PLoS ONE: Tab af glukokortikoidreceptor Expression af DNA-methylering Forhindrer Glukokortikoid induceret apoptose i Human småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Menneskelig småcellet lungecancer (SCLC) er meget aggressiv, og hurtigt udvikler resistens over for terapi . SCLC celler er typisk ufølsom over for glucocorticoider grund forringet glucocorticoidreceptor (GR) ekspression. Dette er vigtigt, da vi tidligere har vist, at ekspression af et GR transgen inducerer celledød

in vitro

, og hæmmer tumorvækst

in vivo

. Men den underliggende mekanisme for tab af GR-ekspression er ukendt. SCLC cellelinie, DMS79, har lav GR ekspression, sammenlignet med ikke-SCLC cellelinjer og normale bronchiale epitelceller. Retroviral GR ekspression i DMS79 celler forårsaget aktivering af apoptotiske vej som påvist ved markant induktion af caspase-3-aktivitet. Methylering analyse af GR-promotoren afslørede nogle methylering i 1D, og ​​1E promotorer af GR-genet, men den allestedsnærværende konstitutivt aktive 1C promotor var stærkt methyleret. I 1C promotoren var der en meget signifikant stigning i DNA-methylering i et panel af 14 humane SCLC-cellelinier sammenlignet med en blandet panel af GR udtrykkende og ikke-udtrykkende cellelinier og til perifere mononukleære blodceller. Endvidere i panelet af SCLC-cellelinier var der en signifikant negativ korrelation ses mellem methylering af 1C promotoren, og GR proteinekspression. Tilbageførsel af GR gen methylering med DNA methyltransferase hæmning forårsagede øget GR mRNA og protein-ekspression i SCLC, men ikke ikke-SCLC celler. Dette resulterede i øget Gc følsomhed, nedsat Bcl-2-ekspression og øgede caspase-3-aktivitet i SCLC celler. Disse data antyder, at DNA-methylering nedsætter GR-genekspression i humane SCLC celler, på en måde svarende til den for konventionelle tumorsuppressorgener

Henvisning:. Kay P, Schlossmacher G, Matthews L, Sommer P, Singh D, White A, et al. (2011) Tab af glukokortikoidreceptor Expression af DNA-methylering Forhindrer Glukokortikoid induceret apoptose i Human småcellet kræftceller. PLoS ONE 6 (10): e24839. doi: 10,1371 /journal.pone.0024839

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: December 22, 2010; Accepteret: August 22, 2011; Udgivet: Oktober 3, 2011

Copyright: © 2011 Kay et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIHR Manchester Biomedical Research Centre og University of Manchester Alumni forening. PK og GS har modtaget en BBSRC studentship award (https://www.bbsrc.ac.uk). GS har også en Barbara Mawer begavet studentship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ændringer i den epigenetiske status af gener er vigtige i mange humane sygdomme, men især i cancer [1]. Nogle af disse er medieret af ændringer i ekspressionen og aktiviteten af ​​DNA metyltransferaser, DMNT1, DNMT3A og DNMT3B [2], [3]. Cancerceller har karakteristisk hypermethyleret CpG-øer forbundet med tumorsuppressorgener [1], og DNMT1 er rapporteret at være overudtrykt i lungekræftpatienter der ryger [4]. Nylige undersøgelser har identificeret at en tobaksrøg kræftfremkaldende, nitrosamin 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) 1-butanon (også kendt som nikotin afledt nitrosamin keton; NNK) ikke kun inducerer genmutationer, men øger også hypermethylering af multipel tumorsuppressorgen promotorer herunder cyclin-afhængig kinase inhibitor 2A (p16INK4a), død associeret protein kinase 1 (dapk1), og retinsyrereceptor b (RaRb) [4]. Rygning er den største risikofaktor for human småcellet carcinom og rygning er selv forbundet med methylering af mere end 20 tumorsuppressorgener [5], [6].

Mange faktorer kan påvirke glucocorticoid følsomhed, herunder genetisk variation på GR-genet locus, og ekspression af interagerende proteiner [7] – [10]. Vi har tidligere vist, at humane SCLC-cellelinier er resistente over for glucocorticoid (GC) hormoner og lægemidler, og at denne modstand skyldes forringet GR-ekspression [11], [12]. Genoprettelse af GR-ekspression i cellerne ved transfektion eller viral transduktion er tilstrækkelig til at genoprette Gc følsomhed [12]. Men endnu vigtigere, restaurering af GR-ekspression er også tilstrækkelig til at inducere apoptose af SCLC celler både in vitro [13], og også i en xenograft model [14]. Dette rejser muligheden for, at GR er et nyt tumorsuppressorgen for SCLC, og at tab af GR udtryk er impliceret i SCLC patogenese.

GR-genet (NR3C1) er en allestedsnærværende udtrykt, ligand aktiveret transkriptionsfaktor, en medlem af den nukleare receptorsuperfamilie. Der er en enkelt kopi-gen på kromosom 5, men dens struktur er kompleks og relativt lidt om hvordan transkription reguleres af den [15]. Transkription kontrolleret af 9 promotorer, hver er knyttet til en alternativ transkriptionsstartstedet. Syv af disse promotorer er grupperet sammen i en CpG ø, et fælles træk ved housekeeping-gener [16]. Alle udskrifter generere autentiske fuld længde GR protein som translationsstartstedet er placeret i den fælles exon 2.

GR aktiveres ved GC hormoner fra binyrebarken, under stram styring af hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen. Denne akse er under feedback-kontrol i hippocampus og hypothalamus gennem aktivering af GR protein udtrykt i disse steder. Variabilitet i rotte HPA-akse tone er blevet tilskrevet ændringer i hippocampus GR ekspression reguleres af ændret metylering af rotte GR exon 1-7 promotor [17]. Dette er placeret, som i den menneskelige, i opstrøms CpG øen. Nyere studier har undersøgt status for methylering af en række alternative humane GR promotorer i mononukleære celler fra perifert blod [16]. Disse undersøgelser har afsløret omfattende, og variabel methylering.

Hippocampal og hypothalamus GR spiller en central rolle i den negative feedback kontrol af hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen. Altered GR-ekspression i hjernen fører til genudsættelse af tonen i denne neuroendokrin akse og dette er forbundet med ændret methylering af nervevækstfaktor inducerbar-A (NGFI-A eller KROX, EGR1) bindingssted hos rotten exon 1.7 promotor , homolog med den humane exon 1F promotor [17] – [19]. Denne methylering kontrolleret ændring i GR ekspression resulterer i konsekvenser for hele organismen, ved at regulere adrenal glukokortikoider produktion.

I dette studie undersøgte vi mønster af GR promotor methylering i humane SCLC celler, og viste, at tilbageførsel af methyl varemærker steg GR proteinekspression og funktion. Desuden har vi identificeret en negativ korrelation mellem GR 1C promotor methylering og GR proteinekspression tværs et panel af humane SCLC cellelinjer, og menneskelige kontrol celler.

Materialer og metoder

Cell Culture og vedligeholdelse

A549 human lunge epitel carcinomaceller, HEK-293-humane embryoniske nyreceller, HeLa humane cervikale carcinomceller og U20S human osteosarkomceller (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, UK) blev alle dyrket i DMEM (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen).

Ikke-småcellet lungekræft linjer NCI-H358 og -H727 (European Collection of cell Cultures, Wiltshire, UK) og NCI-H23, -H441 , -H1299 (American Type Culture Collection, USA) blev dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen) suppleret med 10% FCS og 10 mM HEPES som anbefalet af leverandøren. Salg

småcellet lungecancer (SCLC) cellelinier anvendes i denne undersøgelse var den 10’COR ‘cellelinjer Cor L24, Cor L27, Cor L31, Cor L32, Cor L42, Cor L47, Cor l51, Cor L88, Cor L99 og Cor L103. Anvendes også var DMS 79, DMS 153, HC12 og HX 148. Alle disse cellelinjer blev afledt fra patienter med patologisk bekræftet SCLC [20], [21] med undtagelse af Cor L32, som blev afledt fra en patient med dårligt differentieret pladecarcinom af lungen. Denne cellelinie havde imidlertid udviser karakteristika SCLC [21]. Alle SCLC-cellelinier blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) suppleret med 10% FCS og 10 mM HEPES, som tidligere beskrevet [12].

Humane perifere mononukleare celler blev opnået fra raske donorer lokale, ifølge LREC godkendelse 09 /H1013 /6.

Normalt humant bronkieepitel blev høstet fra lunge resektion prøver efter operation for lungekræft, med fuld, informerede samtykke patient.

Behandlinger

Hvor det er relevant, blev cellerne behandlet med vehikel eller 100 nM dexamethason (Sigma-Aldrich) i 24 timer ved 37 ° C, 5% C0

2 før lysis. I visse eksperimenter blev celler inkuberet med vehikel eller 5 uM 5’Azadeoxycytidine (Sigma-Aldrich) i 72 timer eller 5 dage. Efter behandling med 5’Azadeoxycytidine blev nogle celler behandlet i yderligere 72 timer med 100 nM dexamethason.

Immunblotanalyse

Celler blev lyseret ved anvendelse af 1 × RIPA-buffer (100 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1% Igepal, 2,5% natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA) .Dette puffer indeholdt også proteaseinhibitorer (Roche). Efter centrifugering i 30 minutter ved 10.000

g

supernatanter blev høstet og analyseret for proteinindhold ved anvendelse af et Bradford-assay (Bio-Rad). Prøver blev derefter fortyndet i påsætningsbuffer [0,125 M TrisCI (pH 6,8), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 20% glycerol, 0,2% β-mercaptoethanol, 0,001% bromophenolblue]. Celleekstrakter (50 ug) blev derefter analyseret ved SDS-PAGE og western blotting som beskrevet [22], [23]. Primære antistoffer blev anvendt, var den muse monoklonalt anti-hGR (klon 41, 1:2500), som binder i den N-terminale region af GR (BD Biosciences), kanin polyklonalt anti-hGR (P-20, 1:500) dannet mod et peptid mapping ved C-terminalen af ​​GRa (Santa Cruz) og monoklonale muse α-tubulin (1:5000) (Sigma-Aldrich). Sekundære antistoffer blev benyttet peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse (1:5000) og anti-kanin (1:5000) (GE Healthcare). For at kvantificere protein niveauer, blev densitometrisk analyse. Blots blev scannet og densitometri af hvert bånd blev analyseret ved anvendelse ImageJ software. Den interne ladningskontrol (αTubulin) blev også kvantificeret, og resultaterne blev normaliseret mod disse aflæsninger. Denne analyse blev udført på 3 separate blots for hvert forsøg og den gennemsnitlige beregnede.

reportergenassays

Celler blev cotransficeret med 2 ug af en TAT3-luciferase konstruktion [13], og 0,5 ug af et pCMV

Renilla

Luciferase konstruktion (for at korrigere for transfektionseffektivitet) under anvendelse Fugene 6 (Roche). I nogle tilfælde blev cellerne også transficeret med 1 ug af en GR-ekspressionsvektor (pFUNC1-GR-EYFP) [13]. Celler blev behandlet med dex som beskrevet før luciferase assays blev udført under anvendelse af Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega), som tidligere beskrevet [8].

Retrovirale infektioner

pFUNC1-EYFP eller pFUNC1 -GR-EYFP blev transficeret ind HEK293 for retroviral produktion ved hjælp Fugene HD (Roche, UK), som transfektionsreagens ved et 3:02 reagent:DNA ratio. Infektion af de retrovirale partikler til DMS 79 celler blev udført som beskrevet før. Efter infektion blev celler dyrket i normalt vækstmedium indeholdende serum i 72 timer.

spaltet caspase-3-assay

DMS 79 celler, der udtrykker GR-EYFP eller EYFP blev påført poly-L-lysin belagt dækglas og fikseret med 4% formaldehyd. Celler blev permeabiliseret med PBS /0,2% Triton- × 100. Efter vask blev cellerne blokeret i PBS /0,1% Tween-20 + 5% donkey serum. Anti-ACTIVE caspase-3 pAb (Promega, UK) fortyndet 1:250 i blokerende buffer blev tilsat til cellerne og inkuberet natten over. Sekundært antistof inkubation blev udført i mørke ved hjælp Alexa Fluor 546 æsel anti-kanin IgG (Invitrogen, UK) fortyndet 1:500 i PBS. Dækglas blev monteret ved hjælp forlænge guld med DAPI (Invitrogen, UK).

Billeder blev opsamlet på et Olympus BX51 opretstående mikroskop ved hjælp af en 60 × /1,40 UPlanApo objektiv og taget med et Coolsnap ES kamera (Photometrics) gennem MetaVue Software (Molecular Devices). Specifikke båndpasfilter sæt til DAPI, FITC og Texas red blev anvendt til at forhindre gennemblødning fra en kanal til den næste. Billederne blev behandlet og analyseret ved hjælp ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij).

natriumbisulfit sekventering

Genomisk DNA blev ekstraheret fra flere af de cellelinjer, der anvendes i denne undersøgelse, hvoraf nogle var blevet behandlet med 5 ‘Azadeoxycytidine (se resultater) ved hjælp af DNeasy blod og væv (Qiagen). Oprenset genomisk DNA blev derefter bisulfit omdannet ved hjælp af Epitect Bisulfit Kit (Qiagen). Dette konverterede DNA blev derefter anvendt som en skabelon i PCR-reaktion til amplifikation specifikke GR promotorregioner. GR promotorområder forstærket (og de anvendte primere) var som følger:

Promoter

1C (fremadrettede 5′-AGGTGGATCCGGAAGGAGGTAGYGAGAAAAGAAATT-3 ‘; reverse 5’AGGTGAATTCACACRAACTCRCAAAATAAAAAAAA-3’).

Promoter

1D (fremadrettede 5′-AGGTGGATCCTTTTATAAAAATTTTTTTGGTTGAGG-3 ‘; reverse 5’AGGTGAATTCCCCCCTACTCTAACATCTTAAAAA).

Promoter

1E (fremadrettede 5’AGGTGGATCCTTAGAGTTATAAAAATTATAATTTGTGT-3.. ‘; dekompilere 5’AGGTGAATTCATACAAACAACTTTAAAATACCAAC-3’)

Alle primere blev leveret af MWG-Eurofins

PCR blev udført ved hjælp af Immolase Polymerase (Bioline) efter producentens anvisninger. Cykling var som følger: 95 ° C i 10 minutter, 30 cyklusser ved 95 ° C i 30 sekunder, ved 56 ° C i 45 sekunder og ved 72 ° C i 30 sekunder, var dette efterfulgt af en endelig forlængelse på 72 ° C i 10 minutter. Salg

PCR-produkter blev elektroforesebehandlet på en polyacrylamidgel og oprenset under anvendelse af et gel Extraction kit (Qiagen). Ligeringer blev derefter udført under anvendelse af disse PCR-fragmenter under anvendelse af pGEM-T-easy-vektor-system (Promega) ifølge producentens anvisninger. Efter transformation ind i JM-109 kompetente bakterier (Promega) blev kolonier udvalgt og inkuberet natten over i LB-bouillon ved 37 ° C. Mini-preps (Qiagen) blev udført på disse cellesuspensioner, efterfulgt af en restriktionsfordøjelse anvendelse af EcoRI (Roche) for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​det korrekte insert. Plasmider indeholdende insert blev derefter sendt til sekventering under anvendelse af en SP16 primeren ved DNA-sekventering Facility, University of Manchester. En indledende undersøgelse blev gennemført for at analysere potentielle methylering og virkningerne af 5’Azadeoxycytidine, ved hjælp af DNA fra DMS 79 celler. I dette tilfælde blev én klon analyseret for hver betingelse (hver enkelt promotor, ubehandlet eller behandlet med 5’Azadeoxycytidine). En mere dybtgående undersøgelse blev udført for at analysere methylering af 1C promotoren i et panel af SCLC-cellelinier. I dette tilfælde blev 3 kloner analyseret pr cellelinje.

Statistik

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS til Windows-version 16. Yderligere statistiske analyser blev udført for at sammenligne methylering niveauer af Dr Steve Roberts, University of Manchester; anvendelse af en lineær regressionsmodel. Ligningen anvendt til denne analyse var som følger:

Resultater

Angivelse af GR er svækket i den menneskelige SCLC cellelinje blev DMS79

GR protein målt i hSCLC celle line, DMS79 og sammenlignet med to Gc følsomme cellelinier, HeLa og A549, og to Gc resistente cellelinier, U2OS og HEK293. SCLC cellelinie DMS79 udtrykker lave niveauer af GR-protein, svarende til U2OS celler samt klart langt mindre end HeLa og A549-celler (fig. 1a). Sammenligning med et panel af ikke-SCLC-cellelinier viser, at ekspression af GR er lavere i SCLC-celler (fig. 1b). GR-protein viste sig at blive udtrykt i normal human bronchial epitel, høstet fra lungevæv ved resektion af lungecancer (fig. 1c).

(A) Western blot-analyse af GR, og tubulin proteinekspression i U20S, HEK, HeLa, A549 og DMS 79 celler. Blot repræsenterer 3 separate forsøg. (B) Sammenligning af GR-proteinekspression mellem SCLC og non-SCLC (NS) cellelinier. Kvantificering af GR-ekspression i forhold til tubulin er præsenteret som gennemsnit +/- S.E.M. (N = 3) med * angiver p 0,05, t-test for uafhængige stikprøver. (C) Sammenligning af GR proteinekspression i normal human bronchial epitel (NBE) sammenlignet med ikke-SCLC cellelinje (A549), og et panel af humane SCLC-cellelinier. Kvantificering af GR-ekspression i forhold til tubulin er præsenteret. Gennemsnit af n = 2. (D) Analyse af GR-proteinekspression under anvendelse af en pan-GR antistof rejst mod GR N terminal (N-term), og en GRalpha specifik GR antistof rejst mod den C-terminale (C-term).

GR migrerede som to store arter, og den relative forekomst syntes at variere mellem celletyper (fig. 1a, b). Dette kan afspejle alternativ splejsning til GRp isoformen, eller alternativt translationsstartsted forbrug [22] – [24]. Til yderligere karakterisering af arter, blev immunoblots gentaget under anvendelse af en C-terminal specifikt antistof, som specifikt genkender GRa (fig. 1d). Den tilsvarende banding mønster observeret med de to antistoffer indikerer begge proteiner deler en fælles C-terminal domæne, hvilket tyder på, at proteinet mangfoldighed ligger hos alternativ oversættelse startstedet brug.

Restaurering af GR udtryk fremkalder apoptose

i DMS79 celler ekspression af et GR-EYFP transgenet ved retroviral infektion resulterede i øget GR-EYFP protein (fig. 2a) og apoptose som påvist ved forøget spaltet caspase-3 i SCLC-celler, som udtrykker GR-EYFP (fig. 2b). I disse undersøgelser kun et mindretal af celler effektivt transduceres, derfor den lave overflod af udtrykt fusionsprotein i puljen af ​​celler. Desuden ekspression af transgenet apoptose, hvilket yderligere reducerer GR-EYFP koncentration i poolede cellelysater [13], [14].

(A) DMS 79 celler blev inficeret med enten GR-EYFP eller EYFP retrovira og GR protein vurderet 72 timer. (B) DM79 celler behandlet som ovenfor blev fikseret i immunhistokemi til påvisning spaltet caspase-3. Celler blev farvet for aktiveret caspase-3 og derefter analyseret for co-lokalisering med enten GR-EYFP eller EYFP. Procentdel af celler positive for kløvet caspase-3 og EYFP eller GR, EYFP. Celletællinger afledt af 3 uafhængige infektioner og repræsenteret som procentdelen af ​​caspase-3 positivt til EYFP positiv som middelværdi +/- S.E.M. (N = 3) med *** angiver p 0,001, t-test for uafhængige stikprøver

Methylering status GR promotor i SCLC celler

faldt GR udtryk i. SCLC celler kan skyldes ændring i GR promotor methylering, eller fra en indirekte mekanisme. Derfor methylering status GR initiativtagere i DMS79 celler blev undersøgt ved bisulfit sekventering. Vi har ikke afsløre eventuelle DNA methylering i initiativtagerne 1B, og 1F. 1D og 1E promotor hver havde kun en enkelt methyl CpG, mærket med en åben kasse (fig. 3a, b). I modsætning havde 1C promotoren fire methylgrupper CpG’er (fig. 3c). De observerede methylerede CpG’er er placeret i potentielle transcriptionsfaktor bindingssites, (CpG’er 6, 44 og 52), eller ligger tæt på et sådant sted (CpG 69) (fig. 3c).

Bisulfit sekventering blev udført på ekstraheret genomisk DNA fra DMS 79 celler inkuberet med 5’Azadeoxycytidine i 5 dage (ubehandlet som kontrol). Den oprindelige sekvens (opnået fra GENOM Browser) blev sammenlignet med bisulfit behandlede DNA fra kontrollen og 5’Azadeoxycytidine behandlede prøver. Fed, åbne kasser fremhæve bestemte methylerede CpG’er, som viste tilbageførsel af methylering efter 5’Azadeoxycytidine inkubation. Den potentielle transcriptionsfaktor bindingssites i umiddelbar nærhed af den methylerede steder er angivet med grå skravering til Sp1-bindingssted og mørkegrå farve til C /EBPβ bindingssted. (A) CpG-methylering i GR 1D promotorregionen i DMS 79 celler. Individuelle CpG’er er nummererede og i hovedstæderne. (B) CpG-methylering i en region af GR-promotoren 1E fra DMS 79 genomisk DNA. Individuelle CpG’er er nummererede og i hovedstæderne. (C) Genomisk DNA fra et område af GR-promotoren 1C fra DMS 79 celler. Individuelle CpG’er er nummererede og i hovedstæderne. Kursiv tekst angiver starten på exon 1C.

SCLC cellelinjer har øget methylering af GR 1C promotor

For at afgøre, om fundet de observerede ændringer i GR promotor methylering i andet menneske SCLC-cellelinier, et panel af 14 hSCLC cellelinier med varierende GR-ekspression blev sammenlignet med to GR udtrykkende cellelinier, (A549 og HeLa) en ikke-udtrykkende cellelinie, (U2OS), og mononukleære celler fra perifert blod som en primær celle sammenligning (fig. 4a, b). Perlerne repræsenterer CpG-dinukleotider fra position 1 til position 69. Det er indlysende, at der er hyppig methylering ved de sidste to perler på højre, som repræsenterer CpG 68 og 69. Dette er til stede tværs over pladen af ​​SCLC celler, og er også set i kontrolcellerne. Men der er også en markant stigning i methylering ved positionerne 1-67 på tværs af SCLC panelet, uden nævneværdig klyngedannelse. I modsætning er der meget lidt CpG-methylering set ved positionerne 1-67 i kontrolgruppen celle panel (fig. 4a, b).

Genomisk DNA blev ekstraheret fra (A) kontrolmålværdier cellelinjer, herunder primære perifert blod mononukleære leukocytter fra en rask donor og (B) 14 hSCLC cellelinier. Efter omdannelse med bisulfit den 1C promotorregionen blev PCR-amplificeret. 3 kloner pr cellelinje blev derefter sekventeret. Methylering i panelet af SCLC cellelinjer og kontrol cellelinjer vises som “perler”. Hver enkelt perle repræsenterer en enkelt CpG i GR 1C promotoren i nummerorden fra venstre mod højre. Hvide perler indikerer methylerede CpG’er mens sorte perler indikerer methylerede CpG’er. Alle 3 kloner vises for hver cellelinie analyseret.

Logistisk regression blev anvendt til at sammenligne methylering mellem SCLC panel, og alle kontrolceller (tabel 1). Dette viste, at der var en signifikant forskel mellem grupperne med methylering på CpG 69 individuelt; og med CpG 68 og 69 i kombination, og i resten promotorregion. En signifikant forskel blev også observeret mellem grupperne for alle CpG’er eksklusive 68 og 69 (tabel 1).

GR promotor methylering er korreleret med GR-ekspression

På tværs af alle de hSCLC cellelinjer der var en bred vifte af GR-ekspression, selv om i alle tilfælde GR var mindre forekommende end i HeLa og A549 kontrol cellelinier (fig. 5a, b). Der var også en markant variation i overflod af de to GR protein arter på tværs af de undersøgte cellelinjer, men for denne analyse både GR proteinisoformer blev behandlet samlet. Forholdet mellem GR 1C promotor methylering og GR-proteinekspression blev undersøgt i hele panel af hSCLC cellelinier. Der var en signifikant korrelation mellem antallet af methylerede CpG’er, og GR-proteinekspression i panelet af hSCLC cellelinier; r

2 = 0,54 og p = 0,01 (fig. 5c).

(A) Repræsentant western blot for GR og tubulin i 10 SCLC cellelinier samt kontrol cellelinier HEK (humane embryonale nyre ), U2OS (osteosarkom), HeLa (cervikalt carcinom) og A549 (ikke-småcellet lungecancer). (B) Densitometri blev udført på 5 separate blots at kvantificere niveauet af GR-ekspression i forhold til tubulin. Grafen viser den gennemsnitlige, korrigerede GR udtryk ± S.E.M. (C) Forbindelser mellem methylering af GR Promoter 1C og GR-ekspression i et panel af humane lunge cancercellelinjer. Samlet methylering (i procent) på tværs promotor 1C blev plottet mod GR-ekspression, med standardafvigelse for hver cellelinie. Regressionslinjen var signifikant forskellig for nul (P = 0,01), og godhed fit var r

2 = 0,54.

Restaurering af GR udtryk ved tilbageførsel af DNA methylering

Hvis tabet af GR udtryk i DMS79 celler resulterede fra DNA methylering, måske deraf til carcinogenese, ville GR udtryk forudsiges at stige efter tilbageførsel af methylering. Efter 72 timers behandling med 5’Azadeoxycytidine, GR-mRNA-niveauer steg dramatisk i DMS79 celler sammenlignet med HEK-og A549-celler, hvor ingen ændringer i ekspression blev set (fig. 6a). Endvidere efter 72 timer, eller efter 5 dages inkubation med 5’Azadeoxycytidine, var der en slående stigning i GR-protein (fig. 6b). I modsætning til stigningen i GR-ekspression set i DMS79, blev der nedsat ekspression i U2OS celler, muligvis på grund af toksicitet (fig. 6b).

(A) GR-mRNA-ekspression normaliseret til GAPDH som svar på 72 timer behandling med 5’azadeoxycytidine (5’Aza) i DMS 79 celler, GR deficiente HEK-celler, og GR udtrykker A549-celler. (B) To GR deficiente cellelinjer, DMS 79 og U2OS, blev behandlet med 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) i 72 timer og 5 dage (ubehandlede celler som kontrol). Lysater blev derefter analyseret ved Western blot for GR-ekspression. For DMS 79 celler, blev GR udtryk normaliseret mod α tubulin, og plottet som gennemsnit GR udtryk plus S.E.M. (N = 3). * Angiver p 0,01 sammenlignet med vehikel behandlet kontrol. (C) Et panel af humane SCLC-cellelinier (øvre panel) blev sammenlignet med et panel af ikke-SCLC-cellelinier (nederste panel) for reaktionen af ​​GR protein til inkubation med 5’Azadeoxycytidine (5’Aza).

virkningen af ​​5’Azadeoxycytidine blev derefter sammenlignet i humane SCLC-cellelinier og ikke-SCLC-cellelinier for at bestemme om reguleringen af ​​GR-ekspression ved methylering var udbredt i lungekræft. Tre af de fire SCLC-cellelinier viste augmented GR-ekspression efter 5’Azadeoxycytidine behandling, sammenlignet med kun én af de fire ikke-SCLC-cellelinier (fig. 6c).

Stigningen i GR-ekspression set i DMS79 celler forventes at genoprette Gc følsomhed over for disse celler. Faktisk blev der øget Gc transaktivering af en simpel reporter gen (fig. 7a). Størrelsen af ​​Gc induktion var betydeligt mindre end den, der ses med GR overekspression, men sidstnævnte medfører supra-fysiologiske GR koncentrationer i target-celler (fig. 7a).

(A) Behandling af DMS 79 celler med 5’Azadeoxycytidine (5’Aza) genopretter Gc følsomhed. DMS 79 celler behandlet med 5’Aza i 72 timer blev transficeret med TAT3-Luciferase reporter konstrukt. Celler blev derefter inkuberet natten over med eller uden 100 nM dexamethason. Grafen viser den gennemsnitlige fold ændring (DEX behandlet /ubehandlet), (relative lysenheder), (tre eksemplarer) plus S.E.M. (* = P 0,05). DMS 79 celler blev også co-transficeret med pFUNC1 GR-EYFP (som en positiv kontrol) og TAT3-luciferase-reporterkonstruktion. Celler blev derefter inkuberet natten over med eller uden 100 nM dexamethason. Grafen viser den gennemsnitlige fold ændring (dex behandlet /ubehandlet) plus S.E.M. Alle resultater blev normaliseret mod en Renilla kontrol. Resultater er repræsentative for 3 separate forsøg. (B) Bcl-2 mRNA-ekspression normaliseret til GAPDH som respons på 72 timers behandling med 5’Azadeoxycytidine (5 ‘Aza) i DMS79 og HEK-celler. (C) Behandling af celler med Aza og derefter dexamethason resulterer i apoptose. Repræsentativt billede af SCLC celler (CORL47) og ikke-SCLC celler (NCI-H358) behandlet med Aza som beskrevet ovenfor. Celler blev derefter behandlet med dexamethason i 72 timer, fikseret og farvet for aktiv caspase-3. (D) Demethylering fører til markant stigning i Gc medieret apoptose i SCLC celler sammenlignet med ikke-SCLC celler. Apoptose målt ved caspase-3-aktivering efter 5’Aza og dexamethason, som beskrevet ovenfor. Grå søjler repræsenterer celler behandlet med dexamethason, sorte søjler for celler behandlet med 5’Aza og derefter med dexamethason. Hver cellelinje blev inkuberet i tre eksemplarer og 100 celler talt for at vurdere% positiv farvning. Uafhængig t-test * = p 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001

Den øgede GR udtryk som respons på behandling med 5’Azadeoxycytidine resulterede i undertrykkelse af pro-overlevelse Bcl-2-genet i både HEK, og DMS79 celler (fig. 7b). Der blev også forøget spaltet caspase-3 aktivering i SCLC-celler, men ikke de ikke-SCLC celler (Fig 7c . 7d). Det er vigtigt at bemærke, at efter 5 dages inkubation med 5’Azadeoxycytidine var der induktion af celledød, muligvis på grund af generhvervelse af GR udtryk eller regulering af andre overlevelse gener.

Diskussion

Epigenetisk lidelser er impliceret i mange humane sygdomme, herunder cancer. Cigaretrøg er den vigtigste miljømæssige agent fremme SCLC og for nylig, har en cigaretrøg kræftfremkaldende, NNK, blevet vist at udøve en specifik virkning fremme DNMT1 ekspression og aktivitet [4]. Derfor kan det kræftfremkaldende virke ved at inducere epigenetiske ændringer i vigtige gener impliceret i patogenesen af ​​kræft.

Vi har tidligere vist, at glucocorticoidreceptoren er effektivt et tumorsuppressorgen for SCLC, hvis ekspression inhiberes [12] . Vi har udvidet analysen i dette studie med yderligere beviser, at GR-ekspression er lavere i et panel af SCLC celler sammenlignet med ikke-SCLC celler eller normale bronchiale epitelceller. Generhvervelse af GR udtryk, og glukokortikoid følsomhed i SCLC celler

in vitro

, eller i xenotransplantattumorer resulterer i apoptose [13], [14]. GR er udtrykt i de fleste celler og væv, og udøver pleiotrope virkninger på celler. Relativt lidt er kendt om, hvordan GR-genekspression reguleres, da den har en usædvanlig kompleks promotor struktur. Nyere undersøgelser i primære perifere mononukleære blodceller defineret meget individuelle mønstre af GR promotor methylering [16]. Dette arbejde også kortlagt potentiale, og bevist transcriptionsfaktor bindingssites inden promotorerne, hvoraf størstedelen indeholdt CpG sites, som kan være methyleret. Dette antydede, at forskellen methylering af menneskelige GR promotor er en mekanisme til at styre promotor udnyttelse, og så GR genekspression.

Tre GR initiativtagere blev undersøgt i indekset cellelinie, DMS79, og alle tre indeholdt methylerede CpG sites . Yderligere analyse blev udført på den 1C promotoren, som det har vist sig at blive ubikvitært udtrykt i alle testede væv, herunder lunge [15]. Der var helt klart og meget signifikant stigning i CpG-methylering tværs et panel af hSCLC cellelinjer sammenlignet med den ikke-SCLC cellelinie A549. Vigtigere var der ingen stigning i de to ikke-udtrykkende kontrol cellelinier (U2OS og HEK293), hvilket indikerer, at 1C promotor methylering ikke er forpligtet til at begrænse GR udtryk, men at andre mekanismer kan gælde regulere GR udtryk i forskellige celletyper. En bredere sammenligning mellem hSCLC celler og en heterogen panel af GR udtrykker, og ikke-udtrykkende cellelinjer fandt også en meget betydelig stigning i methylerede bindingssteder for CpG i hSCLC celler.