant forskel mellem celler i nærvær eller fravær af NAC efter kombineret behandling med IR og β-lap, s. 0,05

β-lap i kombination med IR aktiverer hurtigt ERK og JNK, der fører til apoptotisk celledød

for at afsløre den potentielle inddragelse af MAPK’er i apoptotisk celledød forårsaget af kombineret behandling med IR og β-lap, vi studerede niveauerne af de aktiverede former af MAPK’er i NQO1

– MDA-MB-231 og NQO1

+ – MDA-MB-231-celler ved Western blot-analyse under anvendelse af anti-phospho-antistoffer. Som vist i figur 3A, i NQO1

– MDA-MB-231-celler, IR alene let øget phosphorylering af ERK og JNK mens β-lap alene forårsagede en lille ændring i niveauerne af phosphoryleret ERK og JNK. Virkningen af ​​kombineret behandling var den samme som af IR alene. Phosphorylering af p38 MAPK i NQO1

– MDA-MB-231 celler var negativ efter enten enkelt eller kombinerede behandlinger med IR og β-lap. Men i NQO

+, – MDA-MB-231-celler, kombineret behandling førte til en hurtig opregulering af phosphoryleret ERK og JNK sammenlignet med behandling med IR alene eller β-lap alene (figur 3A.). ERK-aktivering var tydelig på 0,5 time, og forblev forhøjede i 3 timer efter kombineret behandling. Desuden JNK-aktivering begyndte at stige inden for 0,5 h, men formindsket 2 timer efter kombineret behandling i NQO1

+ – MDA-MB-231-celler. De samlede cellulære niveauer af ERK og JNK forblev konstant. IR behandling øget phosphorylering af p38 MAPK, mens β-lap-behandling forårsagede ingen ændring i phosphorylering af p38 MAPK. Phosphoryleringen niveau af p38 MAPK efter kombineret behandling var lavere end efter behandling med IR alene, hvilket indikerer β-lap undertrykt IR-induceret aktivering af p38 MAPK i NQO1

+ – MDA-MB-231-celler (. Figur 3A). At undersøge forholdet mellem aktiveringen af ​​MAPK’er og apoptotisk celledød, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med SP600125, PD98059, eller SB203580, inhibitorer af JNK, MEK /ERK, og p38 MAPK, henholdsvis før behandling med IR og β-lap. Som vist i figur 3B, PD98059 og SP600125 effektivt reducerede apoptotisk celledød forårsaget af kombineret behandling fra 56% til 24% og 13%, henholdsvis, hvorimod SB203580 var ineffektiv. For yderligere at undersøge involveringen af ​​ERK og JNK2 i den apoptotiske celledød forårsaget af kombineret behandling med IR og β-lap, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med siRNA’er målretning ERK og JNK2. I overensstemmelse med resultaterne opnået med farmakologiske inhibitorer, specifik inhibering af ERK og JNK2 med siRNA’er næsten helt afskaffet den apoptotiske celledød forårsaget af kombineret behandling (fig. 3C). Disse resultater viser, at ERK og JNK fungere som vigtige mediatorer af apoptotisk celledød induceret ved kombineret behandling med IR og β-lap i NQO1

+ -. MDA-MB-231-celler

(A) NQO1

– eller NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i de angivne tidsrum. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater. (B) og (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær af PD98059 (30 uM ), SP600125 (30 uM), SB203580 (30 uM), eller siRNA targeting ERK1 /2 eller JNK2. Procentdelen af ​​celler med sub-G1 DNA-indhold blev bestemt ved flowcytometri. Resultater fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som betyder ± SEMs.

Positiv feedback regulering mellem ROS og ERK induceret af kombineret behandling med IR og β-lap er afgørende for aktiveringen af ​​JNK

for at bestemme om ROS-generering er involveret i aktiveringen af ​​ERK og JNK ved kombineret behandling med IR og β-lap, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med antioxidanten NAC før behandling med IR og β -skød. Som vist i figur 4A, blev aktiveringen af ​​ERK og JNK ved kombineret behandling fuldstændigt blokeret ved forbehandling med NAC. Vi undersøgte dernæst bidrag ERK og JNK til ROS-generering forårsaget af kombineret behandling. Vi behandlede NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med siRNA’er målretning ERK og JNK2 før behandling med IR og β-lap. Som vist i figur 4B, siRNA-medieret ERK knockdown effektivt blokeret ROS-generering, som bestemt med DCF, induceret af β-lap alene og i endnu højere grad ved kombineret behandling, hvorimod siRNA targeting JNK2 ikke dæmpe ROS-generering.

(A) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær af NAC. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater. (B) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 3 timer i nærvær eller fravær af siRNA targeting ERK1 /2 eller JNK2. Efter 3 timer blev cellerne inkuberet med 10 pM H2DCF-DA i 30 minutter og derefter analyseret ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær af PD98059 eller SP600125. . Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater

For yderligere at belyse mulighederne for cross-talk mellem ERK og JNK, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med PD98059 eller SP600125. Som vist i figur 4C, aktivering af ERK og JNK ved kombineret behandling blev fuldstændig ophævet ved forbehandling med PD98059 og SP600125 hhv. Desuden PD98059 blokeres effektivt kombinationsbehandling-induceret aktivering af JNK, hvorimod SP600125 ikke svækker aktivering af ERK, hvilket indikerer, at ERK er en opstrøms aktivator af JNK (fig. 4C). Disse resultater indikerede, at β-lap i kombination med IR fører til positiv feedback regulering mellem ROS og ERK-aktivering, som kan bidrage til JNK- aktivering.

ROS-generering induceret af kombineret behandling med IR og β-lap er nødvendig for induktion af ER stress

Derefter undersøgte vi, hvorvidt kombineret behandling med IR og β-lap inducerer ER stress i NQO1

+ – MDA-MB-231 celler ved anvendelse af phosphorylering af eIF2α og hak ekspression. Som vist i figur 5A, IR alene ændrede ikke phosphorylerede eIF2α (p-eIF2α) niveauer og CHOP ekspression, og β-lap alene let øget p-eIF2α og CHOP ekspression. Men kombineret behandling markant induceret p-eIF2α og forøget CHOP ekspressionsniveau (fig. 5A). For yderligere at undersøge inddragelsen af ​​ER stress i apoptotisk celledød induceret af kombineret behandling med IR og β-lap, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med Salubrinal (Sal), en ER stress hæmmer. Som vist i figur 5B, Sal undertrykkes effektivt kombinationsbehandling-induceret apoptotisk celledød. Disse resultater indikerer, at ER stress er en stor bidragyder til kombineret behandling-induceret apoptotisk celledød i NQO1

+ -. MDA-MB-231 celler

(A) NQO1

+ – MDA-MB -231 celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i de angivne tidsrum. Cellelysater blev underkastet Western blot-analyse. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater. (B) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær af Sal (10 uM). Efter 24 timer blev procentdelen af ​​celler med sub-G1 DNA-indhold bestemt ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 3 timer i nærvær eller fravær af Sal (10 uM). Efter 3 timer blev cellerne inkuberet med 10 pM H2DCF-DA i 30 minutter og derefter analyseret ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær af NAC. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater. (E) og (F) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær af Sal, SP600125 eller PD98059. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater

Derefter undersøgte vi forholdet mellem ROS-generering og ER stress i NQO1

+ -. MDA-MB-231-celler behandlet med en kombination af IR og β-lap. Som vist i figur 5C, har forbehandling med Sal ikke dæmpe ROS-generering forårsaget af kombineret behandling, hvorimod forbehandling med NAC effektivt forhindret phosphoryleringen af ​​eIF2α (fig. 5D), hvilket indikerer, at ROS-generering induceret af kombineret behandling er påkrævet til induktion af eR stress.

eR stress fremkaldt af kombineret behandling med IR og β-lap er påkrævet til aktiveringen af ​​JNK

for at analysere forholdet mellem eR stress og MAPK’er (ERK og JNK), vi først undersøgt virkningen af ​​Sal på aktiveringen af ​​ERK og JNK. Som vist i figur 5E, forbehandling med Sal effektivt undertrykt aktiveringen af ​​JNK induceret af kombineret behandling, men ikke dæmpe aktiveringen af ​​ERK. For yderligere at etablere den kritiske rolle MAPK’er i induktionen af ​​ER stress, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med PD98059 eller SP600125. Som vist i figur 5F, blev kombineret behandlings-induceret phosphorylering af eIF2α fuldstændigt blokeret af PD98059, men ikke af SP600125. Disse resultater indikerer, at ERK er en opstrøms aktivator af ER stress ansvarlig for JNK-aktivering som respons på kombineret behandling med IR og β-lap.

kombinerede behandling med IR og β-lap inducerer apoptotisk celledød gennem cellekernetranslokering AIF

Da aktivering af caspase vej er en vigtig mekanisme til at inducere apoptotisk celledød [14] undersøgte vi inddragelse af caspaser i apoptotiske respons på kombineret behandling af NQO1

+ – MDA-MB -231 celler med IR og β-lap. Som vist i figur 6A, kombineret behandling førte til aktiveringer af caspase-8, -9 og -3. Bemærk at aktivering af caspase 9 og 3 fandt sted før aktivering af caspase 8. IR eller β-lap alene forårsagede ingen tydelige aktiveringer af disse caspaser. Cytochrom c frigivet fra mitokondrier er blevet rapporteret at danne et kompleks med procaspase-9 og apoptotisk protease-aktiverende faktor-1 (Apaf-1), hvilket resulterer i aktivering af procaspase-9 [14]. Derfor har vi fastslået, om kombineret behandling med IR og β-lap inducerer frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier til cytosolen. Som vist i figur 6B, kombineret behandling effektivt øget omfanget af cytochrom c i den cytosoliske fraktion i 12 timer, mens IR eller β-lap alene ikke gjorde. Vi derefter undersøgt kravet om caspase til kombineret behandling apoptose under anvendelse af en bredspektret caspaseinhibitor, z-VAD-fmk. Figur 6C viser, at z-VAD-fmk effektivt forhindret aktivering af caspaser forårsaget af kombineret behandling. Imidlertid overraskende z-VAD-fmk kun delvist reduceret kombineret behandling-induceret apoptotisk celledød fra ca. 51% til 42% (fig. 6D). Disse resultater indikerer, at den apoptotiske celledød forårsaget af kombineret behandling med IR og β-lap sker, selv om aktivering af caspaser inhiberes

(A) NQO1

+ -. MDA-MB-231-celler var behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i de angivne tidsrum. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater. (B) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 12 timer. Cytosoliske fraktioner fra NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev fremstillet og underkastet Western blot analyse. Dataene er repræsentative et typisk eksperiment udført tre gange. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater. (C) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med kombinationen af ​​IR- og β-lap i 12 timer i nærvær eller fravær af z-VAD-fmk. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær af z-VAD-fmk (30 pM ). Efter 24 timer blev den procentdel af cellerne med sub-G1 DNA-indhold bestemt ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (E) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 24 timer. Nukleare fraktioner fra NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev fremstillet og underkastet Western blot analyse. Dataene er repræsentative et typisk eksperiment udført tre gange. (F) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær af siRNA targeting AIF. Efter 24 timer blev den procentdel af cellerne med sub-G1 DNA-indhold bestemt ved flowcytometri. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg er udtrykt som middelværdi ± SEM. (G) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler blev behandlet med kombinationen af ​​IR- og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær af NAC, PD98059, Sal eller SP600125. Nukleare fraktioner blev fremstillet og underkastet Western blot analyse. Dataene er repræsentative et typisk eksperiment udført tre gange.

Fordi AIF, en mitokondrier-lokaliseret flavoprotein, er kendt for at være involveret i induktion af caspase-uafhængig apoptotisk celledød [7], vi næste undersøgt, om AIF spiller en rolle i induktionen af ​​celledød ved kombineret behandling med IR og β-lap. AIF frigives fra mitokondrier som respons til celledød stimuli, efterfølgende translokerer til kernen, hvor det forårsager DNA-fragmentation [7]. Subcellulær fraktionering viste, at kombineret behandling dramatisk inducerede den nukleare translokation af AIF, mens IR eller β-lap alene forårsagede lidt stigning i AIF i kernen (fig. 6E). Desuden siRNA-medieret AIF knockdown reduceres effektivt kombinationsbehandling-induceret apoptotisk celledød fra 55% til næsten kontrolniveauer (fig. 6F). Disse resultater tyder på, at nuklear translokation af AIF er nødvendig for induktion af apoptotisk celledød ved kombineret behandling med IR og β-lap.

For yderligere at definere roller ROS, ERK, ER stress og JNK i nukleare translokation af AIF efter kombineret behandling med IR og β-lap, vi forbehandlet NQO1

+ – MDA-MB-231 celler med de tilsvarende hæmmere, NAC, PD98059, Sal eller SP600125 og undersøge den subcellulære lokalisering af AIF. Som vist i figur 6G, blev den nukleare translokation af AIF induceret af kombineret behandling fuldstændigt blokeret ved forbehandling med NAC, PD98059, Sal eller SP600125. Disse resultater viser, at ROS, ERK, ER stress og JNK er opstrøms aktivatorer af AIF-medieret celledød induceret ved kombineret behandling med IR og β-lap.

kombinerede behandling med IR og β-lap inducerer mitokondriel translokation af kløvet Bax og afbrydelse af mitokondrie transmembranpotentialeændring

for at fastlægge den rolle, mitokondrie vej i kombineret behandling-induceret apoptose i NQO1

+ – MDA-MB-231 celler, vi først undersøgt ændringer i Bd-2 og Bax ekspressionsniveauer og mitokondrie transmembranpotentiale. Som vist i figur 7A, blev Bax niveauer tydeligt reduceret som respons på kombineret behandling med IR og β-lap, men ikke som respons på individuel behandling med IR eller β-lap. Ekspressionsniveauerne af Bcl-2 var uændret ved individuel eller kombineret behandling. Det er blevet rapporteret, at Bax spaltes fra en 21 kDa native form til en kDa fragment 18 som reaktion på død stimuli [15], [16]. Fordi translokation af 18 kDa spaltet Bax fra cytosolen til mitokondrierne er blevet rapporteret at inducere et fald i mitokondrie transmembranpotentiale og efterfølgende frigivelse af proapoptogenic proteiner fra mitokondrier [15], [16], undersøgte vi, om kombineret behandling inducerer mitokondriel translokation af spaltet Bax . Som vist i figur 7B og C, kombineret behandling med IR og β-lap mere effektivt forøgede niveauerne af 18 kDa spaltet Bax inden den mitokondriske fraktion end individuel behandling med IR eller β-lap. Men 18 kDa form af Bax var målbart i helcellelysater efter kombineret behandling (fig. 7C). Fordi en cathepsin-lignende protease er blevet foreslået at være involveret i den hurtige nedbrydning af 18 kDa form af Bax i cytosolen [17], vi forbehandlet celler med proteaseinhibitoren MG132 at vide, hvorfor spaltet Bax var fraværende i helcellelysat efter kombineret behandling med IR og β-lap. Som vist i figur 7D, når celler blev behandlet med kombinationen af ​​IR- og β-lap i nærvær af MG132, spaltet Bax blev detekteret i helcellelysat, hvilket indikerer, at spaltet Bax let nedbrydes i cytosolen efter kombineret behandling med IR og β -skød. Således kan 18 kDa form af Bax være ustabile i cytosolen, men stabil i den mitokondriske fraktion efter kombineret behandling med IR og β-lap. Som vist i figur 7E, kombineret behandling forstyrret betydeligt mitokondrielle transmembranpotentiale i en tidsafhængig måde, hvilket faldt sammen med de observerede ændringer i Bax niveauer. . Samlet set viser disse resultater, at kombineret behandling celledød involverer en ændring i mitokondrie transmembranpotentiale medieret af intracellulær omfordeling af spaltet Bax

(A) NQO1

+ – MDA-MB-231-celler var behandlet med IR alene, β-lap alene eller en kombination af IR- og β-lap i de angivne tidsrum. Cellelysater blev underkastet Western blot-analyse. Dataene repræsenterer et typisk eksperiment udført tre gange med lignende resultater.