PLoS ONE: EZH2-medieret H3K27me3 er involveret i Epigenetisk Undertrykkelse af Slettet i leverkræft 1 i Human Cancers

Abstrakt

Enhancer af Zeste homolog 2 (EZH2), histon methyltransferase af Polycomb Undertrykkende kompleks 2 katalyserende histon H3 lysin 27 tri-methylering (H3K27me3), er ofte opreguleret i humane kræftformer. I denne undersøgelse identificerede vi tumor suppressor Slettet i leverkræft en (DLC1) som et mål for undertrykkelse af EZH2-medieret H3K27me3. DLC1 er et GTPase-aktiverende protein for Rho familie proteiner. Inaktivering af DLC1 resultater i hyper-aktiveret Rho /ROCK signalering og er impliceret i aktincytoskelet omorganisering for at fremme kræft metastaser. Ved kromatin immunopræcipitationsassay, vi viste, at H3K27me3 var signifikant beriget ved DLC1 promotor-regionen i en DLC1-nonexpressing HCC cellelinje, MHCC97L. Udtømning af EZH2 i MHCC97L af shRNA reduceret H3K27me3 niveau DLC1 promotor og induceret DLC1 gen re-udtryk. Omvendt forbigående overekspression af GFP-EZH2 i DLC1-udtrykkende Huh7 celler reduceret DLC1 mRNA-niveauet med en samtidig berigelse af EZH2 på DLC1 promotor. En invers relation mellem EZH2 og DLC1 ekspression blev observeret i lever, lunge, bryst, prostata, og æggestokkræft væv. Behandling kræftceller med EZH2 lille molekylære inhibitor, 3-Deazaneplanocin A (DZNep), restaureret DLC1 udtryk i forskellige cancer cellelinjer, hvilket indikerer, at EZH2-medieret H3K27me3 epigenetisk regulering af DLC1 var en fælles mekanisme i humane kræftformer. Vigtigt er det, fandt vi, at DZNep behandling hæmmede HCC cellevandring gennem forstyrre aktincytoskelettet netværk, hvilket tyder på det terapeutiske potentiale DZNep målrette kræft metastaser. Tilsammen vores undersøgelse har kastet mekanistisk indsigt i EZH2-H3K27me3 epigenetisk undertrykkelse af DLC1 og slået til lyd for betydelige pro-metastatisk rolle EZH2 via undertrykke tumor og metastase undertrykkere

Henvisning:. Au SL-K, Wong CC- L, Lee JM-F, Wong CM, Ng IO-L (2013) EZH2-medieret H3K27me3 er involveret i Epigenetisk Undertrykkelse af Slettet i leverkræft 1 i Human kræftformer. PLoS ONE 8 (6): e68226. doi: 10,1371 /journal.pone.0068226

Redaktør: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 05, 2013; Accepteret: 28. maj 2013; Udgivet: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Au et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af The University of Hong Kong SeedFunding Program for Basic Research (200811159061 og 201011159045 til CMW), Hongkong Research Grants Rådets General Research Fund (HKU 782411M til CMW) og Hong Kong Research Grants Rådets Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C og HKU 7 /CRG /09 til IN). IN er Loke Yew professor i patologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer, at medforfatter Chun-Ming Wong er en PLoS ONE Editorial Board medlem og det ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Alle andre forfattere erklære nogen konkurrerende finansielle interesser.

Introduktion

Deregulering af opstrøms epigenetiske regulatoriske proteiner fremmer epigenetiske ændringer og bidrog til afvigende lyddæmpning af tumorsuppressorgener i humane kræftformer [1]. Forstærker af Zeste homolog 2 (EZH2), den katalytiske subunit af Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2), er en af ​​de mest almindeligt opreguleret epigenetiske regulatorer i forskellige humane cancere [2-5]. EZH2 er en histon methyltransferase, som specifikt katalyserer histon H3 lysin 27 tri-methylering (H3K27me3), som igen virker som en undertrykkende histon modifikation til epigenetisk kontrollere gentranskription [6,7]. Opregulering af EZH2 spiller en afgørende rolle i ondartet progression og blev impliceret i cancer metastaser [2]. EZH2 fungerer som et onkogen i forskellige menneskelige kræftformer hovedsageligt gennem epigenetisk inaktivering af tumor og metastase-gener, herunder E-cadherin [8], RUNX3 [9], SLIT2 [10], DAB2IP [11], og KLF2 [12]. Vi har for nylig også rapporteret, at EZH2 epigenetisk inaktiverer udtryk for multiple tumor og metastase suppressor microRNA’er (miRNA), såsom MIR-125b og MIR-139 i human hepatocellulært carcinom (HCC), dermed fremmer HCC tumorigenicitet og metastase [13]. Identifikation nye targets, der er bragt til tavshed af EZH2 vil bedre afsløre de molekylære roller EZH2 i cancer metastaser, som vil være til gavn for udviklingen af ​​kemoterapier rettet EZH2.

DLC1 blev identificeret som en

bona fide

tumorsuppressorgen på en gentagne slettet kromosomale region på kromosom 8p21 i HCC [14]. DLC1 er en Rho GTPase-aktiverende protein (RhoGAP) lokaliseret ved de fokale adhæsioner [15,16], og er specifik til at styre aktiviteten af ​​RhoA, B, C og cdc42 [17,18]. Den RhoGAP aktivitet DLC1 negativt regulerer disse Rho proteiner ved at stimulere deres iboende GTP hydrolytiske aktivitet, og dermed konverterer dem fra den aktive GTP-bundne tilstand til den inaktive BNP-bundne tilstand. Rho signaleringskaskade tillader ordentlig kontrol af mange biologiske processer, såsom celleproliferation [19] og cellebevægelse [20] i normale celler. Under malignitet udvikling, DLC1 /Rho vej er af særlig betydning på grund af dets forordning om actincytoskelettet relateret til kræft metastaser. Vi har vist, at tabet af DLC1 i HCC aktiveret RhoA, som efterfølgende aktiveres sin nedstrøms effektor Rho-kinase (ROCK) for at omforme actincytoskelettet netværk for cellemigrering og invasion [21,22]. Andre forskelligartede tumor suppressive roller DLC1 omfatter mediering af caspase-3-afhængig apoptose i HCC model [23], inhibering af VEGF-afhængig angiogenese hos prostatacancer model [24], og undertrykkelse af clonogenicity i flere cancertyper [25]. Nedregulering af DLC1 almindeligvis vist i en lang række humane maligniteter [26] og dets tab af ekspression er klassisk associeret med kromosomal deletion eller promotor-DNA hypermethylering (Yuan et al 1998; Ng et al 2000; Wong et al 2003; Kim et al 2003). I nærværende undersøgelse, vi forudsat det første bevis på, at DLC1 er en roman mål for undertrykkelse af EZH2-medieret H3K27me3. Vi viste desuden inaktivering af EZH2 med 3-Deazaneplanocin A (DZNep), der re-udtrykte DLC1 og bemærkelsesværdigt afskaffet cytoskeletale reorganisering og hæmmede celle migration i kræftceller. Kollektivt, vores resultater tyder på, at epigenetisk inaktivering af DLC1 er involveret i pro-metastatisk funktion EZH2 i humane kræftformer.

Materialer og metoder

Cellelinjer

SMMC-7721 cellelinie (Shanghai Institute of Cell Biology) og Huh 7-cellelinje (japansk Cancer Research Bank) blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM)-høj glucose. MHCC97L cellelinie (gave fra Prof. Z. Y. Tang of Fudan University, Shanghai) [27] og Miha cellelinie (Shanghai Institute of Cell Biology) blev opretholdt i DMEM-high glucose tilsat natriumpyruvat. HeLa-cellelinje (American Type Culture Collection) blev opretholdt i DMEM-low glucose. CNE2 (American Type Culture Collection) og HCT116 (gave fra Prof. B. Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) [28] cellelinjer blev opretholdt i Roswell Park Memorial Institute 1640-medium. Alle medium blev suppleret med 10% føtalt bovint serum og 100 enheder /ml penicillin og streptomycin.

bisulfit modifikation og methyleringsanalyse

bisulfit modifikation af genomisk DNA ekstraheret fra cellelinier blev udført ved anvendelse EZ DNA methylering-Direct Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Primere anvendt til amplifikation af DLC1 promotor efter bisulfit modifikation er: 5′-GTTTTTAGTTAGGATATGGT-3 ‘(fremad) og 5′-ACTTCTTTCTACACATCAAACAC-3′ (revers) for BS-1 region; og 5’-TAGAGTTATTAAGAAAAAGAAGGGA-3 ‘(fremad) og 5′-AAAACTAAAATATTTCCCCCAC-3’ (tilbage) til BS-2-region. PCR-produkt blev klonet i TOPO TA Cloning vector (Invitrogen, Carlsbad, CA) og sekventering af individuelle kloner blev udført ved Sanger-sekventering.

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

chip assay blev udført under anvendelse af EZ chip kit (Millipore, Billerica, MA, USA) som tidligere beskrevet [13]. Chip-grade antistof mod H3K9me3 (ab8898; Abcam, Cambridge, MA, USA), H3K27me3 (07-449; Millipore, Billerica, MA, USA) og EZH2 (# 3147; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) blev anvendt i assayet. Kanin-IgG (Millipore, Billerica, MA, USA) eller muse-IgG (Millipore, Billerica, MA, USA) blev anvendt som negativ kontrol i assayet. Primere spænder -394nt at -325nt opstrøms for DLC1 transkriptionsstartstedet blev anvendt: 5′-CACCTC CGCCAAGTAAATGC-3 ‘(fremad) og 5′-CCGAAAAGTCGCCAACTATTG-3’ (revers). Kvantificering af antistof-bundne region blev gjort ved qPCR udført med ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

In vitro

epigenetiske lægemidler behandling

DZNep (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 5-Aza-dC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev opløst i 50% eddikesyre. TSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev opløst i ethanol. Opløsningsmidlet af kemikalierne blev anvendt som mock i den tilsvarende behandling. For DZNep behandling blev DZNep (1 uM eller 10 pM) sat til dyrkningsmediet i 48 eller 72 timer. For 5-aza-dC behandling, 5-aza-dC (10 uM) blev genopfyldes dagligt i 72 timer. For TSA behandling, TSA (0,25 ug /ml) blev kun tilsat til cellerne i de sidste 24 timer af forsøget.

cellemigrationsassay

Før cellemigrationsassay, 2×10

5 MHCC97L celler blev behandlet med 1 pM DZNep i 48 timer. Mock og DZNep-behandlede celler (1×10

5) celler blev podet i det øvre kammer af 8 pm-porestørrelse Transwell indsætte (Millipore, Billerica, MA, USA). Det nedre kammer indeholdt konditioneret medium indsamlet fra ubehandlede MHCC97L celler for at tiltrække cellemigration i 18 timer. Migrerede celler blev fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Tre uafhængige visninger af Transwell membran blev fotograferet og antallet af migrerede celler blev talt.

Immunofluorescens (IF) mikroskopi og scanning elektronmikroskopi (SEM)

Før IF billeddannelse, 2×10

5 MHCC97L celler blev behandlet med 1 pM DZNep i 48 timer. Efter behandlingen, mock og DZNep-behandlede celler (1×10

5) celler blev trypsinbehandlet og podet på dækglas i DZNep-dyrkningsmedium i 24 timer. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS og permeabiliseret med 0,2% Triton-X-100. Fokale adhæsioner blev farvet med anti-paxillin antistof (05-417; Millipore, Billerica, MA, USA). F-actin blev visualiseret ved farvning med FITC-konjugeret phalloidin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Kerner blev modfarvet med DAPI (Calbiochem, San Diego, CA, USA). HVIS billeder blev set og taget med et Leica Q550CW fluorescensmikroskop (Leica, Wetzler, Tyskland). For SEM blev mock og DZNep-behandlede celler fikseret med 1% osmiumtetroxid og 2,5% glutaldehyde, efterfulgt af trinvis ethanol dehydrering. Efter trinnet med kritiske punkt tør blev objektglassene monteret på sølvpasta. Billeder blev scannet og taget til fange under × 2.000 forstørrelse ved hjælp af en Hitachi S-4800 FEG Scanning Electron Microscope.

Statistisk analyse

Ikke-parametriske data og løbende parametriske data blev analyseret af Mann Whitney U-test og

t

test, henholdsvis ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.00 (GraphPad Software, San Diego California USA). Tests blev betragtet som signifikante, når

P Drømmeholdet værdi var mindre end 0,05.

Resultater

H3K27me3 niveau forskelligt beriget på DLC1 promotor i udødeliggjort normal hepatocyt og HCC cellelinjer

for at forstå betydningen af ​​epigenetisk deregulering og DLC1 inaktivering i HCC, vi begyndte med at analysere status DLC1 promotor methylering af bisulfide sekventering i udødeliggjort normal hepatocyt cellelinje Miha og to HCC cellelinier SMMC-7721 og MHCC97L. DLC1 promotoren var helt methyleret i Miha, heterogent og delvist methyleret i MHCC97L, og helt methyleret i SMMC-7721 (figur 1A). status methylering af DLC1 i Miha og SMMC-7721 korrelerede godt med deres DLC1 transkriptionel niveau. Men i MHCC97L, hvoraf DLC1 promotoren blev kun delvist methyleret, den fuldstændige inaktivering af DLC1 foreslået, at andre epigenetiske forordninger kan være involveret (figur 1B). Vi hypotese derfor, at afvigende histon methylering kan bidrage til DLC1 silencing i MHCC97L. Chromatin immunoprecipitation (chip) assay blev udført for at vurdere berigelse af transkriptionelle repressive histon modifikationer, H3K9me3 og H3K27me3 på den DLC1 promotoren (figur 1C). Vi viste, at H3K9me3 og H3K27me3 ikke var påviselige i Miha og dette var i overensstemmelse med den transkriptionelt aktive status DLC1 genet i denne cellelinie. I modsætning hertil berigelse af begge transkriptionelle undertrykkende H3K27me3 og H3K9me3 blev påvist ved DLC1 promotor af SMMC-7721 og MHCC97L celler. Interessant H3K27me3 blev mere rigeligt beriget i MHCC97L i forhold til SMMC-7721. Denne iagttagelse indikerer, at der ud over den delvise DNA-methylering, H3K27me3 deltog også i epigenetisk inaktivering til helt transkriptionelt inaktivere DLC1 genet i MHCC97L.

Promotor DNA-methylering og histon modifikation af DLC1 i HCC-cellelinier.

(A) Skematisk diagram, der viser CpG ø beliggende på DLC1 locus. DNA status methylering af 45 CpG-dinukleotider (BS-1-region inkluderet 35 CpG dinulceotides og BS-2-region omfattede 10 CpG-dinukleotider) var genstand for bisulfit sekventering analyse. Miha viste fuldstændig unmethylation, MHCC97L udviste delvis methylering og SMMC-7721 viste fuldstændig methylering. Åbn cirkel repræsenterer umethylerede CpG-dinukleotider og lukkede cirkel repræsenterer methylerede CpG-dinukleotider. Hver kolonne repræsenterer en enkelt klon, der sekventeret. (B) RT-PCR (øvre panel) og QRT-PCR (nederste panel) viser påviselig DLC1 mRNA-ekspression i Miha, men ikke i MHCC97L og SMMC-7721 celler. (C) kromatin immunofældning (chip) assay kombineret med qPCR (qChIP) analyse viste den relative berigelse af H3K9me3 og H3K27me3 på DLC1 promoter region i Miha, MHCC97L og SMMC-7721 celler. Fold af berigelse af chip assay blev beregnet med henvisning til IgG kontrol efter normaliseret med input DNA. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg.

Undertrykkelse af EZH2 induceret DLC1 reexpression i forskellige humane cancer cellelinjer

For at give mere dokumentation for, at EZH2-medieret H3K27me3 direkte regulerer DLC1, undersøgte vi, om DLC1 udtryk kunne genoprettes på knockdown af EZH2. HCC cellelinjer stabilt udtrykker ikke-mål-kontrol (NTC) eller EZH2 målrettet shRNA (shEZH2) blev etableret i vores tidligere undersøgelse [13]. Ved stabil knockdown af EZH2 blev DLC1 transkriptionelt induceret i MHCC97L (figur 2A). Tab af H3K27me3 på DLC1 promotoren blev observeret i MHCC97L shEZH2 celler (Figur 2B), hvilket indikerer, at EZH2-medieret H3K27me3 bidrager til undertrykkelse af DLC1 i MHCC97L. I DLC1-udtrykkende Huh7 celler, transient overekspression af GFP-EZH2 transkriptionelt undertrykt DLC1 og en samtidig berigelse af EZH2 blev detekteret på DLC1 promotoren (figur 2C og D Supplerende Figur S1). I overensstemmelse med den EZH2 knockdown model yderligere viste vi, at behandling af 3-Deazaneplanocin A (DZNep), et lille molekyle EZH2 hæmmer [29,30], reducerede signifikant EZH2 proteinniveauet og H3K27me3 niveau og induceret DLC1 re-ekspression i MHCC97L celler (figur 2E). Vigtigere, fandt vi, at EZH2-medieret DLC1 epigenetisk inaktivering ikke var begrænset til HCC. Re-ekspression af DLC1 upon DZNep behandling blev også observeret i forskellige cancercellelinier, herunder nasopharyngealt carcinom cellelinie CNE2, colorektal carcinom HCT116 og cervikal adenocarcinomacellelinie HeLa (figur 2F). Ovennævnte resultater viste, at epigenetisk inaktivering af DLC1 af EZH2-medieret H3K27me3 er en fælles mekanisme deles af forskellige menneskelige kræftformer.

EZH2-medieret H3K27me3 var involveret i epigenetisk undertrykkelse af DLC1 i HCC og flere andre menneskelige kræftformer.

(A) DLC1 blev transkriptionelt induceret ved stabil knockdown af EZH2 i MHCC97L celler. (B) qChIP analyse bekræftede udtømning af H3K27me3 berigelse DLC1 promotor på EZH2 knockdown i MHCC97L celler. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (C) DLC1 blev transkriptionelt undertrykt i Huh7-celler efter transient overekspression af GFP-EZH2. (D) qChIP analyse afslørede en samtidig berigelse af EZH2 på DLC1 promoter locus ved GFP-EZH2 overekspression i Huh7-celler. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (E) EZH2 og H3K27me3 ekspression blev reduceret ved 1 uM DZNep behandling i 48 timer i MHCC97L celler (venstre felt). DMSO blev anvendt som mock behandling. Pan H3 og α-tubulin blev loading kontrol af immunoblot. DZNep behandling transkriptionelt induceret DLC1 udtryk i MHCC97L som angivet af qPCR-analyse (højre panel). (F) Forskellige humane cancerceller, herunder nasopharyngealt carcinom cellelinie CNE2, den colorektal carcinom HCT116 og den cervikale adenocarcinomacellelinie HeLa blev undersøgt for DLC1 re-ekspression ved DZNep behandling. Behandling af celler med 10 pM DZNep reaktiveret DLC1 ekspression.

P

-værdier opnået fra

t

-test.

EZH2 og DLC1 ekspressionsniveauerne er omvendt korreleret i humane cancer væv

For at give kliniske relevans af vores

in vitro

observationer, vi undersøgte DLC1 mRNA-ekspression i 25-parrede primære HCC prøver og korreleret ekspressionsniveauet med vores tidligere EZH2 mRNA udtryk data [31]. I denne kohorte af prøver, blev EZH2 signifikant opreguleret mens DLC1 var signifikant nedreguleret i tumorform væv end de ikke-tumor-væv (figur 3A). Interessant nok blev en signifikant omvendt korrelation mellem EZH2 og DLC1 observeret i en delmængde af HCC prøver, hvori DLC1 promotor ikke blev stille ved DNA-methylering [17] (figur 3B). Vi udvidede også vores analyse til andre menneskelige kræftformer ved at hente de microarray genekspression data lunge [32], bryst [33], prostata [34], og æggestokkene [35] kræftformer fra Oncomine (www.oncomine.org) (figur 3C ). I overensstemmelse med resultaterne fra menneskelige HCC, samtidig DLC1 nedregulering og EZH2 opregulering blev observeret i disse maligne sygdomme, hvilket tyder på konsekvenserne af EZH2 opregulering i lyddæmpende DLC1 udtryk i forskellige menneskelige kræftformer.

Invers sammenhæng mellem EZH2 og DLC1 udtryk i menneskelige kræftformer.

(A) Tyve fem-parrede HCC prøver blev undersøgt for EZH2 og DLC1 mRNA ekspression ved qPCR. EZH2 var signifikant opreguleret i HCC tumorform (T) væv end ikke-tumorform (NT) væv (venstre panel). I den samme prøve kohorte, DLC1 var signifikant nedreguleret i HCC i forhold til NT væv (højre panel).

P

værdier fra Wilcoxon matchede par test. blev observeret (B) en omvendt korrelation mellem EZH2 og DLC1 ekspression i en delmængde af HCC prøver uden DLC1 promotor methylering. Expression niveau af EZH2 og DLC1 i parrede-HCC prøver var repræsenteret ved ΔΔCt (T

(HPRT Ct -Gene af interesse Ct) -NT

(HPRT Ct – Gene af interesse Ct)). Lineær regressionsanalyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism5 (La Jolla, CA, USA). (C) EZH2 opregulering (venstre panel) og samtidig DLC1 nedregulering (højre panel) blev konsekvent observeret i de tumorform væv af forskellige kræftformer, herunder lunge [32], bryst [33], prostata [34] og i æggestokkene [35] kræftformer. Expression data og

P

værdier DLC1 og EZH2 på flere typer kræft blev opnået fra Oncomine microarray database. Flydende stænger blev vist for at illustrere minimum, median og maksimum normaliserede udtryk enheder i ikke-tumorform (NT) og tumorform (T) væv.

DLC1 er synergistisk bragt til tavshed af H3K27me3 kun når dens promoter DNA er delvist methylerede

Da flere epigenetiske undertrykkende machineries er tæt forbundet til at etablere en mindre eftergivende kromatin miljø at undertrykke gentranskription [36,37], vi søgte at påvise kombinatoriske effekten af ​​forskellige epigenetiske machineries kontrollere DLC1 udtryk. MHCC97L og SMMC-7721 celler blev behandlet med DZNep sammen med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) og Trichostatin A (TSA), som er velkarakteriserede DNA methylering og histonacetylering inhibitorer, henholdsvis. Mens behandling af DZNep, 5-Aza-dC og TSA individuelt forhøjet udtryk DLC1, kombineret behandling af tre lægemidler synergistisk restaureret DLC1 udtryk i MHCC97L celler (figur 4A). Men den co-behandling i SMMC-7721 celler ikke viser yderligere forøgelse DLC1 ekspression sammenlignet med 5-aza-dC alene (figur 4B), hvilket betyder, at DNA-methylering var en fremherskende epigenetisk mekanisme til silencing DLC1 i denne cellelinie.

DLC1 udtryk blev synergistisk restaureret på DZNep, 5-Aza-dC og TSA behandling i MHCC97L men ikke SMMC-7721 celler.

(A) Kombinatorisk epigenetisk narkotikabehandling i MHCC97L celler med 10 pM 5-Aza-dC, 0,25 mikrogram /ml TSA og 10 pM DZNep inducerede den mest robuste DLC1 re-udtryk end en enkelt eller dobbelt epigenetisk narkotika behandling. DZNep og 5-aza-dC behandling blev udført i 72 timer. TSA blev enten tilsat til celler alene eller sammen med andre lægemidler i de sidste 24 timer af behandlingen. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (B) Tilsætning af DZNep i SMMC-7721 celler ikke længere fremkalde DLC1 re-udtryk, når sammenlignet med 5-Aza-dC og TSA dual behandling. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg.

DZNep behandling forstyrrer aktincytoskelet at hæmme HCC celle migration

DLC1 /Rho /ROCK vej er afgørende for at regulere korrekt cytoskelet remodeling og cellemotilitet. Vores proceeding fund tyder på, at EZH2 er involveret i at undertrykke DLC1 vi derfor yderligere testet, om DZNep behandling kunne undertrykke

in vitro

HCC migration. DZNep behandling ved 1 uM i 48 timer, hvilket viste minimal cytotoksisk effekt (Supplerende figur S2), effektivt inhiberede cellemigration i MHCC97L celler som påvist ved Transwell migration assay (figur 5A). DZNep behandlede celler viste også afskaffe ordentlig aktincytoskelettet netværk, når undersøgt under scanningselektronmikroskop (figur 5B) og immunofluorescens-farvning (figur 5C). Disse celle morfologiske ændringer induceret af behandling med DZNep meget lignede dem af DLC1-induceret celle cytoskeletal sammenbrud og celle svind [21], hvilket betyder, at DZNep kan hæmme celle migration via forstyrrende DLC1 /ROCK vej og forårsagede betydelig aktincytoskelettet forvaltningsmæssigt.

behandling af DZNep hæmmede HCC cellevandring gennem afbrydelse af aktincytoskelettet.

(A) DZNep behandling effektivt afskaffet MHCC97L celle vandrende evne. Før cellemigrationsassay blev celler behandlet med 1 pM DZNep i 48 timer. Mock og DZNep-behandlede celler blev derefter underkastet cellemigrationsassay hjælp Transwell apparat. Repræsentative billeder af tre uafhængige forsøg blev vist.

P

-værdier opnået fra

t

-test. (B) DZNep behandling undertrykt dannelse af filopodia (røde pile) og lamellipodia (blå pile) som illustreret ved scanningselektronmikroskopi. Billeder (2000x forstørrelse) blev taget med et Hitachi S-4800 FEG Scanning Electron Microscope. (C) DZNep behandling forringet aktincytoskelettet og forårsagede celle krympning i MHCC97L celler. Stress fiber blev farvet med FITC-konjugeret phalloidin og fokale sammenvoksninger blev farvet med anti-paxillin antistof. Kerner blev modfarvet med DAPI. Mock-behandlede celler viste organiserede bundter af stress fibre og godt fastgjort paxillin. DZNep-behandlede celler skrumpede og tabt ordentlig aktincytoskelettet netværk. Billeder (100x forstørrelse) blev taget til fange af en Leica Q550CW fluorescens mikroskop (Leica, Wetzler, Tyskland).

Diskussion

En vigtig pro-metastatisk rolle EZH2 i kræft er via epigenetiske nedregulering af tumor og metastase-gener [8-12]. H3K27me3 er den bedst karakteriserede EZH2-medieret histon modifikation i pattedyrs epigenetiske system. I den foreliggende undersøgelse, giver vi dokumentation for, at EZH2-medieret H3K27me3 er involveret i epigenetiske undertrykkelse af DLC1 under HCC udvikling. Interessant, fra flere publicerede genom-dækkende data for Polycomb gruppe (PcG) target genkortlægning i humane embryonale stamceller (HES) celler, vi også bemærket, at DLC1 er en kandidat PcG-reguleret gen i den tidlige udviklingsstadie (Supplerende figur S3). I hES celler er DLC1 promotoren besat af SUZ12, som er forbundet med EZH2 til dannelse af PRC2 ved mediering H3K27me3 og transskription undertrykkelse [38]. Desuden er det DLC1 promotoren også markeret med H3K27me3 [39] og H3K4me3 [40], som udgør den bivalente kromatin underskrift PCG mål [41]. Denne bivalent kromatin signatur, der involverer H3K27me3-lyddæmpning og H3K4me3-aktiverende histon modifikationer, giver gener af udviklingsmæssig betydning og gener, der er nødvendige for stemness vedligeholdelse skal klar i en klar-til-transskribere tilstand, indtil differentiering [41,42]. DLC1 er afgørende for fosterudviklingen [43] og muligvis har en rolle i slægt specifikation [44]. DLC1 knockout mus er embryonale dødelig [43]. Dog er DLC1 allestedsnærværende transskriberet i voksent væv [14], hvilket indebærer, at PcG lyddæmpende virkning er blevet lettet i differentierede somatiske celler. Ved onkogenese, er det muligt, at DLC1 genvinder sin embryonale PcG mærkning som et resultat af EZH2 opregulering. På molekylært niveau, demonstrerede vi, at DLC1 blev co-reguleret af EZH2-medieret H3K27me3, DNA-methylering og histondeacetylering i HCC-celler. Imidlertid blev samregulering mellem de tre epigenetiske mekanismer på DLC1 kun observeret, når dets promotor blev delvist methyleret (såsom i MHCC97L celler). Når DLC1 promotoren blev tæt methyleret (såsom i SMMC-7721 celler), H3K27me3 var til stede og DNA-methylering var nøglen undertrykkende mekanisme med beskedne deltagelse af histondeacetylering. Denne observation kan afspejle krydstale af EZH2 lyddæmpning og DNA methylering i et tidligere epigenetisk undertrykkelse af tumorsuppressorgener før eventuel udskiftning af H3K27me3 lyddæmpning af den stabile DNA methylering maskiner [45,46]. Faktisk vores fund, at DLC1 er en PcG-reguleret mål og dens efterfølgende epigenetisk inaktivering under malign progression er også i overensstemmelse med den nyligt foreslåede model på PcG mærkning af gener i ES-celler er disponeret for

de novo

kræft specifikke DNA methylering [45,46].

Farmakologisk målretning af deregulerede epigenetiske proteiner fremstår som en attraktiv tilgang i kræftbehandling [47,48]. DZNep har vist sig at udrydde tumorfremkaldende HCC-celler i nøgne mus implanteret med HCC [49], inducere apoptose i brystcancerceller [29] og målrette humant akut myeloid leukæmi hos mus model ved anvendelse i kombination med panobinostat [50]. Imidlertid har metastase undertrykkende virkning af DZNep aldrig blevet evalueret. Vores resultater viser, at DZNep inhibere EZH2 ekspression og kan yderligere fungere som en potent inhibitor metastase gennem forstyrre aktincytoskelettet organisation. En detaljeret karakteristik af DZNep at undertrykke HCC tumorvækst og progression in vivo er stadig berettiget til at undersøge det terapeutiske potentiale DZNep som kræft behandlingsregime.

Vi har tidligere vist, at EHZ2 fremmer HCC metastaser dels gennem epigenetisk undertrykkelse af flere Rho /ROCK signalering målretning miRNA [13]. For eksempel MIR-139, der er målrettet ROCK2 [22] var ofte nedreguleret i human HCC af EZH2-medieret H3K27me3 [13]. I denne undersøgelse, vi desuden vist, at DLC1, nøglen up-stream regulator af Rho /ROCK vej, er også bragt til tavshed af EZH2. Alt i alt, vores resultater optrævle en stram og flere lag regulering af DLC1 /Rho /ROCK signalering ved EZH2, som kan understøtte en kritisk epigenetisk drevet begivenhed for at fremme kræft metastaser.

Støtte Information

Figur S1.

Forbigående overekspression af GFP-EZH2, hvilket bekræftes af immunoblotting (venstre panal) og qPCR (højre panal), augmented de EZH2 og H3K27me3 niveauer i Huh-7 celler. Anti-EZH2 antistof (# 3147, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) detekteres både endogene og GFP-EZH2 fusionsproteinet i immunoblot. Protein og RNA blev høstet seks dage efter transfektion

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068226.s001

(TIF)

Figur S2.

MHCC97L celler behandlet med 1 pM DZNep i 48 timer blev undersøgt for deres levedygtighed ved trypanblåt farvning før cellemigrationsassay. Mock og DZNep behandlede celler blev ligeledes levedygtige

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068226.s002

(TIF)

Figur S3.

Offentligt tilgængelige chip-sekventering og chip-on-chip-database blev analyseret for at give et fingerpeg om DLC1 kromatin status i humane embryonale stamceller. DLC1 locus viste sig at være præget af H3K27me3 (Zhao et al., 2007) og H3K4me3 (Pan et al., 2007) i uafhængige undersøgelser. Desuden blev også fundet DLC1 promotor at være bundet af SUZ12, som er et centralt element i Polycomb Undertrykkende Complex 2.

doi (Lee et al, 2006).: 10,1371 /journal.pone.0068226.s003

(TIF)