PLoS ONE: EMAST er forbundet med en dårlig prognose i mikrosatelitter ustabilt metastatisk colorectal Cancer

Abstrakt

Formål

For at bestemme hyppigheden og prognostiske værdi af forhøjede mikrosatellit ændringer på udvalgte tetranukleotid gentagelser (EMAST ) i metastatisk kolorektal cancer (mCRC) patienter i relation til mikrosatellit instabilitet (MSI) status og MSH3- proteinekspression.

Materiale og metoder

hyppigheden af ​​EMAST blev evalueret i FRK patienter med MSI tumorer og mikrosatellit stabil (MSS) tumorer. En oversigt litteratur blev udført for at sammenligne hyppigheden af ​​EMAST i vores undersøgelse med eksisterende data. Immunhistokemi for MSH3- blev sammenlignet med EMAST status. Resultat blev undersøgt med hensyn til samlet overlevelse (OS) i FRK patienter med MSI og MSS tumorer.

Resultater

EMAST blev evalueret i 89 patienter med MSI tumorer (herunder 39 patienter med Lynch-syndrom) og 94 patienter med MSS tumorer. EMAST blev observeret i 45,9% (84 ud af 183) af de patienter, med en øget frekvens i MSI tumorer (79,8% versus 13,8%, p 0,001). Vi fandt ingen korrelation mellem EMAST og MSH3- proteinekspression. Der var ingen effekt af EMAST på prognosen hos patienter med MSS tumorer, men patienter med MSI /ikke-EMAST tumorer havde en signifikant bedre prognose end patienter med MSI /EMAST tumorer. (OS: HR 3,22, 95% CI 1,25-8,30)

Konklusion

Hyppigheden af ​​EMAST blev øget i FRK patienter med MSI tumorer, sammenlignet med MSS tumorer. Vore data tyder på, at tilstedeværelsen af ​​EMAST korrelerer med værre OS hos disse patienter. Der var ingen virkning af EMAST på prognosen af ​​patienter med MSS tumorer. En begrænsning af vores undersøgelse er det lille antal patienter i vores undergruppe analyse

Henvisning:. Venderbosch S, van Lent-van Vliet S, de Haan AFJ, Ligtenberg MJ, Goossens M, Punt CJA, et al. (2015) EMAST er forbundet med en dårlig prognose i mikrosatelitter ustabilt metastatisk colorectal cancer. PLoS ONE 10 (4): e0124538. doi: 10,1371 /journal.pone.0124538

Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: 27. juni, 2014, Accepteret: 15. marts 2015; Udgivet: 17 April, 2015

Copyright: © 2015 Venderbosch et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: På grund af etiske restriktioner, kan fås ved henvendelse til [email protected] relevante data

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra den hollandske Colorectal Cancer Group (DCCG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) carcinogenese er en flertrins proces, hvor forskellige veje er involveret, blandt hvilke mikrosatellit instabilitet (MSI) er vigtigt [1-3]. MSI er kendetegnet ved en mangelfuld fejlparringsreparationssystem, hvilket fører til udvikling af kræft gennem akkumulering af unrepaired rammeskift mutationer i simple gentagelsessekvenser eller mikrosatellitter [4]. Til dato flere mismatch repair (MMR) proteiner er blevet identificeret hos mennesker: MSH2, MSH3-, MSH6, MLH1 og PMS2. MSH2 danner en heterodimer med MSH6 eller MSH3-, der giver anledning til MutSα eller MutSβ henholdsvis [5]. MutSα genkender enkelt basis-pair misforhold og små indsættelse-deletion sløjfer (IDLs), mens MutSβ fortrinsvis genkender større misforhold og IDLs. Endvidere MLH1 og PMS2 danner MutLα, der virker som en molekylær matchmaker. Ud over den primære MMR defekt, kan sekundære tab af MMR-proteiner forekomme som en konsekvens af

MSH3-

MSH6

ramme skift mutationer fremmes af

MLH1

inaktivering [6, 7], eller på grund af MSH3- og MSH6 proteinnedbrydning i tumorer ikke udtryk for deres heterodimere partner MSH2 [8,9]. Som et resultat, kan enkelte eller kombinerede fejl i MMR underenheder (MutSα, MutSβ og MutL) variabelt grund for genetisk ustabilitet af MSI tumorer. Kønscellelinie ændringer af MMR-gener er årsag til MSI i Lynch syndrom patienter [10]. MSI er også observeret i 10-20% af patienter med sporadisk CRC, som regel på grund af promotor hypermethylering af

MLH1

gen [11,12]. MSI tumorer har særlige kendetegn, såsom placering i den proksimale colon, en høj forekomst af lymfatisk infiltrat, en dårligt differentieret, mucinøs eller signetring histologi [13]. MSI tumorer er forbundet med en gunstig prognose i tidlig fase tyktarmskræft [14].

En særlig form for MSI er observeret i flere typer af kræft og kaldes “forhøjet mikrosatellitmarkørerne ændringer på udvalgte tetranukleotid gentager« (EMAST) i modsætning til mono- og dinukleotid baseret ustabilitet i fælles MSI [15-20]. Kun få studier beskrive denne undertype i et lille antal CRC patienter [21-24]. EMAST har ikke været forbundet med væsentlige mangler i DNA mismatch reparation. Heterogene og reduceret protein udtryk for MSH3- blev observeret i forbindelse med EMAST i CRC [21-24]. Nyere rapporter tyder på, at MSH3- mangel er årsag til EMAST i humane CRC celler [25,26]. Forbindelsen mellem MSH3- og EMAST foreslår en erhvervet effekt, da ingen kønsceller mutation i

MSH3-

nogensinde er blevet demonstreret [4]. Der er en bred vifte i forekomsten af ​​EMAST er CRC og den biologiske betydning af EMAST i CRC er ikke klart. Kun en artikel beskrevet en forening med resultat for fase II /III CRC patienter. [27]

Kun begrænsede data vedrørende EMAST eller MSH3- udtryk i CRC patienter. I den aktuelle undersøgelse evaluerede vi hyppigheden af ​​EMAST i MSI og mikrosatellit stabile (MSS) CRC tumorer. Desuden har vi vurderet i en eksplorativ analyse rolle EMAST som prognostisk biomarkør i metastatiske CRC (FRK) patienter.

Materiale og metoder

patientpopulationer

Data blev stammer fra FRK patienter inkluderet i to store fase III studier: CAIRO (ClinicalTrials.gov NCT00312000) (n = 820) og CAIRO2 (n = 755) (ClinicalTrials.gov NCT00208546), hvoraf resultaterne tidligere er blevet offentliggjort [28,29 ]. Indsamling af formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) materiale af den primære tumor var en del af den oprindelige protokol i begge undersøgelser. For at bestemme hyppigheden og prognostiske værdi af EMAST i FRK patienter med MSI tumorer vi valgt 50 FRK patienter med MSI tumorer behandlet i begge CAIRO studier. Da MSI er relativt sjældne i mCRC vi kombineret patienterne i CAIRO (n = 19) og CAIRO2 (n = 31) undersøgelse. Ingen validering kohorte kunne vælges til MSI patienter. For yderligere at evaluere forholdet mellem EMAST og MSI, vi hentet 39 tumorer fra CRC patienter (anonyme prøver) med kendt Lynch syndrom (stadie I-IV) fra vores egen database (som er blevet oprettet i overensstemmelse retningslinjerne i den lokale medicinske etiske komité (Commissie Mensgebonden Onderzoek Radboudumc) med skriftligt informeret samtykke fra patienterne, hvorfra brug af væv er godkendt til denne undersøgelse). For at bestemme hyppigheden og prognostiske værdi af EMAST i FRK patienter med MSS tumorer vi valgt 54 patienter i CAIRO undersøgelse med sammenlignelige egenskaber (test gruppe). Patienter i forsøgsgruppen blev alle behandlet med first-line capecitabin-monoterapi i mindst 3 cykler, lokalisering af den primære tumor i colon eller recto- sigmoideum der blev resekteret, WHO performance score 0, normal baseline serum lactatdehydrogenase (LDH) koncentration, og ikke tidligere havde fået adjuverende kemoterapi. Derudover valgte vi tilfældigt 40 yderligere FRK patienter med MSS tumorer behandlet i samme CAIRO undersøgelsen som en validering gruppe. (Figur 1)

EMAST analyse

Genomisk DNA blev ekstraheret fire til otte manuelt mikrodissekeres 30 um sektion af FFPE væv af de primære tumorer. Områder der indeholder 50% tumorceller blev udvalgt ved mikroskopisk evaluering på en reference slide farvet med H Epitomics-en Abcam selskab, Burlingame, CA, USA), fortynding 1: 5000. To uafhængige efterforskere udførte scoring, og hvis det dias scoring var ikke entydig, udtalelse fra en tredje investigator (patolog IDN) var endelig. Farvningsmønster af MSH3- protein blev vurderet ved anvendelse af den normale epitel, stromale og inflammatoriske celler som intern kontrol. Lav MSH3- proteinekspression blev defineret som 85% brun farvning af celle kerner i tumorceller og høj MSH3- proteinekspression blev defineret som ≥85% brun farvning af celle kerner i tumorceller og ikke, hvis hverken tumor eller stromale celler viste MSH3- protein udtryk [21].

MSI, hypermethylering af MLH1 gen promotoren og BRAF status

for prøver af begge CAIRO studier, immunhistokemi (IHC) blev udført på FFPE væv med antistoffer mod MLH1, MSH2 , MSH6 og PMS2. Desuden blev MSI analyse udført hvor der var et fravær af MMR-proteinekspression eller tvetydige IHC resultater. MSI status blev bestemt ved hjælp af to mikrosatellitmarkører (BAT 25 og BAT 26). Hvis kun en af ​​disse markører viste ustabilitet, blev analysen udvidet med yderligere fire markører (BAT 40, D2S123, D5S346, og D17S250). En tumor blev defineret som MSI, hvis mindst to af de seks markører udviste ustabilitet eller MSS hvis ingen af ​​de markører viste ustabilitet. Tumorer med kun én af markørerne viser ustabilitet blev defineret som MSI-lav og indgår i MSS kategori. [30] Hypermethylering status for

MLH1

gen promotoren og

BRAF

V600E mutation status , blev vurderet som beskrevet tidligere [30-32]

Statistisk analyse

for EMAST analyse, blev patienterne opdelt i to kategorier:. EMAST og ikke-EMAST tumorer. Sammenhængen mellem EMAST og MSH3- proteinekspression blev undersøgt med en logistisk regressionsmodel med uafhængige faktorer gruppe og MSH3- udtryk. OS blev defineret som tiden fra datoen for randomisering til datoen for død uanset årsag. OS kurver blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af en Cox proportional hazard model. Alle tests var to-sidet og p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-versionen 9.2.

Litteratur søgestrategi, inklusionskriterier, og udtræk af data

Vi revideret litteraturen om hyppigheden af ​​EMAST i CRC patienter med MSI og MSS tumorer . En søgning blev gennemført af Medline, PubMed og Cochrane Library fra januar 1990 til april 2014 en engelsksproget begrænsning, ved hjælp af følgende søgetermer: EMAST, tetranukleotid gentage, i kombination med tyktarmskræft og endetarmskræft. Originale publikationer blev udvalgt, hvis abstrakte indeholdt data for patienter med EMAST. I tilfælde af dubletpublikationer, blev den seneste og /eller mest komplette undersøgelse omfattede. Publikationer blev udelukket, hvis hyppigheden af ​​EMAST var begrænset til enten patienter med MSI eller MSS tumorer.

Resultater

Forekomst af EMAST

Samlet set EMAST blev observeret blandt 45,9% af en i alt 183 tumorer (tabel 1). Hyppigheden af ​​EMAST var signifikant højere blandt patienter med MSI tumorer sammenlignet med MSS tumorer:. 79,8% sammenlignet med 13,8% (p 0,001)

Hos patienter med MSS /EMAST tumorer ustabilitet blev generelt vist ved 2 EMAST loci (69,2%, 9 ud af 13), mens patienter med MSI /EMAST tumorer ustabilitet blev ofte vist ved 4 (33,8%, 24 ud af 71), eller 5 (50,7%, 36 ud af 71) EMAST loci ( fig 2A). Den højeste frekvens af ustabilitet i EMAST tumorer blev påvist ved D20S82 locus (91,7%, 77 ud af 84), efterfulgt af MYCL1 locus (86,9%, 73 af 84), den D9S242 locus (84,5%, 71 af 84 ), den D8S321 locus (72,6%, 61 ud af 84) og D20S85 locus (65,5%, 55 ud af 84) (fig 2B).

EMAST og MSH3-

størstedelen af ​​FRK patienter (n = 381, 69,4%) havde en høj ekspression af MSH3- i tumorceller (figur 3). 21,1% af tumorer demonstreret nuklear heterogenitet ved ekspression af både positive og negative kerner upon MSH3- IHC-farvning (Fig 3A-3C). Både MSH3- udtryk og EMAST status blev kendt i 139 patienter. Heterogen eller høj MSH3- proteinekspression blev ikke korreleret til EMAST status (p = 0,088 og p = 0,856, henholdsvis).

heterogen MSH3- proteinekspression (A), påvises ved ekspression af både brun (positiv) og blå ( negative) kerner upon MSH3- IHC farvning. Lav MSH3- proteinekspression blev defineret som 85% brun farvning af celle kerner i tumorceller (B) og høj MSH3- proteinekspression blev defineret som ≥85% brun farvning af celle kerner i tumorceller (C)

Resultatet af patienter med MSI tumorer

patienter med MSI /EMAST tumorer var for det meste kvinder (52% mod 22%, p = 0,038) (tabel 2). Desuden blev EMAST tumorer oftere placeret over rectosigmoid område (93% mod 63%, p = 0,006).

Median OS var betydeligt værre for patienter med MSI /EMAST forhold til MSI /ikke- EMAST tumorer behandlet i begge CAIRO studier (11,4 versus 39,4 måneder henholdsvis HR 3,22, 95% CI 1,25-8,30) (tabel 3).

MSI /EMAST og relationen til MMR proteiner

fordelingen af ​​tab af MMR proteiner i FRK tumorer er sammenfattet i fig 4A. De fleste patienter med MSI tumorer viste tab af MLH1 og /eller PMS2 proteinekspression (72,0%, 36 ud af 50 patienter). Tab af MSH2 og /eller MSH6 proteinekspression blev fundet i 18,0% (9 ud af 50) af patienterne. Disse patienter vil sandsynligvis Lynch eller Lynch-lignende syndrom patienter. Kun 7,1% (3 ud af 42) af patienterne med en MSI /EMAST tumor viste tab af ekspression af MSH6 protein, sammenlignet med 62,5% (5 ud af 8) af patienter med MSI /ikke-EMAST tumorer.

(A). Procentdel af patienter med kendt Lynch syndrom og kønsceller mutation af de forskellige MSI generne, opdelt i patienter med MSI /EMAST tumorer og patienter med MSI /ikke-EMAST tumorer (B).

Hypermethylering af

MLH1

genpromotoren (32 ud af 40 patienter) og

BRAF

mutationer (24 ud af 40 patienter) var begrænset til patienter med en MSI /EMAST tumor (p 0,001 og p = 0,004 henholdsvis).

EMAST hos patienter med Lynch syndrom

for yderligere at analysere forholdet mellem MSI og EMAST vi valgt 39 patienter med kendt Lynch-syndrom (med kim line mutationer i

MSH2

gen (n = 11),

MLH1

gen (n = 10),

MSH6

gen (n = 10) og

PMS2

gen (n = 8)). Størstedelen af ​​denne population viste EMAST (29 ud af 39 patienter). Ingen af ​​patienterne viste hypermethylering af

MLH1

gen promoter, og alle tumorer var

BRAF

vildtype. Ni ud af 10 patienter med ikke-EMAST tumorer havde en kimlinie mutation i

MSH6

(Fig 4B).

Resultatet af patienter med MSS tumorer

Baseline patient og tumor karakteristika for patienter med MSS tumorer (test gruppe og validering gruppe), opdelt af EMAST og ikke-EMAST tumorer er præsenteret i tabel 2. Der var ingen signifikant forskel i resultatet for patienter med EMAST sammenlignet med patienter med ikke-EMAST tumorer (tabel 3 ).

Gennemgang af litteraturen

søgningen litteratur identificeret 7 studier, hvor EMAST blev beskrevet i trin i-IV CRC patienter med MSI og MSS tumorer [21-24,27,33, 34]. To studier blev ekskluderet: en undersøgelse beskrev samme befolkning [23] og en undersøgelse vurderede forekomsten af ​​EMAST udelukkende hos patienter med MSS tumorer [27]. Tre studier havde begrænset antal MSI tumorer. Fig 5 opsummerer en skov plot af de 5 publicerede studier, og den aktuelle undersøgelse af forekomsten af ​​EMAST i trin I-IV CRC patienter med MSI og MSS tumorer. EMAST er betydeligt hyppigere i tumorer med MSI (148/174) (RR 4,80, 95% konfidensinterval 3,90-5,91). Signifikant heterogenitet blev observeret.

Diskussion

Denne undersøgelse præsenterer analyse af frekvens og prognostiske værdi af EMAST i FRK patienter. Selv EMAST blev observeret i 45,9% af alle FRK patienter, blev det mest udtalt i MSI tumorer (79,8%). Hyppigheden af ​​EMAST blandt MSS tumorer (13,8%) var meget lavere i vores undersøgelse i forhold til de fleste studier i fase I-IV CRC [21-24,27,34]. Den brede vifte af frekvens (0,54 til 60,2%) af EMAST blandt MSS tumorer er beskrevet i litteraturen [21-24,27,33,34] kan skyldes det faktum, at der ikke er enighed om definitionen af ​​EMAST og panelet kræves for diagnosticeringen. På grund af den polymorfe karakter af tetranukleotid gentagelser i den aktuelle undersøgelse, vi brugte strenge kriterier for definitionen af ​​EMAST:. Mindst to af de fem tetranukleotid markører skal vise ustabilitet

På trods af at flere små undersøgelser (n = 3 til n = 56) [21-24,33,34] viste, at MSI uvægerligt er forbundet med EMAST, sammenhængen mellem EMAST og MSI er ikke bredt accepteret. Vi fandt en høj frekvens af EMAST i MSI tumorer, som blev bekræftet i en analyse af den eksisterende litteratur i fase I-IV CRC (figur 5). Kun en lille undergruppe af patienter med MSI tumorer er ikke-EMAST. Interessant nok størstedelen af ​​patienter med MSI /ikke-EMAST tumorer udviste tab af MSH6. Dette er i overensstemmelse med det faktum, at MSH6 kun involveret i mononukleotidbyggeblokken mismatch reparation [35,36]. Patienter med MSI /ikke-EMAST tumorer er oftere mænd og tumorer udviklet oftere i endetarmen, disse egenskaber er sammenlignelige for patienter med

MSH6

germline mutationer [37]. I vores population af MSI tumorer tilstedeværelsen af ​​EMAST er korreleret med

MLH1

mangel, som forårsager en total DNA mismatch reparation defekt, både i Lynch syndrom samt i sporadisk indstilling, hvilket bekræfter tidligere observationer [21,27 ].

data om EMAST fænotype i CRC er knappe og underliggende mekanisme (r) fortsat uklare. De tidligste rapporter foreslog, at EMAST kan være forbundet med mutationer i

TP53

gen [16,17], eller at miljømæssige kræftfremkaldende kan forværre denne fænotype [38] i andre end CRC kræftformer. Senere blev en forening mellem tab af MSH3- og EMAST i CRC [21]. På grund af det faktum, at MutSβ har en stærk affinitet for anerkendelse mere end to uparrede nukleotider og genetisk komplementering af MSH3- mangel i humane celler forøget stabilitet ved loci indeholder dinukleotid og tetranukleotid gentagelser [39], blev det fremført, at tabet af MutSβ grundet MSH3- inaktivering kan resultere i MSI ikke kun på loci indeholdende dinukleotid gentagelser, men også på steder med tetranukleotid gentagelser, såsom EMAST [21]. Nylige undersøgelser bekræfter sammenhængen mellem tab af MSH3- og EMAST i CRC, men den nøjagtige underliggende mekanisme er stadig ukendt [25,26]. Vi ikke kunne påvise en sammenhæng mellem MSH3- protein-ekspression og EMAST. Faktisk, vi fandt den heterogene udtryk mønster af MSH3- i 21,1% af patienterne, som beskrevet af andre, selv om dette ikke var korreleret til EMAST. Men vores undersøgelse havde et lille antal patienter. En anden mulig forklaring på forskellen mellem vores undersøgelse og tidligere studier kan være en potentiel undersampeling skævhed, da vi brugte en TMA eksemplar pr tumor i stedet for fuld tumor dias.

Vi viser, at patienter med MSI /ikke-EMAST tumorer havde en signifikant bedre prognose sammenlignet med patienter med MSI /EMAST tumorer. Tilsætningen af ​​EMAST til MSI tumorer synes at forværre overordnede prognose og overlevelse. MSI /ikke-EMAST gruppe ville forventes at blive beriget for

MSH6

mangel siden EMAST ville blive identificeret med en samlet DNA mismatch repair defekt, såsom med

MLH1

eller

MSH2

mangel. Vores resultater på korrelationen mellem EMAST med kliniske resultat bør fortolkes med forsigtighed på grund af det lille antal patienter i de forskellige undergrupper.

Sammenfattende hyppigheden af ​​EMAST blandt FRK patienter med MSS tumorer er lav sammenlignet med patienter med MSI tumorer. Der var ingen sammenhæng mellem EMAST og MSH3- proteinekspression. Vi fandt en klar sammenhæng mellem MSI og EMAST, og resultatet var signifikant bedre for FRK patienter med MSI /ikke-EMAST tumorer. Yderligere undersøgelser er berettiget til at belyse den molekylære basis for EMAST og vise, om de tetranukleotid ændringer observeret i EMAST tumorer kan have en funktionel effekt i sig selv eller blot repræsenterer bystander ændringer i en undergruppe af tumorer med specifikke defekter i DNA-replikation og reparation.

Støtte Information

S1 Table. Tetranukleotid mikrosatellit PCR primer sekvenser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0124538.s001

(PDF)

Tak

Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra det hollandske Colorectal Cancer Group (DCCG).