PLoS ONE: Route of administration TLR9 agonist CpG Kritisk Bestemmer Effekt af Cancer Immunterapi i mus

Abstrakt

Baggrund

TLR9 agonist CpG i stigende grad anvendes i prækliniske og kliniske undersøgelser som en terapeutisk modalitet at øge tumor immunitet. Den kliniske anvendelse af CpG synes imidlertid mindre vellykket, end det ville forudsiges ud fra dyreforsøg. En årsag kan være de forskellige administrationsveje anvendes i de fleste mus undersøgelser og kliniske forsøg. Vi studerede, om effekten af ​​CpG som hjælpestof i cancer immunterapi er afhængig af rute CpG administration, især når tumoren er destrueret

in situ

.

Metode /vigtigste resultater

In situ tumor ødelæggelse teknikker er minimalt invasive terapeutiske alternativer til behandling af (Nonresectable) solide tumorer. I modsætning til kirurgisk resektion, tumor ødelæggelse fører til induktion af svage, men tumor-specifik immunitet, der kan forbedres ved coapplication CpG. In situ tumor destruktion ved cryosurgery skaber en øjeblikkelig lokal frigivelse af antigener, vi anvendte denne model til at studere effekten af ​​CpG at øge antitumor immunitet ved indgivelse ad forskellige ruter: peritumorale, intravenøse og subkutane men fjernt fra tumoren. Vi viser, at peritumoral administration er overlegen i aktiveringen af ​​dendritiske celler, induktion af tumor-specifik CTL og langvarig tumor beskyttelse. Selv om intravenøs og subkutan (ved fjernt sted) engagementer er almindeligt anvendt i kliniske forsøg, de kun giver delvis beskyttelse eller endda undladt at forbedre antitumor reaktioner som induceret af cryosurgery alene.

Konklusioner /Betydning

CpG administration høj grad forbedrer effektiviteten af ​​in situ tumor destruktionsteknikker, forudsat at CpG administreres i umiddelbar nærhed af de frigivne antigener. Derfor denne undersøgelse er med til at give anvisninger til fuldt ud at drage fordel af CpG som immun stimulerende i en klinisk

Citation:. Nierkens S, den Brok MH, Roelofsen T, Wagenaars JAL, Figdor CG, Ruers TJ, et al . (2009) Route of administration TLR9 agonist CpG Kritisk Bestemmer Effekt af Cancer Immunterapi i mus. PLoS ONE 4 (12): e8368. doi: 10,1371 /journal.pone.0008368

Redaktør: Roberto F. Speck, Universitetshospital Zürich, Schweiz

Modtaget: Oktober 11, 2009; Accepteret: November 25, 2009; Udgivet: 18. december 2009

Copyright: © 2009 Nierkens et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev muliggjort af tilskud på den hollandske Cancer Society (KWF-2003-2893, KWF-2004-3137, KWF-2005-3325). SN er forskningsstipendiat af den hollandske Cancer Society (KWF, Amsterdam, Holland). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kirurgisk resektion af solide tumorer generelt giver den bedste chance for helbredelse hos kræftpatienter. I mange tilfælde dog tumor læsioner er ikke berettiget til resektion og kræver alternative destruktion teknikker, såsom Kryokirurgi, radiofrekvens eller laser ablation. Disse metoder giver minimalt invasive behandlinger for en lang række tumorer. Faktisk var radiofrekvens sig at give lokal tumor kontrol svarende til resektion i en undergruppe af patienter [1], der understreger, at destruktion teknikker in situ tumor bliver mere og mere succesfulde behandlingsmetoder.

I modsætning til kirurgisk resektion, in situ tumordestruktion tilvejebringer et antigen kilde til rådighed for immunceller. Inddragelsen af ​​immunsystemet i clearance af tumorceller i stigende værdsat [2]. Antigen-præsenterende celler (APC), såsom dendritiske celler (DC), er godt rustet til at fagocytere døende celler og proces tumorantigener til præsentation for T-lymfocytter [3]. Faktisk seneste data viste, at DC i tumor drænende lymfeknuder effektivt erhverve tumor vragrester efter in situ tumor ødelæggelse [4]. Desværre, selvom tumor ablation er blevet forbundet med forekomsten af ​​immunaktivering hos nogle patienter [5], udvæksten af ​​fjerne mikrometastaser indebærer, at ingen eller svage systemiske beskyttende immunresponser induceres.

Anvendelse af en nyligt udviklet musemodel vi tidligere viste, at in situ tumor destruktion ved hjælp af kryokirurgi eller radiofrekvens ablation førte til induktionen af ​​svage, men tumor-specifik immunitet [6], [7]. Disse resultater antydede, at kombinationen af ​​in situ tumor destruktive behandlingsmodaliteter med specifik immunstimulering kan være en strategi for at forbedre det kliniske resultat for et stigende antal af cancerpatienter.

I denne henseende toll-like receptor (TLR ) agonister er af stor interesse som immunadjuvanser. TLR er en familie af patogene anerkendelse receptorer, der udløses ved anerkendelse af patogen-associeret molekylære mønstre udtrykt af en forskelligartet gruppe af smitsomme mikroorganismer. Interessant det immunstimulerende styrke af Bacille Calmette-Guerin (BCG), der allerede anvendes i 1970’erne til stimulering antitumor immunitet [8], er nu kendt for at være BCG DNA, der binder til TLR9 [9], [10]. Yderligere undersøgelser viste, at DC udtrykker TLR9 og påvirkes direkte ved binding af TLR9 til ikke-methylerede CpG-motiver i DNA [8]. DC-aktivering forårsaget af CpG involverer en signaleringskaskade kulminerer i aktiveringen af ​​transkriptionsfaktorer fx nuklear faktor-KB (NF-KB), efterfølgende opregulering af co-stimulerende molekyler og produktion af chemokiner og cytokiner (fx IL-6, IL-12, TNF-a). Som et resultat, CpG-stimuleret DC inducere Th1-reaktioner og er medvirkende til aktivering af CD8

+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTL).

Faktisk vi tidligere rapporteret, at antitumor-responser synergistisk blev forbedret, når CpG var anvendes som en adjuvans i kryo ablation model. Co-injektion af CpG forøgede dannelsen af ​​tumor-specifikke CD8

+ CTL og beskyttet -100% af mus mod en fornyet challenge med tumorceller i denne bestemte model [6]. I andre modeller har CpG blevet vist effektivt at forebygge tumorudvækst i en profylaktisk omgivelser og også udryddet etablerede tumorer i mus [11], [12]. Anvendelsen af ​​CpG i kliniske forsøg synes dog mindre vellykket, end det ville forudsiges ud fra dyreforsøg. En fælles argument er forskellen udtryk for TLR9 i DC mellem mus og mennesker. TLR9 er rigeligt til udtryk i plasmacytoide DC (PDC) fra mus og mand, og i muse myeloide DC (MDC). Til human MDC, TLR9 udtryk er mindre klar, da nogle undersøgelser rapporteret svag til negativ udtryk [13], [14], mens en nylig undersøgelse viser, at den menneskelige MDC gøre indeholde TLR9 protein i mængder sammenlignelige med PDC [15]. Desuden MDC og pDC synes at være funktionelt forbundet i begge arter som intensiv krydstale mellem DC delmængder er afgørende for CpG-induceret immun aktivering i både mus og mennesker [16], [17].

Vi bemærkes, at i murine studier, der viser de mest potente CpG effekter, er CpG forsynet sammen med antigenet eller i umiddelbar nærhed af tumorantigener [12], [18], [19], [20]. Desuden har vi for nylig rapporteret, at co-lokalisering af antigen og CpG inden for DCs endosomale rum in vivo er tæt forbundet med evnen til at cross-foreliggende antigenet og induktion af efterfølgende beskyttende immunitet efter ablation [21]. I kliniske studier rute for CpG administration sjældent baseret på placeringen af ​​tumoren, men er generelt rettet af leverandørens forskrifter og /eller den lette indgivelse. Da disse forskelle i CpG administrationsveje kan få store konsekvenser for den kliniske effekt, vi sammenlignede effekten af ​​CpG administreres via forskellige veje i forhold til stedet for antigen tilgængelighed i en unik murine tumor ablation model. Vore data viser, at intravenøs (i.v.) og subkutane (s.c.) vej af CpG administration (hovedsagelig anvendes i det menneskelige indstilling) er langt mindre effektive end peritumorale (P.T.) CpG injektioner. Vi konkluderer, at succes eller en fiasko af CpG administration kritisk afhænger af placeringen af ​​CpG administration i forhold til placeringen af ​​tumoren.

Materialer og metoder

Mus og tumorceller

C57BL /6N mus (6-8 uger gamle) blev købt fra Charles River Wiga (Sulzfeld, Tyskland) og holdt under specifikke patogenfrie barriere forhold på Central Animal Laboratory (Nijmegen, Holland). Drikkevand og standard laboratorie foderpiller blev forsynet ad libitum og mus fik lov til at nøjes med mindst 1 uge før tilfældig tildeling i specifikke behandlingsgrupper. Forsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyr pleje af Nijmegen dyreforsøg udvalg.

OVA-transficerede murine melanom cellelinje B16F10 (B16OVA, klon MO5) er venligst leveret af dr. K. Rock [22] og dyrket i komplet medium (MEM, 5% føtalt bovint serum (Greiner Bio-on), 100 U /ml penicillin G natrium og 100 ug /ml streptomycin (Pen /Strep), MEM natriumpyruvat (1 mM), NaH

2 CO

3, MEM-vitaminer, MEM ikke-essentielle aminosyrer (alle fra Invitrogen), 20 uM β-mercaptoethanol (β-ME)) suppleret med 30 ug /ml hygromycin og 1 mg /ml G418. B16F10 melanoma cellelinien blev opnået fra American Type Culture Collection og opretholdt i komplet medium.

Tumor Model og cryokirurgi

Tumorceller blev suspenderet i en blanding af PBS og Matrigel (02:01 ) og 0,5 * 10

6 celler i et totalt volumen på 50 pi blev injiceret sc på det rigtige lårbenet. Når tumordiametre målt mellem 6-8 mm (generelt på dag 9-10), blev musene tilfældigt inddelt i behandlingsgrupper (ikke-behandlet, NT, cryo ablation; kryo). Cryo ablation blev udført under isofluran /O

2 /N

2O anæstesi ved hjælp af en flydende nitrogen kryo ablation-system (CS76, Frigitronics, Shelton, CT), hvoraf spidsen køles af en kontinuerlig strøm af cirkulerende flydende kvælstof. I 2 behandlingscykler med frysning og optøning af tumoren var makroskopisk frosset, mens omgivende sunde væv intakte. For at overvåge induktion af langvarig tumor beskyttelse, mus blev igen udfordret med 25 * 10

3 B16OVA celler 40 dage efter Cryo ablation. To måneder senere, mus, der overlevede den første tumor re-udfordring modtog sit andet re-udfordring med 5 * 10

4 B16OVA eller B16F10 celler. Mus blev aflivet, når tumorvolumen oversteg 1000 mm

3 eller når tumorer bremse gennem hudbarrieren.

CpG 1668 ( ‘5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’) med phosphorothioated skelet blev indkøbt fra Sigma Genosys (Haverhill, UK). CpG blev injiceret i PBS P.T. (100 ug delt over 3 injektioner af 10 pi omgiver tumoren), i.v. (100 ug i 100 pi), eller s.c. (100 ug i 30 pi i venstre femur af musen, dvs. på contra lateral side af henvist til placering af tumor mus). Injektioner blev udført inden for 30 minutter efter ablation. Vi brugte CpG 1668, som er en type B CpG, svarende til den kliniske kvalitet tilgængelig CpG øjeblikket anvendes i kliniske forsøg.

Berigelse og Analyser af DC

For at analysere DC biologi, DC var isoleret fra inguinale lymfeknuder dræner tumoren. Lymfeknuder blev udskåret og mosede hjælp nåle eller objektglas og fordøjet i collagenase type II og DNase i 15 minutter. Efter tilsætning af EDTA og resuspendere blev celler påført på et filter til at fjerne snavs og DC blev beriget ved positiv selektion under anvendelse af anti-CD11 c-mærket (N418) magnetiske mikroperler (Miltenyi Biotec BV).

Sådan studere skæbne antigen og CpG efter kryo ablation blev tumorer injiceret med fluorescens-mærket OVA-protein (OVA-Alexa488 eller OVA-Alexa647, 20 ug /20 pi) og Cy5-mærket CpG (CpG-Cy). CD11c-berigede celler blev inkuberet med Fc Block (CD16 /CD32; 2.4G2) og farvet med anti-CD11 c (HL3), biotinyleret anti-CD80 (1G10 /B7) eller isotypekontroller og streptavidin-PE, alle opnået fra BD Biosciences. Ekspression af CD80 blev analyseret i OVA

+ og OVA

– celler gated på CD11c

+ celler ved flowcytometri (FACS Calibur, Becton Dickinson Co, San Jose, CA). Det blev tidligere rapporteret, at optagelsen af ​​modellen antigen OVA ved knoglemarv-afledte DC høj grad afhænger af mannosereceptoren [23]. Derfor har vi gentaget vores eksperimenter med BSA-Alexa488 og ingen forskelle i udbredelse blandt DC in vivo blev observeret mellem de to antigener (data ikke vist). Salg

Ex Vivo T Cell Monitoring

Celler fra milt og tumor drænende lymfeknuder blev stimuleret i 5 timer med PMA (0,5 ug /ml) /ionomycin (0,1 ug /ml) i nærvær af Brefeldin A (10 ug /ml). Celler blev analyseret for CD8 og intracellulær ekspression af IFN-γ anvendelse af flowcytometri. Desuden blev cellerne stimuleret med anti-CD3 eller OVA-protein i 96 timer til at analysere sekretionen af ​​IFN-γ i supernatanten. IFN-y ELISA blev udført ifølge producentens instruktioner (BD Biosciences).

antigenspecifikke CTL

For at undersøge effektiviteten af ​​den differentierede CpG administration for at inducere antigenspecifikke CTL, milte og tumor-drænende lymfeknuder blev isoleret ti dage efter ablation. Blandede cellesuspensioner af lymfeknude og milt blev udpladet i plader med 24 brønde i komplet IMDM suppleret med hIL2 (10 U /ml) og stimuleret med bestrålede (1600 rad) B16OVA celler (5 * 10

4 celler /brønd), der var blevet behandlet natten over med r-IFN-γ (50 U /ml) til opregulere MHC klasse i præsentation. På dag 3-4 af dyrkning blev cellerne høstet og døde cellerester blev fjernet ved anvendelse af en Ficoll-gradient. Celler blev dyrket i friske plader med 24 brønde i yderligere 4-5 dage. For at visualisere tumor-specifikke CTL blev celler farvet med FITC-konjugeret CD4 (L3T4) eller CD8 (53-6.7) og APC-konjugerede OVA Kb tetramerer (Sanquin, Amsterdam, Holland) og analyseret ved flowcytometri.

statistiske Analyser

data blev analyseret ved hjælp af en to-tailed Students t-test eller envejs ANOVA for flere sammenligninger med Bonferroni som post hoc test.

Resultater

Akkumulering af Aktiverede Antigen-Loaded Modne dendritiske celler i drænende lymfeknuder afhænger af Route of CpG

priming af CD8

+ CTL afhænger unikke ved DC at fange ekstracellulære antigener og præsentere dem på MHC klasse I. Denne proces, kendt som cross-præsentation [24], kan være stærkt forbedret ved aktivering af DC via TLR9 [25]. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi virkningen af ​​rute CpG administration på DC funktion og antitumor respons efter kryo ablation.

Som vist i figur 1A, peritumorale CpG injektioner markant forøgede det absolutte antal DC, der akkumuleres i tumor-drænende lymfeknude 2 dage efter injektion i begge tumorbærende ikke-behandlede mus og i mus udsat for cryosurgery. Subkutan injektion af CpG på contra laterale side påvirkede ikke antallet af DC. Interessant, i.v. CpG injektioner øget ophobning af CD11c

+ DC i tumor-drænende lymfeknude kun, når det kombineres med cryo ablation (fig. 1A).

(A) det absolutte antal CD11c

+ celler i den drænende lymfeknuder 2 dage efter ablation. Tumorbærende mus forblev ubehandlede (NT) eller blev underkastet kryo ablation (kryo). Desuden er nogle grupper af mus modtog CpG via de angivne ruter. Konsoller angiver signifikante forskelle (p 0,05) mellem angivne grupper (n = 4-6 /gruppe, 2 lignende forsøg). (B) Optagelse af antigen efter kryo ablation. OVA-Alexa488 blev injiceret i B16OVA tumorer (6-9 mm) lige før kryo ablation at overvåge skæbnen af ​​antigen efter in situ tumor ødelæggelse. Mus blev desuden behandlet med CpG via de angivne ruter. To dage efter ablation, blev optagelsen af ​​antigen analyseret i CD11c

+ celler beriget fra puljer af tumor-drænende lymfeknuder. Numre i panelerne angive den procentdel af OVA

+ fremmest CD11c

+ celler. Data fra et repræsentativt mus er vist for hver gruppe. (C) Kvantitative analyser af replikater af eksperimenter som vist i (B) (5 mus /gruppe, repræsenterer 2 eksperimenter). (D) Optagelse af antigen og CpG af CD11c

+ -celler overvåget efter P.T. og i.v. CpG-Cy5 administration og intratumoral injektion af OVA-Alexa488. Data fra et repræsentativt mus er vist (n = 4 /gruppe). (E) Ekspressionen af ​​CD80 på CD11c

+ antigen-loaded celler. * Angiver signifikant forskellig (p 0,05) fra alle andre grupper (n = 5 /gruppe, 2 lignende forsøg)

Antigen internalisering og modning status DC er to store krav til induktion af. produktive antigenspecifikke immunresponser. Vi har tidligere vist, at cryo ablation kombineret med P.T. CpG administration synergistisk opregulerer ekspression af co-stimulerende molekyler [26]. For at undersøge, om rute for CpG administration differentielt påvirker evnen af ​​DC til at optage antigen, blev OVA-Alexa-488 injiceret i tumoren lige før ablation som en surrogatmarkør for opløselige antigener, der hurtigt frigives fra tumoren efter cryosurgery [ ,,,0],27]. Peritumoral CpG injektion samtidig med ablation synergistisk øgede optagelsen af ​​antigen ved at dræne lymfeknude DC. I modsætning hertil både i.v. og subkutant injektioner undladt at forbedre antigen-optagelse i enten tumorbærende ikke-behandlede mus eller mus udsat for cryosurgery (fig. 1B-C). Påføring fluorescens-mærket CpG, vi derudover konstateret, at hovedparten af ​​al lymfeknude DC fra mus udsat for CpG via P.T. eller i.v. injektioner havde internaliseret CpG. Mængden af ​​CpG pr DC var dog meget højere efter P.T. administration (fig. 1D) og OVA

+ DC havde erhvervet øgede niveauer af CpG sammenlignet med OVA

+ DC fra mus, som fik intravenøs CpG injektioner. Endelig s.c. og i.v. CpG injektioner kun let øget CD80 ekspression på antigen-loaded DC, mens P. T. CpG administration væsentligt forbedret niveauerne af co-stimulerende markører (fig. 1E).

Sammen viser disse resultater, at P.T. CpG injektioner øge antallet af antigen- og CpG-loaded, CD80-udtrykkende drænende lymfeknude DC efter kryo ablation in vivo. Indgivelse CpG via i.v. rute resulterer i ophobning af drænende lymfeknude DC efter ablation men disse DC udviser kun lidt forøget indhold af internaliseret antigen og CD80-ekspression sammenlignet med Cryo ablation alene. Subkutane injektioner af CpG på contra lateral side gøre øge antallet af DC i lokale lymfeknuder (data ikke vist), men ikke i det tumor-drænende lymfeknude og undlader at forbedre antigenoptagelse og CD80-ekspression.

Rute CpG administration Bestemmer Priming af CD4

+ og CD8

+ T-celler

for at få yderligere indsigt i konsekvenserne af differentierede DC fænotyper induceret af CpG administration via forskellige ruter in vivo splenocytterne og lymfocytter fra tumoren drænende lymfeknuder blev analyseret. Vi observerede, at de procentdele af IFN-γ

+ CD4

+ og IFN-γ

+ CD8

+ T-celler efter ikke-specifik (Fig. 2A) eller specifik re-stimulation (Fig. 2B), blev samt cellularitet af de lymfoide organer (ikke vist) berøres af CpG injektionsstedet. Peritumoral CpG injektioner øget IFN-γ

+ celler overvejende tumor-drænende lymfeknude og også lidt i milten. Efter i.v. injektioner antallet af IFN-γ

+ celler blev primært forøget i milten. CD8

+ IFN-γ

+ T-celler blev svagt forøget i lymfeknuden dræne ablaterede site. Subkutane CpG injektioner contra lateral af tumoren påvirkede ikke IFN-γ

+ T-celletal i det tumor-drænende lymfeknude.

(A) Procentdelen af ​​IFN-y

+ T-celler inden CD4

+ eller CD8

+ populationer efter kryo ablation +/- CpG. B16-OVA tumorbærende mus blev behandlet med kryo ablation kombineret med CpG indgivelse via de angivne ruter. Syv dage efter ablation, milt, tumor-drænende lymfeknuder og ikke-drænende lymfeknuder blev isoleret. Celler blev stimuleret med PMA /ionomycin og farvet for CD8, CD4 og IFN-γ. * Angiver signifikante forskelle (p 0,05) mellem den angivne CpG-behandlede gruppe og den naive og Cryo gruppe. (B) IFN-γ produktion efter cryo ablation +/- CpG. Celler blev stimuleret med OVA i 96 timer og IFN-γ blev målt i supernatanten ved ELISA. De gennemsnitlige niveauer af Cryo + CpG intravenøst grupper i begge organer er væsentlig forskellig fra alle andre grupper (n = 6 /gruppe, 2 eksperimenter).

Endelig tælling af OVA-specifikke CD8

+ T-celler 10 dage efter Kryokirurgi bekræftet den overlegne induktion af antigenspecifik CTL når CpG blev administreret pt (3,1% ± 1,1 af alle CD8

+, fig. 3). I forhold til kryo ablation alene (0,7% ± 0,2), hverken i.v. eller subkutant CpG injektioner gav en signifikant stigning i CTL (1,5% ± 0,4; 0,60% ± 0,2). Den samme tendens, men ikke signifikant, blev fundet for CTL specifik for B16 iboende tumor peptid TRP-2 (ikke vist).

(A) Repræsentative dot plots af CD8

+ OVA-Kb tetramer

+ celler fra individuelle mus. Mus der bærer B16OVA tumorer (6-9 mm) blev underkastet kryo ablation alene eller modtaget yderligere CpG injektioner via de angivne ruter. Ti dage efter tumor ødelæggelse, celler fra milt og tumor drænende lymfeknuder blev isoleret og restimuleret med IFN-y-behandlede y-bestrålede B16OVA tumorceller. Kulturer blev renset af en Ficoll trin efter 3-4 dages dyrkning og på dag 8-9 celler blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​tumor-specifik CTL ved anvendelse af APC-mærket OVA-K

b tetramerer. Celler blev gated på CD8

+ T-celler. Data fra en repræsentant mus per gruppe vises. (B) Kvantitative analyser af kollektive data som vist i (A) (middel niveauer af 2 separate eksperimenter (4-6 mus pr gruppe /eksperiment)). * Viser signifikante forskelle (p 0,05). Af den angivne gruppe sammenlignet med alle andre grupper

Kollektivt, disse data viser således, at den forbedrede lastning og modning af DC efter P.T. CpG administration korrelerer med den observerede stigning i lokal lymfocytaktivering.

peritumoral CpG indsprøjtninger er Superior i Induktion af Long-Term antitumorimmunitet

Ovennævnte data viser, at injektionsstedet af CpG i forhold til det ablateret tumor område er en afgørende determinant i induktionen af ​​tumor-specifikke CTL-responser. For yderligere at undersøge dens betydning, blev tumorbærende mus behandlet med kryo ablation og CpG blev givet enten P.T., s.c. eller i.v. Fyrre dage efter ablation, blev tumor-fri mus udfordret med en dødelig dosis af tumorceller.

cryosurgery kombineret med P.T. CpG forvaltninger beskyttet -90% af alle mus, hvorimod subkutan og i.v. CpG injektioner ikke væsentlig forbedring svarene induceret af cryosurgery alene (fig. 4A). Selvom i.v. CpG administration mislykkedes at øge overlevelse, tumorvæksten var betydeligt langsommere end i mus behandlet med s.c. injektioner eller med kryo ablation alene (fig. 4B). Disse data indikerer, at i.v. CpG injektioner kan fremkalde antitumor-responser, der er i stand til at begrænse tumorvækst og forlænge overlevelsen i et vist omfang. Men når mus modtog letal tumor udfordrer i.v. CpG injektioner beskyttet kun 50% af musene, mens der i tilfælde af P.T. CpG injektioner -90% af musene overlevede. CpG forbehandling af naive mus gav ikke nogen beskyttelse mod dødelige tumor udfordringer uanset indgivelsesmåde (data ikke vist).

(A) Kaplan-Meier-overlevelseskurverne for naive mus versus mus, der er blevet behandlet med kryo ablation alene eller i kombination med samtidig CpG indgivelse via de angivne ruter. Etablerede B16OVA tumorer på højre lårben blev behandlet med kryo ablation alene eller i kombination med CpG administrationer via forskellige ruter: P.T., i.v. eller s.c. contra lateral af tumoren. Fyrre dage senere, naive og tumor-fri mus (8-13 mus pr gruppe) modtog en s.c. re-udfordring med tumorceller (25.000 B16OVA celler). (B) Tumor størrelse bestemmes hver 2-3 dage efter behandling. Data repræsenterer to uafhængige forsøg.

Vi har tidligere vist, at timingen af ​​CpG administration er kritisk for effektiviteten af ​​P.T. CpG injektioner, når det kombineres med ablation. Den reducerede effekt af i.v. administreret CpG i de nuværende eksperimenter kan derfor vedrøre forsinkelsen, hvor CpG-ODN nå de frigivne antigener på ablation stedet. CpG blev derfor injiceret 1 dag før, sideløbende med eller 1 dag efter ablation. Administration af CpG 1 dag før ablation resulterede i lignende resultater som observeret for CpG injektioner samtidige med ablation (40-45% af musene overlevede). I modsætning hertil CpG administration 1 dag efter ablation undladt at forbedre antitumor immunitet som induceres ved kryo ablation alene (fig. 5). Den reducerede effekt af i.v. CpG administrationer sammenlignet med P.T. eksponering er således ikke skyldes timing aspekter.

Etablerede B16OVA tumorer blev behandlet med kryo ablation alene eller i kombination med i.v. CpG administration samtidig med ablation, eller 1 dag før eller efter ablation. Fyrre dage senere, naive og behandlede tumor-fri mus (7-10 mus pr gruppe) modtog en s.c. re-udfordring med tumorceller (25.000-50.000 B16OVA celler) på det modsat lateral flanke og overlevelse blev overvåget. Repræsentant for 2 eksperimenter er vist.

Diskussion

Selvom musemodeller tydeligt har vist de potente antitumor virkninger af CpG har kliniske resultater indtil videre været skuffende, med den seneste fase 2 og 3 forsøg i ikke-småcellet lungekræft bliver droppet på grund af svigt af sc CpG-ODN administration for at forbedre klinisk resultat [28]. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at indgivelsesvejen bestemmer effektiviteten af ​​CpG at stimulere immunresponser efter in situ tumor ødelæggelse. Peritumoral CpG administration øger antallet af aktiverede, modne, antigen-bærende DC i tumoren-drænende lymfeknude og stimulerer dannelsen af ​​tumor-specifikke CTL, der fører til overlegen hukommelse responser mod tumor-antigener. Subkutane CpG injektioner fjernt fra tumoren ikke forbedre antitumor immunitet. Også systemisk CpG indgivelse gennem i.v. injektion giver kun begrænset beskyttelse (50%) sammenlignet med peritumoral injektion (90% beskyttelse).

Anvendelse af en roman klinisk relevant in situ tumor ødelæggelse model, vi har tidligere rapporteret, at succes eller en fiasko af CpG som en vaccine-adjuvans afhænger af co-lokalisering af antigen og CpG inden endosomale DC rum og dermed på timingen af ​​CpG administration. Dendritiske celler har kun kunnet tværs præsenterer antigener og fremme CTL-induktion under forhold, hvor antigen og CpG blev co-lokaliseret i DC. Faktisk P.T. CpG administration 1 dag før eller efter tumor ablation, i stedet for samtidig CpG injektion, allerede haft en stor indflydelse på dets effektivitet [21]. Baseret på disse resultater, vi satte sig for at bestemme virkningen af ​​indgivelsesvejen på CpG i dette modelsystem. Mens subkutan CpG injektioner fjernt fra tumoren ikke starte nogen antitumor immunitet, i.v. CpG administration gav nogle overlevelse (ikke signifikant) i løbet af cryo ablation alene. Disse forskelle i effekten af ​​CpG ikke vedrørte forskelle i timingen, som anderledes timing regimer til i.v. CpG administration ikke forbedre dens effektivitet. Disse data viser, at både tid og rute CpG administration fastlægge effekten af ​​CpG terapi og antyde, at tilgængeligheden af ​​CpG i tid og sted i (lymfoide) væv er en vigtig faktor i adjuvanticitet CpG.

det er tidligere blevet postuleret, at resultatet af CpG-ODN indgivelse via en specifik vej kan afhænge af typen af ​​celler, der er stødt på ODN på et bestemt anatomisk sted [29]. De responsive celler i lymfeknuder drænende injektionsstedet kan aktivere en anden vej for TLR9 signalering end celler i milten. I overensstemmelse med denne hypotese er de observationer, at intratumoral [25], P. T. [26], [30] eller intra-lymfatisk [31] administration af CpG viste den forventede Th1-fremmende virkning og var meget effektiv til at forbedre T-cellemedieret immunitet. Derimod systemisk (i.v. eller i.p.) anvendelse af CpG resulterede i T-celle-undertrykkelse snarere end immunaktivering [32], [33], [34]. Lignende indikationer kom fra humane forsøg, hvor subkutant administrationer antigen plus CpG inducerede en systemisk Th1-lignende cytokin udtryk i serum, mens intravenøse injektioner forårsagede ingen sådanne virkninger [35].

Her viser vi, at DC taget fra tumor-drænende lymfeknude efter intravenøs CpG eksponering har internaliseret suboptimale niveauer af antigen og undlader at udtrykke høje niveauer af co-stimulerende molekyler. Dette kan skyldes manglende evne til indkommende DC at internalisere eller overføre antigen efter en tidligere møde med CpG. Da både hjemmehørende DC og migrerer DC er nødvendige for induktionen af ​​produktive CTL-priming [36] dette kan begrænse induktionen af ​​funktionelle CTL. Desuden blev det tidligere vist, at i.v. administration induceret ekspression af indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) i DC, et enzym forbundet med immunregulering og dannelse af regulatoriske T-celler (Treg), hvilket fører til undertrykte T-celle ekspansion og CTL-aktivitet. Selvom vi ikke undersøge immun regulerende egenskaber DC direkte, observerede vi markant øget antallet af CD4

+ Foxp3

+ treg i milten af ​​mus behandlet i.v. med CpG (data ikke vist). Treg hæmme induktionen af ​​antitumor immunresponser og vides at blive reguleret via flere mekanismer [37]. Den observerede suboptimal modning af DC i tumoren drænende lymfeknude kombineret med induktionen af ​​IDO-udtrykkende DC i milten efter i.v. CpG administration kan forhindre optimal immun aktivering.

Den foreliggende undersøgelse understreger, at CpG i kræft immunterapi bør administreres i umiddelbar nærhed af de frigivne tumorantigener. I kliniske undersøgelser CpG administreres generelt uafhængig af tumorantigen frigivelse [38]. Fra et klinisk synspunkt foretrækkes det at administrere CpG på en let tilgængeligt sted og i store mængder ifølge rationale, at det vil rejse til tumoren placering. Men vi viser her, at hverken s.c. administration på en fjern websted eller intravenøs injektion udnytte adjuverende kapacitet CpG. I tråd med vores data viser, at co-lokalisering af antigen og CpG favoriserer immunitet blev potente immunstimulerende svarene fra CpG fandt også i mennesker, når antigen (rekombinant hepatitis B overflade antigen) og CpG (CPG 7909) blev co-injicerede [39]