PLoS ONE: Polymorphisms på 8q24 er forbundet med risiko for lungekræft og overlevelse i Han Chinese

Abstrakt

kromosom 8q24 er almindeligt forstærkes i mange typer af kræft, især lungekræft. Polymorfier i denne region er associeret med risiko for forskellige kræftformer. At undersøge sammenhængen mellem tre enkelt nukleotid polymorfier (SNP) (rs1447295, rs16901979 og rs6983267) på 8q24 og risikoen for lungekræft, vi gennemførte en forening studie i to Han kinesiske populationer: én population var fra Zhejiang-provinsen (576 case patienter og 576 kontrol fag), mens den anden var fra Fujian-provinsen (576 case patienter og 576 kontrolpersoner). Vi fandt, at rs6983267 signifikant var forbundet med en øget risiko for lungekræft i begge populationer. Sammenlignet med TT genotypen blev GG genotype forbundet med en signifikant 1,555 gange øget risiko for lungekræft [95% konfidensinterval (CI) 1,218-1,986,

P

= 4,0 × 10

-4 ]. Denne effekt var mere udtalt hos ikke-rygere [odds ratio (OR) = 2,366, 95% CI 1,605-3,488,

P

= 1,4 × 10

-5]. Analyser stratificeret ved histologi afslørede, at rs6983267 GG genotype blev de fleste forbundet med patienter med andre histologiske typer (OR = 3,012, 95% CI 1,675-5,417,

P

= 2,3 × 10

-4). AA genotype rs1447295 var forbundet med øget risiko for adenokarcinom i forhold til CC-genotypen (OR = 2,260, 95% CI 1,174-4,353,

P

= 0,015). Endvidere blev GG genotype rs6983267 forbundet med dårligere overlevelse i Zhejiang (hazard ratio (HR) = 1,646, 95% CI 1,099-2,464,

P

= 0,016). Ingen forening blev observeret for rs16901979. Disse resultater tyder på, at genetiske variationer på 8q24 kan spille væsentlige roller i udviklingen og progressionen af ​​lungekræft

Henvisning:. Zhang X, Chen Q, han C, Mao W, Zhang L, Xu X, et al. (2012) Polymorphisms på 8q24 er forbundet med risiko for lungekræft og overlevelse i han-kinesere. PLoS ONE 7 (7): e41930. doi: 10,1371 /journal.pone.0041930

Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, England

Modtaget: May 10, 2012; Accepteret: 29 Jun 2012; Publiceret: 27 juli, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af bevilling fra Taizhou Videnskab og Teknologi agenturet (111ky07-7). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft fortsætter med at være den førende årsag til kræft dødsfald i både mænd og kvinder over hele verden. I Kina, lungekræft udgjorde 536,407 nye tilfælde af kræft og 475,768 dødsfald registreret i 2005 [1]. I de seneste årtier har forekomst og dødelighed af lungekræft markant forøget på grund af befolkningens aldring og vedvarende stigning i forbruget af tobak i Kina [1], [2], [3], [4]. Selvom cigaretrygning er den vigtigste årsag til lungekræft og bidrager til mere end 80% af tilfældene [5], kun en lille brøkdel af rygere udvikler lungekræft. Dette fund tyder på, at genetiske faktorer også påvirke risikoen for lungekræft. Selv om der er gjort en indsats for at identificere de genetiske faktorer for lungekræft, at den aktuelle viden vurdere risikoen for lungekræft er stadig begrænset.

For nylig har nogle genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) fandt, at varianter på kromosom 8q24 er relateret risikoen for flere kræftformer, herunder bryst-, prostata-, blære-, tyktarms- og ovariecancer, mellem flere studiepopulationer [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12 ], [13], [14], [15], [16], [17]. Desuden varianter på 8q24 har vist sig at være associeret med modtagelighed for øvre gastrointestinal cancer [18], [19], [20], osteosarkom [21], thyroidcancer [22], [23], [24], og hjernecancer [25]. Denne region strækker sig over cirka 600 kb og betragtes som et gen-fattigt område, med relativt få forudsagte gener, herunder DQ486513, CB104826, og DQ515897 samt pseudogen POU5F1P1. Proto-onkogen v-myc myelocytomatosis viral onkogen homolog (aviær) (MYC) er blevet bestemt til at være den cancerrelateret gen nærmest regionen associeret med cancer i GWAS. Transkriptionelle forstærkere i denne region har vist sig at interagere fysisk med MYC promotor [26], [27] og potentielt blive påvirket af cancer-associerede varianter [28].

Tre tilstødende genomiske blokke (regioner 1-3 ) på 8q24 er blevet associeret med prostatacancer risiko [29]. De væsentligste single-polymorfier (SNP) er rs1447295 i område 1, rs16901979 i område 2, og rs6983267 i region 3 [29]. Disse SNP’er og yderligere 8q24 varianter er blevet valideret ved efterfølgende associationsstudier. Desuden er fundet, disse SNP’er at være forbundet med andre kræftformer [8], [9], [18], [19], [20], [21], [30]. Siden 8q24 kromosomale område almindeligvis forstærkes i lungekræft væv [31], [32], [33], [34], genetiske varianter på 8q24 kan være forbundet med lungekræft modtagelighed. Endvidere kan SNPs på 8q24 påvirke ekspressionsniveauerne af cancer-relaterede gener [26], [27], [35], som menes at spille roller i lungekræft carcinogenese. I den foreliggende undersøgelse, valgte vi en SNP fra hver region for at evaluere potentialet sammenslutning af disse SNPs med lungekræft hos han-kinesere.

Resultater

befolkningskarakteristika

De kendetegn af patienterne lungekræft og kontrolpersoner tilmeldt i denne undersøgelse er sammenfattet i tabel 1. Flere mænd end kvinder blev blandt case patienter og kontrolpersoner, men køn forskelle mellem disse grupper var ikke signifikant (

P

0,05). Histologisk type lungekræft mellem to patientgrupper afveg ikke signifikant (

P

0,05), men blev påvist signifikante forskelle i scenen og bedømmelse (alle

P

0,05).

Association analyse af rs1447295, rs16901979, og rs6983267 på 8q24

genotypen fordelinger af de SNPs rs1447295, rs16901979 og rs6983267 var i Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) i begge tilfælde og kontroller. I testen sæt, frekvensen af ​​rs6983267 GG-genotypen var markant højere i lungekræft patienter (24,9%) end i kontrolindivider (20,5%) (tabel 2). Den GG-genotypen var forbundet med en let øget risiko [odds ratio (OR) = 1,532, 95% konfidensinterval (CI) 1,090-2,153,

P

= 0,014]. Ligeledes i valideringen sæt blev rs6983267 GG genotype forbundet med en 1,591-fold stigning i risikoen for lungekræft (

P

= 0,010). Selvom det ikke er statistisk signifikant, at rs6983267 GT genotypen også øget risiko for lungekræft (

P

= 0,062). Men der var ingen signifikante forskelle mellem de resterende to SNPs (rs1447295 og rs16901979) og lungekræft i begge populationer. Den endelige poolet analyse viste, at rs6983267 GG-genotypen (OR = 1,555, 95% CI = 1,218-1,986,

P

= 4,0 × 10

-4) og GT genotype (OR = 1,311, 95% CI = 1,066-1,613,

P

= 0,01) var forbundet med signifikant øget risiko for lungekræft. Efter GG og GT-genotyper blev kombineret, forskellen forblev statistisk signifikant (OR = 1,386, 95% konfidensinterval = 1,141-1,684,

P

= 0,001). Desuden foreningerne fortsat betydelig, selv efter Bonferroni korrektion (dvs.

P

0,05 /3 = 0,0167).

Analyserne stratificeret ved histologi anvender fælles case-kontrol sæt viste at rs1447295 AA-genotypen samt rs6983267 GG og GT genotyper blev associeret med en svag men signifikant stigning i risikoen for adenokarcinom justeret for alder, køn og rygning status (OR = 2.260, 95% CI 1,174-4,353,

P

= 0,015, OR = 1,330, 95% CI 1,003-1,763,

P

= 0,048, OR = 1,327, 95% CI 1,049-1,679,

P

= 0,018, henholdsvis) (tabel 3). Den rs6983267 GG genotype var forbundet med planocellulært karcinom risiko (OR = 1,775, 95%

CI

1,201-2,625,

P

= 0,004). Desuden blev personer med rs6983267 GG eller GT-genotype på signifikant øget risiko for andre typer af lungekræft (OR = 3,012, 95% CI 1,675-5,417,

P

= 2,3 × 10

-4 ELLER = 1,986, 95% CI 1,157-3,408,

P

= 0,013, henholdsvis), herunder adenosquamøst carcinom og udifferentieret carcinom. Imidlertid blev ingen sammenhæng observeret for rs16901979.

Vi undersøgte yderligere sammenhængen mellem de tre SNPs og lungekræft stratificeret ved at ryge adfærd i alle personer (tabel 4). Den rs6983267 GG-genotypen var signifikant forbundet med højere risiko for lungekræft hos ikke-rygere, men ingen sammenhæng blev observeret i tidligere og nuværende rygere. Desuden var der en lille, men signifikant forskel i hyppigheden af ​​rs6983267 GT genotype mellem cases og kontroller i de nuværende rygere (OR = 1,446, 95% CI 1,032-2,027,

P

= 0,032). Der var imidlertid ingen signifikant interaktion mellem rygning status og genotype i lungekræft modtagelighed. Da antallet af tidligere rygere i denne undersøgelse var lille og frekvensen af ​​rs1447295 AA-genotypen var lav, vi kombineret AA og AC genotypegrupperne i én. Logistik analyse afslørede, at AA og AC kombineret havde en lavere risiko for lungekræft end CC-genotypen (OR = 0,478, 95% CI 0,254-0,898,

P

= 0,022). Ingen anden signifikant sammenhæng blev observeret mellem rs16901979 og risikoen for lungekræft, stratificeret af rygning status.

Foreningen af ​​rs1447295, rs16901979, og rs6983267 med overlevelse

Alle patienter med lungekræft blev inkluderet i overlevelse analyse. For rs6983267, blev en forening med lungekræft overlevelse observeret i Zhejiang befolkning. Personer med GG genotypen havde en median overlevelsestid (MST) på 17,6 måneder, dem med GT genotypen havde en MST på 18,6 måneder, og dem med TT genotypen havde en MST på 24,4 måneder (log-rank test,

P

= 0,036) (figur 1A). I Cox proportional hazards model, fandt vi, at hazard ratio (HR) var signifikant højere for personer med GG genotype sammenlignet med dem med TT genotype efter korrigeret for alder, køn, rygning status, tumor stadie, histologi og histologisk bedømmelse ( HR = 1,646, 95% CI 1,099-2,464,

P

= 0,016) (tabel 5). Overlevelsen var dårlig, især for patienter med stadie III eller IV tumor (HR = 1,993, 95% CI 1,128-3,521,

P

= 0,018) (figur 1B). Ingen andre SNP viste sig at være forbundet med overlevelse. Ingen sammenhæng med overlevelse i Fujian befolkning blev observeret

A:. Alle lungekræftpatienter. B:. Patienter med stadium III-IV tumorer

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgt, om SNPs på kromosom 8q24 relateret til følsomhed over for bryst-, prostata-, blære- , kolorektal, skjoldbruskkirtel og ovariecancer [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16 ], [23] er også forbundet med risiko for lungekræft i Han kinesiske befolkningsgrupper. Vi fandt, at GG genotype rs6983267 var signifikant forbundet med øget risiko for lungekræft og nedsat overlevelse i han-kinesere.

8q24 aberration er en hyppig begivenhed i lungekræft [31], [32], [33] , [34]. MYC, lokaliseret ved 8q24.1, er en veletableret onkogen involveret i cellevækst, proliferation, differentiering og apoptose. Dereguleret overekspression af MYC er ansvarlig for en lang række humane cancere. Den rs6983267 ligger 335 kb opstrøms for MYC-genet. Nylige undersøgelser har vist, at rs6983267 kort til transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2) motiv og former langtrækkende interaktioner med MYC [27], [36]. Sammenlignet med T allel af rs6983267 har G-allelen blevet rapporteret at have stærkere TCF7L2 binding in vitro og in vivo og kan forbedre Wnt aktivitet [36], [37]. Endvidere har mange undersøgelser vist, at GG genotype rs6983267 er forbundet med en væsentlig højere risiko for flere kræftformer [9], [30], [38]. Park et al. [20] rapporterede ingen sammenhæng mellem rs6983267 (OR = 1,02,

P

= 0,80) og lungekræft, men fandt, at GG genotypen øget risiko for lungekræft i nogensinde-rygere (OR = 1,45,

P

= 0,024). Wokolorczyk et al. [38] undersøgte 738 lungekræftpatienter og 1910 kontrolpersoner og fandt, at rs6983267 GG genotypen ikke var signifikant associeret med risikoen for lungekræft sammenlignet med TT genotypen (OR = 0,98,

P

= 0,9). Men denne forening ikke er blevet vurderet i kinesisk,. I denne undersøgelse undersøgte vi tre SNPs (rs1447295, rs16901979 og rs6983267) og fandt, at kun rs6983267 var signifikant associeret med en øget risiko for lungekræft hos han-kinesere. Disse fund var forskellig fra tidligere undersøgelser, hvor der ikke var nogen signifikante korrelationer mellem rs6983267 og lungecancer [20], [38]. Da effekten af ​​en lav penetrans modtagelighed gen på risiko for sygdom kan ændres af andre gener, samt af miljømæssige faktorer, kan etniske forskelle i genetiske baggrunde og forskellige risikofaktorer forklare, til en vis grad, de afvigende resultater. Endvidere rs6983267 var mest signifikant associeret med andre histologiske typer lungekræft, efterfulgt af pladecellecarcinom, og svagt, men signifikant associeret med adenocarcinom. Disse resultater viste, at forskellige mekanismer kan eksistere i den molekylære patogenese af de forskellige histologiske typer af lungekræft.

Udsættelse for tobak kræftfremkaldende stoffer kan fremkalde alvorlige DNA-beskadigelse og således fremme tumordannelse. I denne undersøgelse fandt vi, at den øgede risiko for lungekræft med rs6983267 GG genotype var mere udtalt blandt ikke-rygere, mens ingen signifikante korrelationer blev fundet i strøm-og tidligere rygere. En mulig forklaring på dette er, at aldrig-rygere kan være mere tilbøjelige til at have været udsat for ukendte risikofaktorer forbundet med lungekræft, såsom miljøforurening. Der kan eksistere forskellige carcinogenese mekanismer mellem aldrig og strøm-/former- rygere. Vores resultat er forskellig fra tidligere undersøgelse, hvor rs6983267 GG var en risikofaktor i stadigt ryger [20]. Forskellige studier befolkninger og analytiske tilgange kunne forklare de modstridende resultater. Desuden fandt vi en signifikant association af A allel af rs1447295 med en lav risiko for lungekræft i gamle-rygere. Park et al fandt imidlertid, at denne allel var forbundet med en højere risiko for leverkræft i nogensinde-rygere [20]. Da antallet af tidligere rygere i denne population var meget lille til en case-kontrol forening undersøgelse, vores resultater på en allel af rs1447295 er mest sandsynligt falsk positiv på grund af flere sammenligninger. Der bør udvises forsigtighed ved fortolkning af dette resultat, selv om det er statistisk signifikant. er behov for yderligere undersøgelser med større antal emner for at bekræfte disse resultater.

MYC forstærkning har vist sig at være korreleret med dårlig prognose for patienter med lungecancer [31], [32], [34]. Da risikoen allel rs6983267 G har vist sig at have en stærkere affinitet til TCF7L2 og kan inducere forøget MYC-ekspression [27], [36], rs6983267 kan være forbundet med overlevelse hos patienter med lungecancer. I denne undersøgelse fandt vi, at rs6983267 GG-genotypen var forbundet med markant dårligere overlevelse i Zhejiang befolkning. Denne effekt blev mere udtalt hos patienter med stadie III eller IV tumor. Dette resultat er i overensstemmelse med de funktionelle konsekvenser af denne polymorfi. I modsætning hertil blev der ingen sammenhæng fundet mellem rs6983267 og overlevelse i Fujian befolkning. En del af denne forskel kan forklares ved de forskellige procentdele af sygdom scenen og histologisk klasse samt de forskellige behandlingsmetoder, der anvendes. Cicek et al. undersøgte 393 patienter med tyktarmskræft og fandt ingen sammenhæng mellem rs6983267 og overlevelse [39]. Imidlertid Dai et al. undersøgte 170 patienter med colorectal cancer og fundet, at T-allelen var forbundet med ringere overlevelse [40]. Disse resultater antyder, at en mere kompleks eller tumorspecifik forhold kan eksistere. Som vores undersøgelse var begrænset til han-kinesere med lungekræft, kan resultaterne ikke generaliseres til andre etniske grupper. Desuden prøvestørrelsen for overlevelse analyse var relativt lille, hvorved spørge forsigtig fortolkning af vores resultater. Yderligere forskning i en større befolkningsgruppe er nødvendigt at præcisere dette forhold.

Sammenfattende resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at SNP’er på 8q24 er forbundet med modtagelighed for lungekræft i han-kinesere. Desuden blev rs6983267 GG genotype forbundet med dårlig overlevelse i Zhejiang population. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der undersøgte potentielle associationer mellem SNP’er på 8q24 og lungekræft i en population fra East Kina. Yderligere store studier er berettiget til at forbedre vores forståelse af bidragene fra genetiske faktorer til lungekræft.

Materialer og metoder

Emner

I denne undersøgelse har vi udført en forening undersøgelse i to uafhængige sæt af emner. Testen sæt omfattede 548 lungekræftpatienter og 556 kontrolpersoner. Case patienter havde en diagnose af lungekræft bekræftet på histologi og blev rekrutteret fra Taizhou Central Hospital, Zhejiang, mellem 2003 og 2010. kræft-fri kontrolpersoner var hospital besøgende, der kom til sundhedsundersøgelsen klinikken for en årlig check-up mellem 2007 og 2010. validering sæt bestod af 453 lungekræftpatienter og 507 kontrolpersoner fra Fujian-provinsen. Case patienter var konsekutive patienter med histologisk bekræftet lungekræft indskrevet fra Fuzhou Pulmonal Hospital mellem 2008 og 2010. kontrolpersoner var kræft-fri individer udvalgt fra en pulje af raske frivillige, der besøgte hospitalet i perioden 2008-2010. Epidemiologiske data blev indsamlet af uddannede interviewere, der ikke var klar over de gruppeopgaver anvendelse af en specifik standardiseret spørgeskema for at få detaljerede oplysninger om deltagerne demografiske faktorer, personlige vaner, medicinsk historie, familie historie af kræft, samt historie af erhvervsmæssig og miljømæssig eksponering . Undersøgelsespersoner blev klassificeret i tre grupper baseret på deres rygning status. Aldrig-rygere var dem, der angav, at de havde røget mindre end 100 cigaretter i deres levetid, og var ikke nuværende-rygere. Rygere blev klassificeret i tidligere rygere og nuværende rygere. Tidligere rygere var dem, der rapporterede at ryge mindst 100 cigaretter i løbet af deres levetid, og var ikke nuværende-rygere, mens de nuværende rygere var dem, der rapporterede, at de stadig var rygning på tidspunktet for deres lungekræft diagnose. Enkeltpersoner er kendt for at have en familie historie af kræft, var en historie af alle andre end lungekræft, eller spredt kræft kræft fra andre eller ukendte oprindelser udelukket. De kontrolpersoner var frekvens matchet til case patienter på grund af køn og alder (± 5 år). Alle tilfælde patienter og kontrolpersoner var ubeslægtede etniske han-kinesere. Denne undersøgelse blev godkendt af etiske komiteer i Taizhou Central Hospital og Fuzhou Pulmonal Hospital, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere før ind i studiet.

Vores endepunkt var samlet overlevelse fra den oprindelige histologiske diagnose. Patienter, der var i live eller tabt til opfølgning blev censureret på datoen for sidste kontakt. De, der døde af andre årsager blev censureret på datoen for deres død. Desuden patienter tabte til opfølgning på det første år blev udelukket fra analysen.

Genotypning

Blodprøver blev indsamlet fra alle undersøgelsens deltagere. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af Universal Genomisk DNA Extraction Kit Version 3.0 (Takara, Dalian, Kina) ifølge fabrikantens protokol, og DNA-prøver blev opbevaret ved -20 ° C.

Vi valgte den stærkeste single-association SNPs fra hver kromosomale region: rs1447295 fra område 1, rs16901979 fra region 2, og rs6983267 fra region 3. Genotypebestemmelse blev udført ved polymerasekædereaktion-ligering påvisning (PCR-LDR) metode. Primere blev designet af software Primer 3 (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). De tre primerpar er som følgende: 1) rs1447295: 5′-GCCTACGCCTACTCCTGGTCT-3 ‘(fremad) og 5′-CTCCCAGATTTTCCCATACCC-3′ (revers); 2) rs16901979: 5’-AGTGTGGGGTCTTTGTTGTGG-3 ‘(fremad) og 5’CAGCAGTCTCCCTGTCTTTGG-3’ (tilbage); 3) rs6983267: 5’ATGAAGGCGTCGTCCAAATGA -3 «(fremad) og 5’TTGGCTGGCACTGTCTGTATA -3« (tilbage). Amplifikationsreaktioner blev udført i et endeligt reaktionsvolumen på 15 pi indeholdende 0,3 mmol /l af hver deoxynucleosidtriphosphat, 10 mmol /L Tris-HCI, 50 mmol /L KCI, 2 mmol /l MgCl2, 20% Q-opløsning (Qiagen, Hilden, Tyskland), 0,16 pmol /l af hver primer, 10 ng genomisk DNA, og 1 U Taq (Takara, Dalian, Kina). De cykling parametre var: 94 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 10 cyklusser ved 94 ° C i 30 s, 64 ° C i 30 s med en 0,5 ° C formindske af annealingtemperaturen per cyklus og 72 ° C i 30 s, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 s, 59 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, og en endelig ekstension ved 72 ° C i 5 min. Efter amplifikation blev PCR produkter inkuberet med 2 U reje-alkalisk phosophatase (Fermentas, Vilnius) og 4 U exonuclease I (Fermentas, Vilnius) ved 37 ° C i 1 time, og derefter denatureret ved 95 ° C i 10 min .

LDR primere var: 1) rs1447295: 5′-GTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAA-3 ‘(A specifik primer), 5′-TTTGTGCCATTGGGGAGGTATGTAAAAC-3′ (C specifik primer) og 5’-GTGCTATGGAAAAAAAGCAACAGGA-FAM-3 ‘(fælles FAM mærket 3′-enden primer); 2) rs16901979: 5’-TTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATA-3 ‘(A specifik primer), 5′-TTTTTTTTGTTAATGATTTAGCATTACTTATC-3′ (C specifik primer) og 5’-TCTGGCAAATGGTATTTTTGAGATATTT-FAM-3 ‘(fælles FAM mærket 3′-enden primer); 3) rs6983267: 5’-TTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGG-3 ‘(G specifik primer), 5′-TTTTTTTTTTTTCCTTTGAGCTCAGCAGATGAAAGT-3′ (T specifik primer) og 5’-CACTGAGAAAAGTACAAAGAATTTTTTTTTTT-FAM-3 ‘(fælles FAM mærket 3’-enden primer). En blanding indeholdende 7,5 pmol af hver fælles FAM mærket LDR-primer blev phosphoryleret i et 15-ul kinase reaktionsblanding indeholdende 1 x T4 ligasepuffer og 10 E T4 kinase (Takara, Dalian, Kina). Blandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time, efterfulgt af 10 minutter ved 65 ° C og opbevaring ved 4 ° C. LDRs blev udført i et slutvolumen på 20 pi herunder 9 pi oprensede PCR-produkt, 1 × Taq DNA-ligasepuffer, 250 fmol af hvert LDR primer, 8 U Taq-DNA-ligase (New England Biolabs, Beverly, Mass, USA). LDR parametre var følgende: 30 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C og 4 minutter ved 55 ° C. LDR blev analyseret på ABI 3730 DNA analysator (Applied Biosystems, CA, USA).

Ninety seks tilfældigt udvalgte prøver blev revurderet ved DNA-sekventering for at bekræfte nøjagtigheden af ​​PCR-ligering påvisningsreaktion genotypebestemmelse metode, den resultater der var i overensstemmelse med de genotyper identificeret ved direkte sekventering. Desuden blev 96 tilfældigt udvalgte prøver genotypebestemmes i to eksemplarer og gav de samme resultater (100% reproducerbarhed).

Statistisk analyse

Midlerne til kvantitative variabler blev sammenlignet ved anvendelse Students

t

test. Fishers eksakte Chi-square test blev anvendt til at sammenligne kategoriske variabler mellem case patienter og kontrolpersoner. HWE blev beregnet ved Chi-square test for goodness of fit i både patient og kontrolgrupper. Korrektion for multiple test blev udført ved hjælp af Bonferroni-metoden. For at vurdere forholdet mellem 3 SNPs og risikoen for lungekræft, blev den yderste periferi og deres 95% CIs estimeres ved multivariat logistisk regressionsanalyse, justeret med alder, køn og rygning status, for at vurdere forholdet mellem hver af de tre SNPs og risikoen for lungekræft. Overlevelse analyse blev udført under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden med log-rank test. Cox proportional hazards model blev også anvendt til at justere for alder, køn, rygning status, tumor stadium, histologi og histologisk bedømmelse.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle tests var to-sidet, og alle statistiske analyser blev udført med SPSS 17,0 softwarepakke (SPSS Inc., Chicago, USA).