PLoS ONE: Den ikke-kodende RNA Expression og effekten af ​​lncRNA AK126698 om cisplatin Modstand i ikke-småcellet lungekræft Cell

Abstrakt

Baggrund

Effekten af ​​cisplatin kemoterapi i ikke-småcellet lungecancer er begrænset af den erhvervede lægemiddelresistens. Identifikation RNA’erne relation til cisplatin resistens kan bidrage til at forbedre de kliniske responsrater.

Metoder

Microarray udtryk profilering af mRNA, lncRNA og miRNA blev foretaget i A549 celler og cisplatin resistente A549 /CDDP celler . Differentielt udtrykte mRNA, lncRNAs og miRNA, verificeret af realtime RT-PCR, blev udsat for pathway analyse. Ekspression af NKD2 og β-catenin blev vurderet ved realtime RT-PCR og Western blot-analyse. Effekten af ​​lncRNA AK126698 på cisplatin-induceret apoptose blev undersøgt ved annexin-V /PI flowcytometri.

Resultater

I alt 1471 mRNA, 1380 lncRNAs og 25 miRNA udtrykkes forskelligt i A549 /CDDP og A549-celler. Blandt dem, blev 8 mRNA’er, 8 lncRNAs og 5 miRNA differentielt udtrykt i gen-chip-analyse valideret. High-berigelse pathway analyse identificeret, at nogle klassiske veje deltog i proliferation, differentiering, undgåelse af apoptose, og lægemiddelmetabolisme blev forskelligt til udtryk i disse cellelinjer. Gene co-ekspression netværk identificeret mange gener som FN1, CTSB, EGFR, og NKD2; lncRNAs herunder BX648420, ENST00000366408, og AK126698; og miRNA såsom miR-26a og lad-7i potentielt spillet en central rolle i cisplatin modstand. Blandt som blev den kanoniske Wnt vej undersøgt, fordi det viste sig at blive ramt af både lncRNAs og miRNA herunder lncRNA AK126698. Knockdown lncRNA AK126698 ikke blot i høj grad faldet NKD2 som kan have en negativ regulere Wnt /β-catenin signalering, men også øget ophobning og nuklear translokation af β-catenin, og betydeligt deprimeret apoptose sats induceret af cisplatin i A549 celler.

Konklusion

Cisplatin modstand i ikke-småcellet kræftceller kan vedrøre ændringer i ikke-kodende RNA. Blandt disse, AK126698 synes at tillægge cisplatin modstand ved at målrette den Wnt vej

Henvisning:. Yang Y, Li H, Hou S, Hu B, Liu J, Wang J (2013) Den ikke-kodende RNA Expression Profile og Effekt af lncRNA AK126698 om cisplatin Modstand i ikke-småcellet lungekræft Cell. PLoS ONE 8 (5): e65309. doi: 10,1371 /journal.pone.0065309

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: August 7, 2012; Accepteret: April 29, 2013; Udgivet: 31. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af Natural Science Foundation of China (nr 81.071.910, 81.070.042). LncRNA microarray eksperimenter blev udført af KangChen Bio-tech, Shanghai, Kina. Mirna microarray eksperimenter blev udført af Genminix Informatik Ltd, Shanghai, Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. LncRNA microarray eksperimenter blev udført af KangChen Bio-tech, Shanghai, Kina. Mirna microarray eksperimenter blev udført af Genminix Informatik Ltd, Shanghai, Kina. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige menneskelige kræftformer verdensplan og fortsætter med at være forbundet med den højeste forekomst og dødelighed af alle kræftformer [1], [2]. Ifølge WHO GLOBOCAN projektet, 1,6 millioner nye tilfælde af lungekræft, der tegner sig for 12,7% af verdens samlede kræftforekomst, blev diagnosticeret i 2008 [3]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 85% af alle tilfælde lungekræft [4]. Den mest effektive behandling for NSCLC er komplet lunge resektion. Men overlevelsesraten efter fuldstændig lunge resektion er langt fra tilfredsstillende, og de fleste patienter får tilbudt kemoterapi som et alternativ, især cisplatin (CDDP; cis-diammindichlorplatin II) -baseret kemoterapi

Cisplatin primært virker ved at forårsage DNA. beskadigelse [5]. Men evne kræftceller til at blive resistente over for CDDP fortsat en væsentlig hindring for en vellykket kemoterapi. Tidligere undersøgelser har foreslået en række potentielle mekanismer cisplatin modstand [6]. Men der er et løbende behov for at lokalisere de nøjagtige mekanismer for at finde nye mål for at forhindre resistens.

Den hurtige udvikling af molekylær biologi gør det muligt at påvise molekylære forskelle mellem forskellige celler. Denne tilgang kan give vigtige fingerpeg om resistens. Forståelse af forholdet mellem cisplatin modstand og molekylære ændringer vil bidrage til at forudsige cisplatin modstand på forhånd og at forbedre effektiviteten af ​​terapeutisk intervention.

Den menneskelige transkriptom omfatter et stort antal af protein-kodende messenger RNA’er (mRNA’er) tillige med et stort sæt proteinsk kodning udskrifter herunder lange ikke-kodende RNA og microRNA, der har strukturelle, lovgivningsmæssige eller ukendte funktioner [7], [8]. Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs), der er kendetegnet ved den kompleksitet og mangfoldighed i deres sekvenser og virkningsmekanismer adskiller sig fra små RNA eller strukturelle RNA’er og menes at fungere som enten primære eller splejsede udskrifter [9]. Ændrede lncRNA niveauer er blevet vist at resultere i afvigende ekspression af genprodukter, der kan bidrage til forskellige sygdomstilstande, herunder cancer [10], [11]. Men den samlede patofysiologiske bidrag lncRNAs til cisplatin modstand forbliver stort set ukendt.

MikroRNA’er (miRNA) er en familie af ~22nt små, ikke-kodning, endogene, enkeltstrengede RNA, der regulerer genekspression. Modne miRNA og Argonaute (siden) proteiner danner RNA-inducerede silencing kompleks (RISC), som medierer post-transkriptionel gendæmpning gennem induktion af mRNA nedbrydning eller translationel inhibering [12]. Nogle miRNA var blevet fundet spiller vigtig rolle i cisplatin resistens [13], [14], men mere forskning er nødvendig for at udforske forholdet mellem miRNA, lncRNAs og mRNA i kræft biologi processen.

Wnt /β catenin kanoniske signalvej er tidligere anset for at spille en central rolle i at bestemme celleskæbne [15]. har nu vist sig Wnt-vejen, der skal ændres i mange typer af cancer [16]. Efter binding af Wnt til dets receptor, Dishevelled proteiner (Dsh /DVL) bliver aktiveret, hvilket fører til inaktivering af axin /adenomatøs polypose coli (APC) /glycogensyntasekinase (GSK) 3β kompleks, der forhindrer nedbrydningen af ​​β-catenin [ ,,,0],17]. Dette resulterer i stabiliserede β-catenin, der omplantes til kernen, hvor den binder til medlemmer af T-celle faktor /lymfoid enhancer-bindende faktor (TCF /LEF) familien af ​​transkriptionelle faktorer, og er i stand til at modulere ekspressionen af ​​en bred vifte af målgener at regulere celleskæbner.

Wnt-β-catenin pathway [18], er præcist styret af en række regulatorer. Blandt dem, den nøgne neglebånd (NKD) familie omfatter Drosophila nøgen neglebånd og dens to hvirveldyr ortologer NKD1 og NKD2 har vist sig at negativt regulere kanoniske Wnt signalering ved binding til Dvl. Men om Wnt-vejen er involveret i cisplatin modstand eller dens regulering er stadig ukendt.

I denne undersøgelse blev lncRNA, miRNA og mRNA udtryk profiler sammenlignet i vildtype A549 og cisplatin modstand cellelinjer A549 /CDDP hjælp Gene Chip teknologi. En integrativ analyse kombinerer ændringer i de tre grupper af RNA inden for forskellige genetiske netværk blev brugt til at identificere gener og veje, der kan relateres til cisplatin modstand i NSCLC. Forsøg med lncRNA AK126698 knockdown blev brugt til at observere dens indvirkning på de kanoniske Wnt pathway og celle reaktioner på cisplatin.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig lunge adenocarcinom cellelinje A549 og cisplatin-resistent variant cellelinje A549 /CDDP blev købt fra Peking Union Medical College, Beijing, Kina. A549 og A549 /CDDP-celler blev holdt i RPMI-1640-medium (Life Technologies) suppleret med 10% føtalt kalveserum (Gibco, Gran Island, NY, USA) i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C . Den A549 /CDDP cellemedium indeholdt yderligere 2 mg /l cisplatin for at bevare sin multiresistent fænotype. Celler i den logaritmiske vækstfase blev anvendt til alle forsøg.

LncRNA microarray

Kort fortalt blev A549 og A549 /CDDP-celler anvendt til at syntetisere dobbeltstrenget komplementær DNA (cDNA). Dobbeltstrenget cDNA blev mærket og hybridiseret til 8 × 60 K LncRNA Expression Microarray (Arraystar, Rockville, MD). Den lncRNA ekspression mikroarray anvendt i denne undersøgelse primært klassificerer prober som følgende subtype: 1). Enhancer LncRNAs: Indeholder profilering data for alle LncRNAs med forstærker-lignende funktion [19]. 2). Rinn lincRNAs: Indeholder profilering data for alle lincRNAs baseret på John Rinn papirer [20], [21]. 3). HOX klynge: Indeholder profilering data for alle sonder i fire HOX loci, rettet 407 diskrete transskriberede regioner, lncRNAs og kodning udskrifter [22]. 4). LincRNAs nærheden kodning gen: indeholder differentielt udtrykte lincRNAs og nærliggende kodning genpar (distance 300 kb). 5). Enhancer LncRNAs nærheden kodning gen: Indeholder differentielt udtrykte forstærker-lignende LncRNAs og deres nærliggende kodning gener (distance 300 kb). Efter hybridisering og vask, blev behandlet dias scannet med Agilent mikromatrice Scanner (varenummer G2505B). Agilent Feature Extraction software (version 10.7.3.1) blev anvendt til at analysere erhvervede array-billeder. Fraktil normalisering og efterfølgende databehandling blev udført med hjælp af GeneSpring GX v11.5.1 softwarepakke (Agilent Technologies). Hver cellelinje udført lncRNA microarray tredobbelt.

miRNA microarray

Microarray profilering for miRNA blev udført ved hjælp af Affymetrix GeneChip miRNA arrays (Santa Clara, CA, USA) i henhold til producentens anbefalede protokol. Kort fortalt blev 1 ug totalt RNA fra cellerne mærket med polyA-polymerase under anvendelse af Genisphere FlashTag HSR kit ifølge producentens anbefalinger (Genisphere, Hatfield, PA). RNA blev hybridiseret til Affymetrix miRNA array som anbefalet af leverandøren. Standard Affymetrix matrix kassette farvning, vask og scanning blev udført under anvendelse af post-hybridisering kit (# 900.720, Affymetrix) og GeneChip Scanner 3000. Feature ekstraktion blev udført under anvendelse Affymetrix kommandokonsollen software. De rå data blev behandlet i følgende rækkefølge: detektering baggrund blev efterfulgt af RMA global baggrund korrelation, fraktil normalisering, median estimering og log2-transformation ved hjælp af miRNA QC softwareværktøj (Affymetrix). Hver cellelinie udføres miRNA microarray tredobbelt.

In vitro lægemiddelfølsomhed assay

Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd og inkuberet natten over ved 37 ° C. Cellerne blev inkuberet med forskellige koncentrationer af cisplatin i 48 timer ved 37 ° C. Efter tilsætning af 20 pi CellTiter 96R vandige opløsning (Promega) til hver brønd blev pladerne inkuberet i 2,5 timer ved 37 ° C. Absorbansen af ​​hver brønd ved 490 nm (A490) blev aflæst med et spektrofotometer. Den koncentration, hvor hvert medikament producerede 50% inhibering af vækst (IC50) blev estimeret ud fra de relative overlevelseskurver. Tre uafhængige forsøg blev udført i seks dobbelte brønde.

Realtime RT-PCR

Real-time RT-PCR blev anvendt til at verificere differentieret udtryk af 16 gener, der blev opdaget af LncRNA Expression Microarray. CDNA’et blev syntetiseret under anvendelse af revers transkriptase (Takara), oligo (dT) primere med 1 ug RNA fra de samme prøver som dem der bruges i mikroarrayet. De anvendte primere er anført i tabel S1. Hver real-time RT-PCR-reaktion (i 20 pi) indeholdt 2,5 x SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TIANGEN), 0,5 uM primere og 0,5 pi af template cDNA. Cykliseringsbetingelserne bestod af en indledende, enkelt cyklus af 2 minutter ved 94 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder ved 94 ° C, 20 s ved 63 ° C og 30 sekunder ved 68 ° C. PCR-amplifikationer blev udført i tre kopier for hver prøve. Genekspressionsniveauer blev kvantificeret i forhold til ekspression af 18S under anvendelse af en optimeret komparativ Ct (ΔΔCt) metoden. Forskellene i genekspression niveauer mellem grupper blev sammenlignet ved anvendelse af t-test. P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

QRT-PCR af miRNA

Bulge-loop ™ miRNA QRT-PCR-primersæt (en RT-primer og et par qPCR primere for hver. sæt) specifikt for miR-17, miR-21, miR-138, miR-194, og miR-lad-7i tegnet af RiboBio (Guangzhou, Kina). Kort fortalt blev det totale RNA ekstraheret under anvendelse af en MiRNeasy Mini Kit (QIAGEN). Den miRNA bule-loop blev revers transkriberet med Quantscript RT Kit (TIANGEN). Hver real-time RT-PCR-reaktion (i 25 pi) indeholdt 2 × SuperReal Premix (TIANGEN), 10 uM primere, og 1 pi af template cDNA. Cykliseringsbetingelserne bestod af en indledende, enkelt cyklus af 3 minutter ved 95 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 10 sekunder ved 95 ° C, 20 s ved 60 ° C og 30 sekunder ved 70 ° C. PCR-amplifikationer blev udført i tre kopier for hver prøve. Den relative mængde af miRNA blev normaliseret mod U6 snRNA, og folden ændring for hver miRNA blev beregnet af 2

-ΔΔCt metode. P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Små interfererende RNA (siRNA)

For at estimere hæmning af AK126698, 50 nM AK126698 siRNA (Shanghai Genepharma, Kina) blev transficeret i A549. celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens ifølge producentens anvisninger. Celler transficeret med transfektion middel og scramble-kontrol siRNA (negativ kontrol) blev anvendt som kontroller. Cellerne blev høstet 48 timer efter transfektion. Fire par siRNA blev navngivet siRNA AK126698-291, siRNA AK126698-341, siRNA AK126698-424 og siRNA AK126698-1492 hhv. Sammenlignet med kontrol, kun siRNA siRNA AK126698-291 og AK126698-424 held formindske ekspressionsniveauet af lncRNA AK126698. Sekvenserne af AK126698 siRNA og scramble kontrol siRNA er anført i tabel S2.

Western blot-analyse

A549-celler blev udpladet i plader med 6 brønde (2 x 10

5 celler /brønd ). 48 timer efter transfektion af AK126698 siRNA eller negativ kontrol blev cellerne høstet og homogeniseret med lysisbuffer. Totalt protein blev separeret ved denaturerende 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Detektion blev udført med Odyssey-system (Gene Company Limited, USA). De primære antistoffer til β-catenin, phospho-β-catenin (Ser675) og β-actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology, Cell Signaling Technology og Sigma-Aldrich, hhv. De primære antistoffer til Celle cyklus pathway phospho-cdc2 (Tyr15), phospho-Rb (ser807), phospho-Chk2 (Thr68) og phospho-p53 (ser15) og for MAPK signalvejen phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) og phospho-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) blev købt fra cellesignalering Technology. Antistof-fortyndinger blev 1:2000 for β-catenin, 1:1000 for phospho-β-catenin, 1:1000 for phospho-Rb (ser807), 1:1000 for phospho-Chk2 (Thr68), 1:1000 for phospho-cdc2 (Tyr15), 1:200 for phospho-p53 (ser15), 1:200 for phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), 1:200 for phospho-p44 /42 MAPK (ERK1 /2-) (Thr202 /Tyr204) og 1:5000 for β-actin. Proteinniveauer blev normaliseret for p-actin og ændringer blev bestemt.

flowcytometri

Celler blev udpladet i 6-brønds plader (2 × 10

5 celler /brønd). 24 timer efter transfektion af siRNA AK126698 som beskrevet ovenfor, blev A549-celler behandlet af CDDP i en slutkoncentration på 10 mg /l. 24 timer efter behandling af CDDP, flowcytometri blev anvendt til at detektere apoptose af de transficerede A549-celler ved at bestemme den relative mængde af Annexin V-FITC-positiv-PI-negative celler.

Dataanalyse

Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Numeriske data blev præsenteret som midler og standardfejl (± SEM). Forskelle mellem organer blev analyseret ved anvendelse af Students t-test. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse SPSS11.0 software (Chicago, IL).

Signifikant Differential Gene Analysis.

Den tilfældige variansanalysemodel (RVM) t-test blev anvendt til at identificere differentielt udtrykte gener for kontrol og eksperimentere gruppe. Denne model har mere magt end standard tests for at hente store ændringer i udtryk, uden at øge antallet af falske positive [23]. Efter den betydelige analyse og falsk opdagelse sats (FDR) analyse, valgte vi de differentielt udtrykte gener efter foruddefinerede P-tærskelværdier ( 0,05) [23], [24], [25]. Resultaterne af differentielt udtrykte gener blev underkastet ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse (Cluster 3,0) og TreeView analyse (Stanford University, Stanford, CA, USA).

miRNA mål forudsigelse.

Mål mRNA’er af miRNA blev forudsagt på grundlag Targetscan (https://www.targetscan.org/) version 5.2. Targetscan forudsiger biologiske mål af miRNA ved at søge efter tilstedeværelsen af ​​konserverede 8mer og 7mer websteder, der passer frøet region af hver miRNA [26]. Også identificeret er websteder med uoverensstemmelser i frøet region, der kompenseres ved bevaret 3 “parring [27]. I pattedyr, er forudsigelser rangeret baseret på den forudsagte effekt af at målrette som beregnet ved hjælp af kontekst + snesevis af de websteder alignments [28], [29]. TargetScanHuman mener kampe at anmærke menneskelige UTR’er og deres ortologer, som defineret ved UCSC hel-genom alignments. Bevaret målretning er også blevet påvist i åbne læserammer (ORF’er).

Pathway analyse.

Pathway analyse blev anvendt til at identificere væsentlige veje for den differentierede gener henhold til Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer , Biocarta og Reatome databaser. Vi brugte også Fishers eksakte og chi-square test for at vælge betydelige veje. Tærsklen på signifikans blev defineret ved P-værdi og FDR. Den berigelse Re blev givet ved: (R

e = BERIGELSE), hvor er antallet af differentierede gener i den særlige kategori, er det samlede antal gener inden for samme kategori, er antallet af differentierede gener i hele microarray , og er det samlede antal gener i microarray [30], [31], [32].

GeneRelNet (Co-ekspression netværk).

Gene coekspression net blev anvendt til at identificere gen interaktioner [33]. Gene coekspression netværk blev bygget efter det normaliserede signal intensitet af specifikke udtryk gener. For hvert par af gener, vi beregnet Pearson korrelationskoefficienten og vælge signifikant korrelation par at konstruere netværk [34].

Inden for netværket analyse, graden af ​​genet centrale defineret som antallet af links fra én node til en anden, blev anvendt til at bestemme dets relative betydning [35]. K-kerner blev anvendt til graf topologi analyse. K-kerne af et netværk var et undernetværk hvor alle knuder var forbundet til mindst ‘K’ andre gener i undernetværk. Inden for en protein-protein interaktion, k-basisnet indeholder normalt sammenhængende grupper af proteiner [35], [36].

Resultater

Microarray af A549 og A549 /CDDP cellelinjer

først cisplatin-resistens af A549 /CDDP cellelinien blev identificeret ved at evaluere IC50-værdien af ​​A549 /CDDP mod vild A549-cellelinje. Som vist i figur 1A, IC50 for cisplatin for lægemiddel-resistente A549 /CDDP cellelinie var 17,06 ± 0,68 mg /L, som var 3,9 gange højere end for vildtype A549-cellelinje (4,36 ± 0,78 mg /l). Dette resultat viste, at de A549 /CDDP-celler var mere resistente over for cisplatin end vild type celler. Salg

Celler blev behandlet med stigende koncentrationer af cisplatin (0,5 mg /l til 128 mg /l). 48 timer senere blev cellelevedygtighed målt ved MTS (A). Heat kort viser lncRNA (B), mRNA (C) og miRNA (D) profiler, der adskiller A549 /CDDP fra A549. Hver prøve blev analyseret tre gange. Både nedreguleres (grøn) og opreguleret (rød) RNA’er blev identificeret i A549.

Så et gen chip blev udført i disse to cellelinjer til at undersøge de mulige RNA-ekspression ændringer i cisplatin modstand i lunge adenokarcinomceller vha Arraystar sonden datasæt som omfattede 33,045 lncRNAs og 30,215 kodning udskrifter. Hierarkisk klyngedannelse viste systematiske variationer i ekspressionen af ​​lncRNAs og protein-kodende RNA’er mellem de to cellelinier (figur 1B og 1C). Sammenlignet med A549-cellelinje, 725 prober med lncRNAs steg og 655 prober faldt i A549 /CDDP cellelinie. Desuden blev 625 mRNA differential probe stiger og 846 mRNA-probe fald findes i A549 /CDDP cellelinje.

For at undersøge om den microRNA ekspression blev ændret i cisplatin-resistente celler, blev miRNA udtryk profiler vurderet ved hjælp af Affymetrix miRNA gen-chip, som indeholdt 1.105 pre-miRNA og 1.105 modne-miRNA sonder. For yderligere analyse fokuserede vi på moden-miRNA. Resultaterne viste, at i A549 /CDDP-celler, 16 miRNA nedreguleres og 9 miRNA opreguleret i sammenligning med A549-cellelinien (P 0,05; figur 1 D). De microarray data omtales i denne artikel er blevet deponeret i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) og er tilgængelige gennem (GEO) Serie tiltrædelse nummer GSE43494 (https://www.ncbi.nim.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE43494).

Validering af microarray data ved hjælp af qPCR

for at validere resultaterne microarray analyse, ekspressionsniveauet af 8 mRNA, som menes at spiller en vigtig rolle i lægemiddelresistens og 8 lncRNAs som havde korrelationer med forhenværende mRNA’er blandt den differentielle ekspression RNA’er, blev analyseret under anvendelse kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR). For lncRNA, viste resultaterne, at AK123263, CES1P1-001, RP3-508I15.14, AK126698, TP53TG1, og AC090952.4.1 faldt, mens uc003bgl.1 og NCRNA00210 steg i A549 /CDDP (alle P 0,05, figur 2A) . For mRNA ekspressionen af ​​BMP4, CTSB, NKD2, BAG1, TGFB1, EGFR, Jun og CUL2 viste statistisk signifikante forskelle mellem de to cellelinier (P 0,05; Figur 2B). Alle QRT-PCR-resultater ovenfor stemte overens med mikroarrayet. Disse resultater indikerer, at et sæt af lncRNAs og mRNA’er aberrant udtrykt i cisplatin modstand cellelinier.

Den relative mængde af hvert mRNA (A) og lncRNA (B) blev normaliseret til 18S rRNA, og hver miRNA (C ) blev normaliseret til U6 snRNA. Data i histogrammer er middel ± SD, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 sammenlignet med A549 (t-test)

5 miRNA blandt dem filtreret blev valideret til. være signifikant forskellig mellem cisplatin resistente cellelinje A549 /CDDP og den parentale A549 cellelinien (P 0,05). Som vist i (figur 2C), niveauerne af MIR-17, MIR-21, og MIR-Lad-7i blev nedreguleret i A549 snarere end A549 /CDDP, mens MIR-138 og MIR-194-ekspression var op- reguleret. Dette fund er i overensstemmelse med resultaterne af microarray hybridisering.

Microarray-baserede pathway analyse

Væsentlige veje for differentierede gener blev sammenlignet med Kegg databasen til yderligere at specificere og identificere mål mRNA blandt de 1471 identificerede gener. Disse gener er vist i figur 3A og 3B. Den høje berigelse veje er omfattet af overudtrykte mRNA var involveret i aminoacyl-tRNA biosyntese, DNA-replikation og protein forarbejdning i endoplasmatiske reticulum. I modsætning hertil signifikante veje svarende til underexpressed mRNA’er syntes at være ansvarlig for lægemiddelmetabolisme, antigen-processering og præsentation og cytokin-cytokin-receptor-interaktioner. Blandt disse, de maksimale-berigede-veje vedrørende spredning og lægemiddelmetabolisme foreslog en rolle i cisplatin modstand.

signalveje af differentielt udtrykte opreguleres mRNA (A) og nedreguleret mRNA (B). Western blot analyse af MAPK-vejen (C) og Cell cyklus pathway (D) niveauer i A549-celler og A549 /CDDP-celler. P-p44 /42 MAPK, fosfor-p44 /42 MAPK; P-SAPK /JNK, fosfor-SAPK /JNK; P-cdc2, fosfor-cdc2; P-Rb, fosfor-Rb; P-Chk2, fosfor-Chk2; P-p53, fosfor-p53. Signalveje på skæringspunktet mellem forskelligt udtrykte mRNA’er og forudsagte målgener fra forskelligt udtrykt opreguleres mRNA’er (E) og nedreguleret mRNA’er (F). Pathway analyse blev overvejende baseret på Kegg databasen. P-værdier 0,05 anvendelse af to-sidet Fishers eksakte test blev klassificeret som værende statistisk signifikant. Den lodrette akse repræsenterer vejen kategori og den vandrette akse repræsenterer -log10 (p-værdi) af disse væsentlige veje.

Cell cyklus og MAPK signalvej blev valgte at kontrollere rigtigheden af ​​de sti analyseresultater . Sammenlignet med A549 celler, de vigtigste faktorer i Celle cyklus phospho-cdc2 (Tyr15) og phospho-Rb (ser807 /811) steg i proteinniveauet i A549 /CDDP celler repræsenterer opregulering af Cell cyklus vej. Den faldt af cdc2 negativ regulator phospho-Chk2 (Thr68) og phospho-p53 (ser15) forstærket dette resultat. Også den phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) og phospho-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204), som er de vigtigste faktorer i MAPK signalvejen, faldt i A549 /CDDP cellelinje. Og disse resultater er anført i figur 3C og 3D.

De mål mRNA for differentielt udtrykte miRNA blev forudsagt ved hjælp Targetscan (https://www.targetscan.org/), og 7,814 relationer mellem dem blev observeret (Tabel S3) . Skæringspunktet sat for de forudsagte target mRNA’er og differentielt udtrykte mRNA’er ovennævnte blev valgt. 497 relationer tilbage efter dette trin, som vist i tabel S4. Betydelige veje for disse gener (P 0,05) menes at være reguleret af miRNA ifølge Kegg databasen blev analyseret (figur 3E og 3F). De væsentlige veje inkluderet Wnt signalvejen, transkriptionel fejlagtig regulering i kræft og insulin signalveje.

Vi screenede ud 21 differentielt udtrykte mRNA i cisplatin modstand celler (tabel S5), der var negativt korreleret og eventuelt reguleret af miRNA. Disse mRNA var involveret i 11 af de veje, der blev anset for at spille vigtig rolle i cisplatin modstand.

Etablering af gen co-ekspression netværk

Pearson korrelationskoefficienter blev estimeret for hvert gen og betydelig korrelation par blev fusioneret med miRNA at undersøge lncRNA, miRNA og mRNA co-udtryk. Netværk analyse blev foretaget for at undersøge hvilke gen eller gener spiller en central rolle i cisplatin modstand (figur 4). Gene netværk blev konstrueret ud fra funktionelt gen foreninger, og er beskrevet i detaljer i tabel S6. mRNA, der interagerer med både lncRNAs og miRNA blev understreget med gul farve. I netværket diagrammer, cyklus noder repræsenterer gener, og kanterne mellem to knuder repræsenterer interaktioner mellem gener kvantificeret ved grad. Grader i netværket beskriver antallet af enkelte gener, der regulerer andre gener og repræsenterer størrelsen af ​​cyklus node. Jo højere grad, jo mere centrale genet er inden for netværket. Kanterne mellem to knudepunkter blev forbundet ved forskellige mekanismer. LncRNA-mRNA blev forudsagt af korrelationsanalyse for at tabe af effektiv forklaring på nuværende tidspunkt. miRNA-mRNA blev forudsagt af Targetscan som er den mest udbredte metode til high throughput microRNA data mål forudsigelse. mRNA-mRNA blev bestemt baseret på Kegg for mange mRNA relationer var blevet indsamlet her. LncRNA-lncRNA og miRNA-miRNA blev ikke vist for de er meningsløse. LncRNA-miRNA kan ikke beregnes begrænset af database og teknik.

LncRNA-miRNA-mRNA-netværk af A549 (A) og A549 /CDDP (B). Blå repræsenterer nedregulering og orange udgør op regulering. Box noder repræsenterer microRNA, cirkel noder repræsenterer mRNA, og sekskant noder repræsenterer lncRNA. Sorte kanter beskrive den mulige sammenhæng mellem lncRNA og mRNA, grønne kanter beskriver inhiberende effekt af microRNA på mRNA, og røde kanter repræsenterer forholdet mellem mRNA og mRNA.

Clustering koefficienter blev brugt til at estimere kompleksiteten af samspil mellem gener der grænser op til kernen gen, med undtagelse af kernen gen deltagelse. Jo lavere clustering koefficient, desto mere uafhængig af de centrale gener blev udtrykt i interaktioner mellem gener i tilstødende kerner [35]. Resultaterne indikerede, at mange gener som FN1, CTSB, EGFR, og TGFB1; lncRNAs herunder BX648420, ENST00000366408, og ENST00000404247; og miRNA såsom miR-26a og lad-7i potentielt spillet en central rolle i netværket. I undernet, blev mange isolerede mRNA’er associeret med Wnt signalvejen. De var kandidater til de kan have en væsentlig rolle i cisplatin modstand reguleret af lncRNAs.

Netværket analyseresultater foreslog, at mRNA kan co-reguleret af forskellige lncRNAs sammen med forskellige miRNA. For eksempel kan BAG1 reguleres ved 3 miRNA og 3 lncRNAs samtidig. Dette fænomen kan forklare, hvorfor nogle mRNA forudsagt som potentielle miRNA mål ikke ændre sig med den modsatte retning af de tilsvarende miRNA.

Konckdown af AK126698 aktiveret kanoniske Wnt signalvejen og induceret cisplatin modstand i A549-cellelinje

ovenstående vej analyser har vist, at Wnt signalvejen og mange isolerede medlemmer af det opført i relativ isoleret netværk blev væsentligt ændret i A549 /CDDP cellelinje. Disse resultater foreslog os, at Wnt signalvej var involveret i NSCLC kemoresistens. Ud over dette blev niveauet af AK126698 tæt korreleret med mange medlemmer af Wnt-vejen (som vist i tabel S7). Således blev rolle lncRNA AK126698 i reguleringen af ​​Wnt signalvejen udforsket. Transfektion siRNA AK126698-424 og siRNA AK126698-291 i A549-celler resulterede i fald i NKD2 mRNA-ekspression, som er en negativ regulator af Wnt signalering pathway (fig. 5A). I mellemtiden blev nøglen transkriptionsfaktor i kanonisk Wnt pathway β-catenin også steget i proteinniveauet efter AK126698 knockdown. Proteinet niveau af phospho-β-catenin (Ser675), som repræsenterer β-catenin translokation, forøget efter behandling af siRNA AK126698. Disse resultater antydede, at siRNA AK126698 aktiveret kanoniske Wnt /β-catenin-signalvejen (figur 5B). Samtidig blev virkningen af ​​knockdown AK126698-424 og siRNA AK126698-291 på A549-celle apoptose observeret ved anvendelse af annexin-V /PI-assay.