PLoS ONE: apoptotisk celledød induceret af Resveratrol er delvist medieret af Autophagy Pathway i Human kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Resveratrol (trans-3,4,5 ‘-trihydroxystilbene) er en aktiv forbindelse i fødevarer , såsom røde druer, jordnødder og bær. Resveratrol udviser en anticancervirkning på forskellige humane cancerceller. Men mekanismen for resveratrol-induceret anti-cancer effekt på det molekylære niveau forbliver, ikke belyst. I denne undersøgelse den mekanisme ligger til grund for anti-cancer virkning resveratrol i humane ovariecancerceller (OVCAR-3 og Caov-3) blev undersøgt under anvendelse af forskellige molekylærbiologiske teknikker, såsom flowcytometri, western blotting, og RNA-interferens, med en større fokus på den potentielle rolle autophagy i resveratrol-induceret apoptotisk celledød. Vi viste, at resveratrol inducerede reaktive ilt arter (ROS) generation, der udløser autofagi og efterfølgende apoptotisk celledød. Resveratrol induceret ATG5 udtryk og fremmet LC3 spaltning. Den apoptotisk celledød fremkaldt af resveratrol blev svækket af både farmakologisk og genetisk hæmning af autofagi. Den autophagy inhibitor chloroquin, der fungerer på det sene stadium af autofagi, signifikant reduceret resveratrol-induceret celledød og caspase 3-aktivitet i humane ovariecancerceller. Vi viste også, at målrettet ATG5 af siRNA undertrykte også resveratrol-induceret apoptotisk celledød. Vi konkluderede derfor, at et fælles pathway mellem autofagi og apoptose eksisterer i resveratrol-induceret celledød i OVCAR-3 humane ovariecancerceller

Henvisning:. Lang F, Qin Z, Li F, Zhang H, Fang Z Hao E (2015) apoptotisk celledød induceret af Resveratrol er delvist medieret af Autophagy Pathway i human æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 10 (6): e0129196. doi: 10,1371 /journal.pone.0129196

Academic Redaktør: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, FRANCE

Modtaget 31. oktober, 2014, Accepteret: 7 maj 2015; Udgivet: 11 juni 2015

Copyright: © 2015 Lang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle data er forudsat i manuskriptet

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den fremmende forskningsfond for unge og midaldrende videnskabsmænd Shandong-provinsen (Grant No. 07-21). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ovariecancer er en af ​​de vigtigste førende årsager til kræft dødsfald for kvinder og en høj hyppighed efter kirurgi [1] [2]. I de fleste tilfælde stilles diagnosen på sene stadier af cancer, og det bliver udfordrende for kirurgisk resektion og nyttiggørelse [2]. Således kan undersøgelser af aktive ingredienser i fødevarer give nyttige alternative terapeutiske tilgange til denne malignitet.

Resveratrol er en aktiv ingrediens fra vores fødevarer kilder, såsom druer, jordnødder, og bær, som længe har været anvendt i traditionel kinesisk medicin. Talrige undersøgelser har vist de gavnlige virkninger af resveratrol i cardiovaskulære sygdomme, neurale sygdomme, fedme og inflammatoriske lidelser [3-5]. Et af de store områder af resveratrol forskning er på forkant med kræftforskningen [6, 7]. Det er velkendt, at en høj dosis af resveratrol resulterer i apoptotisk celledød af ovariecancerceller [8-10]. Der er blevet foreslået adskillige mekanismer af ovariecancer celledød. Phosphorylering af Cdc2-Tyr15 af resultatet resveratrol behandling i cellecyklusstop af OVCAR-3 [9]. Nedregulering af Akt /GSK og ERK signalveje er blevet vist at være kritiske for resveratrol-medieret celledød [10]. For nylig, Lin et al. beskrev den vigtige rolle, ceramid og COX-2 i apoptotisk celledød ved resveratrol i OVCAR-3 [8].

Autophagy er en konservativ selvstændig nedbrydningsvej ved hvilken cytosoliske bestanddele er sekvestreret til lysosomer for nedbrydning og genanvendelse [11]. Hos raske væv, dette er en proces af clearing af beskadigede organeller. Det er imidlertid en kompleks proces i cancerceller, hvor det enten kan undertrykke eller inducerer væksten af ​​cancerceller afhængigt af den cellulære mikromiljø [12].

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi potentielle rolle autofagi i resveratrol-induceret apoptotisk celledød i OVCAR-3 cancerceller. Vi fandt, at resveratrol behandling induceret ROS-generering og apoptose samt aktivering af autofagi pathway i OVCAR-3 celler. Inhibering af autophagy ved en farmakologisk inhibitor eller et siRNA mod ATG5 betydeligt svækket resveratrol-medieret apoptotisk celledød. Således er vores studie etableret en vigtig rolle autophagy i resveratrol-induceret apoptose i humane ovariecancerceller.

Materialer og metoder

Reagenser

Resveratrol, NAC (N acetyl cystein ), chloroquin, caspase 3 assaykit, og LC3 antistof blev indkøbt fra Sigma (USA). Resveratrol blev opløst i DMSO (Sigma, USA) og blev frisk fremstillet hver gang før cellebehandling. Anti-ATG5 antistof blev købt fra Beijing Biosyntese Biotechnology, ATG5-ATG12 Complex antistof var fra ABD Serotec, og anti-spaltet caspase 3 antistof blev bestilt fra Cell Signal teknologier. siRNA mod ATG5 blev opnået fra Shanghai GenePharma Co. Ltd. Z-VAD-FMK blev købt fra R D

Cell kultur

OVCAR-3 og Caov-3 humane ovarie cancer cellelinjer. blev opnået fra ATCC (USA). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 (Life Technology, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum, insulin og penicillin-streptomycin. Cellelinien blev dyrket i et CO

2 inkubator ved 37 ° C. Humanovarie Surface epithelceller (HOSEpiC) celler blev dyrket med æggestokkene epitelcelle Medium leveres fra producenten (ScienCell Research Laboratories). Resveratrol behandling blev beskrevet i tekst og tal.

Cell levedygtighed analyser

Cell levedygtighed blev udført ved hjælp af MTT-analyser i henhold til producentens anbefalinger. Kort fortalt blev cellerne udpladet i 96-brønds plader og dyrket natten over. Cellerne blev behandlet med resveratrol eller andre forbindelser som angivet i 48 timer. Cellerne blev vasket med medier og MTT blev tilsat 6 timer før endepunkt, og absorbansen ved 490 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser.

Apoptose Assay ved anvendelse af flowcytometri

apoptotisk celledød var målt ved farvning med Sytox Green og Annexin V-APC (Life Technology, USA) som tidligere beskrevet [13].

Cellular ROS assays

Samlet intracellulær ROS blev målt ved flowcytometri under anvendelse af H2DCFDA farvestof i overensstemmelse med producentens anbefalinger (Life Technology, USA).

Bestemmelse af mitokondrie elektron potentielle ændring

mitochondriemembranpotential blev vurderet ved hjælp af en levende celle assay med fluorescerende lipofile kationiske farvestof TMRE (Sigma )). Dette farvestof er en celleindtrængende farvestof, der let akkumulerer i aktiv mitokondrier grund af deres relative negativ ladning. Efter behandling OVCAR-3-celler blev farvet med 500 nM TMRE i 30 minutter ved 37 ° C, derefter vasket to gange i medium og resuspenderet i PBS. Cellerne blev analyseret i et flowcytometer ved FL2 kanal og den gennemsnitlige intensitet er plottet. itochondrial potentiale også analyseret ved en anden farvestof JC-1. Efter behandling som beskrevet i teksten, blev de fluorescerende billeder, taget med det samme ved hjælp af en Zeiss AX10 inverteret rækkevidde (Carl Zeiss Microimaging Inc., Tyskland).

Bestemmelse af 4HNE Protein addukter

4- HNE niveau i cellelysater blev målt ved anvendelse af OxiSelect HNE additionsprodukt ELISA Kit (Cell Biolabs) ifølge producentens instruktioner. Western blot blev også udført under anvendelse af et anti-HNE antistof (Abcam).

Western blotting analyser

Celler blev vasket med koldt PBS og lyseret med RIPA-buffer (Sigma, USA) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Roche, Tyskland). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af et protein assayreagens (Bio Rad, USA), og lige store mængder af protein (50 ug) blev fyldt i hver brønd på 4-20% eller 12% SDS-PAGE. Efter proteinerne blev overført til en nitrocellulosemembran, blev blottene blokeret med 5% mælk, efterfulgt af inkubation med det passende fortyndet primært antistof natten over. Efter tre vaske med TBS-T puffer blev blottene inkuberet med passende fortyndet HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 2 timer. Immunoblots blev udviklet ved anvendelse af SuperSignal West Femto kit (Fisher Scientific, USA).

RNA Interference

OVCAR-celler blev transficeret med enten uspecifik eller ATG5 siRNA hjælp lipofectamin (Life Technologies, USA) ifølge til producentens anvisninger. Celler blev inkuberet 48 timer før behandling med resveratrol for maksimal blokering af ATG5 ekspression.

Caspase 3-aktivitet

Caspase 3-aktivitet blev målt ved anvendelse af caspase 3-assay kit (Sigma, USA) ifølge producentens anvisninger. Protein- koncentrationer blev bestemt ved anvendelse af den tidligere beskrevne fremgangsmåde og lige store mængder af protein blev fyldt i en 96-brønds plade for caspase 3-assay.

PARP aktivitet

PARP-aktivitet, vi bruges HT Universal Kolorimetrisk PARP assaykit fra Trevigen. PARP-aktivitet bestemmes ved mængden af ​​PAR afsat på immobiliserede histonproteiner. Proceduren blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra producenten.

Live-cell imaging med autophagy indikator farvestof

Autophagic flux også blev bestemt ved anvendelse Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) i henhold til producentens anvisninger.

live-celle billedbehandling med fluroscent caspase substrat

caspase aktivering blev bestemt ved anvendelse CellEvent caspase-3/7 Grøn Detection Reagent (Life technologies, USA) i henhold til producentens anvisninger.

statistiske analyser

Alle data blev udtrykt som middelværdien med standardafvigelse på middelværdien. Forsøg blev gentaget fire gange i to eksemplarer for alle forsøg. T-test eller envejs ANOVA blev udført som hensigtsmæssigt at bestemme den statistiske signifikans. Betydningen blev etableret ved p. 0,05

Resultater

Resveratrol induceret apoptotisk celledød af humane ovarie kræftceller i en dosisafhængig måde

OVCAR-3 er en kemo resistent cancercellelinie etableret fra en æggestokkene adenocarcinom patient. Vi udnyttede OVCAR-3 celler som en

in vitro

cancercelle model til at teste anticancer effekter af resveratrol. Som vist i fig 1A, behandling med resveratrol ved 1 uM til 100 uM i 48 timer resulterede i en dosisafhængig tab af cellelevedygtighed som bestemt ved anvendelse MTT-assays. Behandling med 30 pM og 100 pM resveratrol viste en statistisk signifikant tab af cellernes levedygtighed efter 48 timer.

A. OVCAR3 celler blev behandlet med 1 til 100 uM resveratrol i 48 timer. Cellelevedygtigheden blev bestemt under anvendelse MTT-assays. Dataene blev indhentet fra et gennemsnit på fire uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med kontrol køretøj, n = 4 /gruppe. B. repræsentant Flowcytometrisk dot plots til måling af apoptose i OVCAR-3 celler. Resveratrol-induceret apoptose blev målt ved farvning med Sytox grønt farvestof (Y-akse, FL1) og Annexin V-APC (X-aksen, FL4). C. Kvantitativ bestemmelse af tidlig apoptotisk celledød som antallet af annexin V-positive celler med Sytox grøn-negative celler, og sent apoptotisk /nekrotisk celledød som antallet af annexin V-positive og Sytox grøn-positive celler.

virkningerne af resveratrol på apoptotisk celledød af OVCAR-3 celler blev undersøgt ved flowcytometri under anvendelse Sytox Green (FL1H) og Annexin V- allophycocyanin (FL4H). Behandling med 100 uM af resveratrol i 48 timer inducerede signifikant tidlig apoptotiske og sene apoptotiske /nekrotisk celledød (Fig 1B og 1C). Behandling med 30 uM af resveratrol i 48 timer inducerede også signifikant tidlig apoptotiske og sene apoptotiske /nekrotisk celledød (Fig 2A og 2B), men effekten var mindre i forhold til 100 pM.

A. Repræsentative western blotting analyser af OVCAR-3 totale cellelysater med ATG5, LC3, og P62-antistoffer. β-actin og GAPDH blev brugt som lastning kontrol. Tre udtages blev indlæst for hver behandlingsgruppe. B. Caspase 3 aktivering blev målt fra cellelysater og udtrykt som fold forandring. * P. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen køretøj, n = 4 /gruppe

Resveratrol induceret autophagy i humane ovariecancerceller

Vi har også evalueret effekten af ​​resveratrol på autofagi. Vigtige markører for autofagi blev vurderet. Som vist i fig 2C og fig 3A, resveratrol ainduced LC3-II og P62 i OVCAR-3 celler. Western blotting-analyser viste en stigning i den specifikke autophagic markør ATG5, hvilket er afgørende for autophagosome dannelse (fig 2A og 3A). Desuden blev aktiviteten af ​​caspase 3 signifikant forøget i resveratrol-behandlede OVCAR-3 celler (fig 2D og 3B).

A. OVCAR-3 celler blev behandlet med 30 pM resveratrol i 48 timer, og celledød blev bestemt ved flowcytometri. B. Kvantitativ resultat af flowcytometri. C. repræsentant western blotting analyser af OVCAR-3 af total cellelysater med ATG5, LC3, og P62 antistoffer med β-actin som lastning kontrol.

Resveratrol induceret oxidativt stress i OVCAR-3 human ovariecancer celler

Dernæst vi undersøgt, om resveratrol behandling havde nogen virkning på oxidative stress niveauer i kræftcellerne. I den første fremgangsmåde, anvendte vi en celle-permeant 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA) farvestof til at måle intracellulære ROS, og fandt, at resveratrol ved 30 uM resulterede i significantincrease i intracellulær ROS-produktion i OVCAR3 celler (Fig 4A). For yderligere at bekræfte dette resultat, vi brugte også en gratis metode til at måle den oxidative fodaftryk ved at måle HNE proteinaddukter (4-hydroxynonenal). I overensstemmelse med den intracellulære ROS data blev HNE proteinaddukter steg væsentligt i forhold til vehikelbehandlede OVCAR-celler (Fig 4B og 4C). Desuden viste vi, at resveratrol også faldt betydeligt mitokondrie elektron potentiale (Fig 4D).

A

. Intracellulær ROS of OVCAR-3 blev målt ved flowcytometri under anvendelse H

2DCFDA og udtrykt som fold-change. Resveratrol ved 30 uM induceret statistisk signifikant ROS. * P 0,05 sammenlignet med kontrol køretøj, n = 4 /gruppe.

B

. Oxidativt stress markør 4HNE modificerede proteiner blev bestemt under anvendelse af ELISA fra cellelysater af køretøjet og Resveratrol-behandlede (30 uM) OVCAR-3 celler. De kvantificerede modificerede proteiner blev udtrykt som% af køretøjets kontrolprøver. * P 0,05 sammenlignet med kontrol køretøj, n = 4 /gruppe. C. repræsentant Western blotting viser resveratrol-induceret forøgelse af HNE addukter. D. mitokondrie elektron potentiel forandring efter resveratrol behandling blev bestemt ved kvantitativ flowcytometri og immunofluorescens.

Resveratrol tilsvarende induceret apoptose og autofagi i humane ovariecancer celler Caov-3

For at afgøre, om resveratrol effekt er cellelinie specifikke, anvendte vi et andet menneske ovariecancer cellelinie Caov-3. Overensstemmelse med den effekt observeret i OVCAR-3 celler, resveratrol også induceret apoptose og autofagi i Caov-3-celler (Fig 5). Men resveratrol på samme dosis og tidsramme fremprovokere tidlig apoptose i primære humane æggestokkene overflade epitelceller HOSEpiC selv om der er lidt stige i slutningen af ​​apoptotisk /nekrotisk celledød (S1 Fig).

A. Caov-3-celler blev behandlet med 30 pM resveratrol i 72 timer, og celledød blev bestemt ved flowcytometri. B. Kvantitativ resultat af flowcytometri. C. repræsentant western blotting analyser af Caov-3 totale cellelysater med LC3 og P62-antistoffer.

Farmakologisk hæmning af autofagi svækket resveratrol-induceret celledød i OVCAR-3 celler

for at teste, om autofagi er et link til apoptotisk celledød, behandlede vi OVCAR-3 celler med chloroquin (CQ), en farmakologisk inhibitor af autofagi, før resveratrol behandling. Apoptose og celledød blev bestemt ved hjælp Sytox Green og AnnexinV-allophycocyanin. Som vist i figur 6A, celledød ved resveratrol ved 30 uM blev signifikant svækket ved forbehandling med 2 uM CQ. Resveratrol væsentligt reduceret det totale cellulære død ved autophagy hæmning. også analyseret resveratrol induceret apoptose markører caspase 3-aktivitet og PARP-aktivitet og begge blev svækket af CQ behandling (Fig 6C). Desuden observerede vi, at resveratrol-induceret autophagosome markører LC3II og P62 blev også svækket af CQ behandling (Fig 6D).

A

. Repræsentant flowcytometri dot diagrammer repræsenterer hver OVCAR-3 celler. Cellulær apoptose blev målt på samme fremgangsmåde som i fig 1. chloroquin reducerede celledræbende virkning af resveratrol. B. Kvantitativ bestemmelse af det totale celledød, der blev udtrykt som procentdelen af ​​det totale antal celler. * P 0,05 sammenlignet med kontrol køretøjet # P 0,05 sammenlignet med resveratrol-behandlede prøver. n = 4 /gruppe. C. Caspase 3 og PARP aktiviteter blev analyseret og afbildet som gange ændring. D. repræsentant western blotting analyser af OVCAR-3 totale cellelysater med LC3 og P62-antistoffer.

Inhibering af autophagy ved ATG siRNA lindres resveratrol-induceret celledød i OVCAR-3 celler

ATG5 er kendetegnende for autophagy og en central aktør i dannelsen af ​​autophagosomes. Ud over den farmakologiske inhibitor, anvendte vi en genetisk tilgang ved at vælte ATG5 ekspression ved anvendelse af en specifik siRNA og undersøgt dens virkning på resveratrol-induceret celledød. Som vist i figur 7, blev celledød ved resveratrol (30 pM) reduceret fra 27,9% til 16,22% af ATG5 siRNA. Et lignende mønster blev også observeret i caspase 3-aktivitet og LC3 western blot (Fig 7B og 7C). Effekten af ​​siRNA teknologien blev bekræftet under anvendelse Western blotting analyser, som viste en signifikant reduktion af ATG5 proteinniveauer (Fig 7a). Interessant fandt vi, at cellerne behandlet med ATG5 siRNA i kombination med Z-VAD-FMK (50 uM) er mere signifikant beskyttet mod resveratrol-induceret celledød i forhold til gruppen behandlet med enten inhibitor alene (Fig 7E). Vi ansat også nye live cell imaging-teknologi ved hjælp Cyto-ID farvestof for autophagy flux og de ovenstående resultater blev bekræftet.

A. ATG5-proteinekspression blev bestemt ud fra cellulære lysater opnået fra OVCAR-3-celler fyldt med enten kontrollere tilfældige siRNA eller ATG5 siRNA. B. Caspase 3 aktiviteter blev bestemt ud fra cellelysater opnået fra OVCAR-3 celler fyldt med enten kontrollere tilfældige siRNA eller ATG5 siRNA. Aktiviteterne blev udtrykt som fold-change. * P 0,05 sammenlignet med vehikelkontrol, # P 0,05 sammenlignet med resveratrol-behandlede prøver. n = 4 /gruppe. C. repræsentant western blotting analyser af OVCAR-3 behandlet med vehikel (Veh) eller Resveratrol ved 30 uM (RV) med og uden siATG5 og totale cellelysater var anlyzedwith LC3 og β-actin D. levende celler billede fra konfokalt mikroskop (med 20x objektiv) ved anvendelse Cyto-Id farvestof indlæst i 15 minutter efter behandling med resveratrol ved 30 pM i OVCAR-3 celler transformeret med tilfældig eller ATG5 siRNA. E. Kvantitativ bestemmelse af celledød i OVCAR celler ved anvendelse af flowcytometri. Resveratrol-induceret celledød er svækket i siATG5-behandlede og siATG5 plus Z-VAD-FMK (50 uM) behandlet OVCAR-3 celler. * P 0,05 sammenlignet med kontrol køretøjet # P 0,05 sammenlignet med resveratrol-behandlede prøver. n = 4 /gruppe.

Vi brugte levende celler for autophagic flux og caspase 3 substrat farvestof (markør for tidlig apoptose) ved hjælp af mikroskopi (Fig 8A og 8B). Det var tydeligt, at autophagic flux blev indledt tidligere (12h) end apoptose (24h), når de behandles med 30M resveratrol, som er i overensstemmelse med de nævnte ATG5 siRNA-data. Vi udførte også et tidsforløb studie med Western blot-analyser under anvendelse af to sæt prøver fra uafhængige eksperimenter på hver tidspunkter (fig 8C) og fandt, at autofagi blev aktiveret tidligere end apoptose, hvilket antyder at autofagi er opstrøms for apoptose i ovariecancerceller behandlet med resveratrol. Men der er overlapning mellem de to processer, som er et typisk mønster af enhver kræft cellepopulation.

A. Levende celler ved konfokal mikroskopi (med 10X objektiv) med Cyto-ID farvestof i OVCAR-3-celler behandlet med 30 pM resveratrol ved 0, 12, 24 og 48 timers tidspunkter. B. Levende cell imaging ved konfokal mikroskopi (med 10X objektiv) med caspase 3 grønne afsløring farvestof i OVCAR-3 celler ved 0, 12, 24 og 48 timer tidspunkter. C. OVCAR-3 celler blev behandlet med 30 pM af resveratrol i 12 timer, 24 timer og 48 timer. Western blotting af totale cellelysater blev udført med anti-ATG5-ATG12, LC3, og caspase 3-antistoffer. Ingen spaltning af ATG5 blev observeret. De viste resultater repræsenterer et eksperiment, hvori hvert tidspunkt af behandlingen blev duplikeret.

Discussion

I denne undersøgelse demonstrerede vi, at resveratrol-induceret celledød i human ovariecancer celler blev medieret af både apoptose og autofagi. Resveratrol induceret signifikant intracellulære ROS generation og oxidativt stress i kræftceller, hvilket resulterede i indledningen af ​​celledød vej. De kendetegnende for autophagy, LC3 og ATG5, blev begge opreguleret i resveratrol-behandlede cancerceller. Vi har også vist, at farmakologisk inhibering af autophagy af chloroquin svækkede resveratrol-induceret celledød i OVCAR-3, og lignende resultater blev opnået ved at blokere ATG5 ekspression under anvendelse siRNA.

Adskillige nyere undersøgelser har vist nogle spændende veje, der medierer resveratrol-induceret apoptotisk celledød. Vergara et al. beskrev den rolle ERK-signalering og AKT /GSK veje i apoptotisk celledød under anvendelse af en proteomisk tilgang [10]. I en anden elegant studie, Lin et al. viste, at resveratrol-induceret apoptose delte lignende veje med ceramid-induceret COX-2-afhængig apoptose i ovariecancerceller [8]. ere, vi har vist, at den apoptotiske celledød af OVCAR-3 induceret af resveratrol er langt mere kompleks og autofagi spiller en kritisk rolle i denne proces.

En af vores centrale bemærkninger var produktionen af ​​intracellulær ROS og oxidativt stress i resveratrol-induceret celledød i OVCAR-3 celler. ROS er involveret i modulering af forskellige veje, herunder ERK signalvejen [14-16]. Interessant ROS kunne inducere autofagi i resveratrol-behandlede OVCAR-3 celler [17]. Resveratrol er kendt for at have gavnlige antioxiderende virkning på sunde celler [18], men disse antioxidant aktiviteter har forskellige konsekvenser i stærkt prolifererende cancerceller. Antioxidanter, herunder resveratrol, har vist sig at bidrage til ROS-induceret celledød i andre cancer celletyper [19, 20]. Vore data antyder, at ROS-produktion ved resveratrol i OVCAR-3 celler er associeret med cancer celle apoptose, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne opnået i tidligere undersøgelser fokuseret på kolorektale og coloncarcinomceller.

Generelt autofagi hæmmer induktion af apoptose, og apoptose-associeret caspaseaktivering slukker autofagi processen. Men der er mange tilfælde, hvor begge disse processer forekomme samtidigt eller co-aktiverer til ROS produktion induceret både autofagi og apoptose i cancerceller [21]. Autophagy selv kan inducere celledød, en proces kendt som autophagic celledød [22]. Det er også blevet rapporteret, at induktion af autofagi letter aktivering af apoptose [23]. Puissant et al fandt, at både autofagi og apoptose er involveret i resveratrol-induceret celledød i en myeloid leukæmi-cellelinje [24-26]. I MCF7 brystcancerceller, resveratrol induceret beclin-1 afhængig og uafhængig autofagi [27] .Her vi også observeret både caspase eksisterer afhængige og uafhængige vej for resveratrol-induceret celledød i ovariecancerceller. Enten caspase eller autofagi hæmmere var ude af stand til at genoprette resveratrol celledød. Et af de vigtigste proteiner involveret i denne proces er den tumorsuppressorproteinet p53 og dets proteinniveauer i cytosolen modulere aktivering eller inhibering af autofagi [28, 29]. Nuklear translokation af p53 er også vigtig for apoptotisk induktion. Det er blevet påvist, at p53 er afgørende for resveratrol-medieret celledød i OVCAR-3 celler [8]. Andre almindelige mediatorer af både autofagi og apoptose er flere BH3-only (BCL-3 homologi 3) proteiner. Under apoptose, BH3-only proteiner interagerer direkte med BCL-2-familien, hvorved silencing anti-apoptotiske rolle og stimulere apoptose. Adskillige BH3-kun proteiner, såsom BAD og BNIP3 kan også fremme autophagy ved kompetitiv hæmning mellem Beclin1 og apoptotiske proteiner BCL-2 [30-32]. Interessant nok har både BCL2 og Bad vist sig at blive dysreguleret i OVCAR-3 celler [8].

Inddragelsen P62 i resveratrol-induceret celledød i leukæmicellelinje er kritisk [25]. Vi har også observeret induktion af P62 i ovariecancerceller som respons på resveratrol behandling.

I vores undersøgelse fandt vi, at inhibering af autofagi dæmper (men ikke ophæver fuldstændig) resveratrol-induceret ovariecancer celledød. Vi udførte også et tidsforløb undersøgelse og fandt, at resveratrol aktiverer autofagi tidligere end apoptose, hvilket antyder at autofagi er opstrøms for apoptose. Tilsammen udgør disse data understøtter, at resveratrol inducerer apoptose delvist gennem autofagi. Vi er enige om nogle mere klassiske mekanismer sandsynligt er også involveret i resveratrol induceret apoptose.

Autophagy er en afgørende overlevelse mekanisme til kræftceller under strenge betingelser for at opfylde deres ernæringsbehov. Samtidig inhibering af autophagy under anti-cancer terapi er gavnlig i urologisk cancer [33]. I denne undersøgelse, brugte vi det sene stadie autophagy inhibitor chloroquin og fandt, at autofagi medierer OVCAR-3 celledød induceret af resveratrol, som blev bekræftet ved transfektion af en siRNA mod ATG5. Vore data antyder, at det ikke ville være gavnligt at behandle kræft i æggestokkene med en autofagi inhibitor udover resveratrol. Kombination af resveratrol med en autofagi trigger ville muligvis øge anticancervirkning. Dette ville være et interessant og vigtigt emne værd yderligere undersøgelse. Vigtigere, tidligere undersøgelser i esophageal pladecellecarcinom demonstrerede den modsatte virkning ved inhibering af autofagi i resveratrol-induceret celledød [34]. Dette kan være delvist skyldes de forskellige doser og typer af kræftceller, der anvendes i denne undersøgelse, og autofagi er en kompleks proces, der fungerer som et tveægget sværd, når udnyttes som en måde at bekæmpe kræft [35-39].

Støtte Information

S1 fig. Resveratrol ikke inducere apoptose hos raske ovariale overflade epitelceller.

Flowcytometrisk analyse af humant Ovarian Surface epithelceller (HOSEpiC) -celler, der er dyrket med æggestokkene epitelcelle Medium leveres fra producenten (ScienCell Research Laboratories). Resveratrol behandling blev udført ved 100 uM i 48 timer. Cellerne blev derefter farvet med AnnexinV og sytox grøn for tidlig apoptose og sen apoptose /nekrotiske celle død markører hhv. Kvantitativ bestemmelse af flowcytometri data viste ingen signifikant forskel i tidlige apoptic celledød markører men lidt betydelig stigning i slutningen apoptose /nekrotiske celledød markører. * P 0,05 sammenlignet med kontrol køretøjet n = 3 /gruppe

doi:. 10,1371 /journal.pone.0129196.s001

(TIFF)