PLoS ONE: actinfilamenter på forkant af kræftceller er karakteriseret ved en høj Mobile Fraktion og Omsætning forordning ved profilin I

Abstrakt

Cellulær motilitet er grundlaget for kræftcellen invasion og metastase. I tilfælde af brystkræft, den mest almindelige form for cancer blandt kvinder, metastase repræsenterer den mest ødelæggende stadium af sygdommen. Den centrale rolle cellulære motilitet i udviklingen af ​​kræft understreger vigtigheden af ​​at forstå de specifikke mekanismer, der er involveret i denne proces. I den forbindelse vil tumor udvikling og metastase være konsekvensen af ​​et tab eller fejl i de mekanismer, der styrer cytoskeletal remodeling. Profilin I tilhører en familie af små actinbindende proteiner, der menes at hjælpe med actin filament forlængelse ved den førende kant af migrerende celler. Traditionelt har profilin jeg blevet anset for at være et væsentligt styreelement til actinpolymerisation og cellevandring. Ekspression af profilin I nedreguleres i bryst- og forskellige andre cancerceller. I MDA-MB-231-celler, en brystcancer-cellelinie, yderligere inhibering af profilin I-ekspression fremmer hypermotilitet og metastatisk spredning, en konstatering, der kontrasterer med den foreslåede rolle profilin i styrkelsen polymerisation. I denne rapport har vi taget fordel af fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) af GFP-actin at kvantificere og sammenligne actin dynamik på forkant niveau i både kræft og ikke-kræft celle modeller. Vores resultater antyder, at (i) en høj grad af actin dynamik (dvs. en stor mobil del af actinfilamenter og en hurtig omsætning) er en almindelig egenskab ved visse cancerceller; (Ii) actinpolymerisation viser en høj grad af uafhængighed af tilstedeværelsen af ​​ekstracellulære vækstfaktorer; og (iii) vores resultater bekræfter også den rolle profilin I i regulering actinpolymerisation, som hæve intracellulære niveauer af profilin Jeg faldt den mobile fraktion forholdet actinfilamenter og bremset deres polymerisationshastigheden; desuden også steget profilin niveauer ført til reduceret individuel celle hastighed og retningsbestemmelse

Henvisning:. Lorente G, Syriani E, Morales M (2014) actinfilamenter på forkant af kræftceller er karakteriseret ved en høj Mobile Fraktion og Omsætning forordning ved profilin I. PLoS ONE 9 (1): e85817. doi: 10,1371 /journal.pone.0085817

Redaktør: Yulia Komarova, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: 30. maj 2013; Accepteret: December 3, 2013; Udgivet: 17 januar 2014

Copyright: © 2014 Lorente et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den spanske Forskningsministeriet (SAF2010-16024; BFU 2012-17.537, ONCE 2010 og 2011) og Fundación Rioja midler. GL var fællesskab indehaver af Universidad de Barcelona. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cellulær motilitet er en kompleks proces, der forekommer i alle celletyper [1]. Migration over en flad overflade involverer fremspring i en tynd membran kappe, lamellen, fyldt med en kompliceret actin forgrenet netværk. Kraften til membranen fremspring og udvidelse leveres af kontrolleret og begrænset actinpolymerisation på det nærmeste kant af membranen, det såkaldte forkant. Under forlængelse, er actinfilamenter polariseret med deres modhager ende (eller plus ende) peger mod membranen [2], som skubbes af filamenterne, tvinger udvidelsen af ​​lamellen. Lamellen forlængelse er derfor, hvad der bestemmer retningen og bevægelsen af ​​cellen [3]. Luk regulering af celle migration er afgørende for udvikling, sårheling og immunrespons, mens afvigende og ukontrolleret celle motilitet er et gennemgående træk i flere typer af kræftceller.

En række undersøgelser viser, at profilin I (PfnI) , en essentiel actinbindende protein, kan spille en vigtig regulerende rolle i processen med cellulær motilitet. Således

Dictyostelium amøber

mutanter for PfnI udstille motilitet og cytokinese defekter [4], som betyder “chickadee”, null mutant for homolog af PfnI i

Drosophila

[5]. Ligeledes tavshed PfnI i humane vaskulære endotelceller inducerer hæmning af motiliteten og defekter i membran fremspring [6]. Desuden PfnI knockout har vist, at resultere i tidlige embryonale celledød i mus [7].

Af medlemmerne af profilin familien (PfnI til PFN IV), PfnI er det mest til udtryk. Det blev oprindeligt identificeret som en G-actin sekvestrerende protein [8], og siden da er det blevet tildelt flere andre funktioner, herunder nukleare-cytoplasma trafik af actin ved binding til exportin 6 [9], mRNA splejsning [10], samt vesikulær endocytose ved interaktion med clathrin og valosin-holdigt protein [11]. I dag er det almindeligt accepteret, at dens vigtigste rolle er at fremme actin polymerisering ved at katalysere udveksling af ADP til ATP på G-actin monomer [12]. Endvidere indeholder strukturen af ​​PfnI én polyprolin bindende domæne (PLP) [13], [14] og to phosphoinositid bindingssites [15] – [17]. I kraft af førstnævnte, PfnI interagerer med et væld af prolin-rige proteiner. Blandt andet er det direkte binder til Ena /VASP [18], N-WASP [19], WAVE [20] og actin kimdannelsesmiddel familien af ​​formins [21]. Alle disse proteiner rekruttere PfnI til zoner med dynamisk actin remodeling, såsom forkanten af ​​lamellipodia. Den intracellulære lokalisering af PfnI bekræfter sin tilknytning til områder med intens actin polymerisering, og dermed PfnI findes i pTk2- mikrofilamenter af pungdyr fibroblaster [22], agterliget neuronale vækst kegler [23], Bovine trabekelværket lameller [24], fremspringende områder af rotte fibroblast [25], og nær den fremrykkende kant af endotelceller [26].

et grundlæggende træk ved tumorcelleinvasion og metastase er en øget motilitet og migration kapacitet af cellerne. Interessant ekspressionsniveauerne af PfnI er nedreguleret i flere invasiv bryst-, pankreas- og hepatiske cancercelletyper [27] – [31]. Yderligere reduktion af PfnI niveauer ved silencing dens ekspression resulterer i endnu højere motilitet [29], [32] og tumorprogression [33]. Det modsatte er også sandt: en stigning i PfnI niveauer reducerer celle invasiv og motilitet, efterfulgt af en opregulering af stress-fibre og fokal vedhæftning [27], [29]. Desuden PfnI overekspression undertrykker både ektopisk og ortotopisk tumorigenicitet og mikro-metastaser [32]. For tumorsuppressionsaktivitet at ske via denne mekanisme, både actin og phosphoinositid bindingssteder i PfnI skal fungere [30], [32], [34]. Desuden har PfnI overekspression blevet rapporteret at opregulere PTEN udtryk, derfor indirekte undertrykke Akt aktivitet ved at kontrollere phosphoinositid produktion [35].

phosphoinositid binding af PfnI er vigtigere end tidligere forventet. Den Ena /VASP familie af proteiner uncaps de frie barbed ender af actin, så deres progressive forlængelse [36]. Lamellipodin (LPD) binder Ena /VASP gennem en EVH1 domæne, og specifikt interagere med PI (3,4) P

2. På denne måde målet for LPD membran er i stand til at rekruttere Ena /VASP til membranen. En række af de seneste resultater tyder på, at PfnI begrænser tilgængelige pulje af PI (3,4) P

2. På denne måde ville PfnI negativt regulere phosphoinositid niveauer på membranen, og indirekte begrænse LPD-Ena /VASP målretning til membranen [37]. I MDA-MB-231 celler, PfnI udtømning regulerer LPD ophobning, indirekte hæve Ena /VASP koncentration på forkant, og dermed fremme actin polymerisering og den rapporterede hypermotilitet efter PfnI udtømning [38]. Men de underliggende konsekvenserne af disse PfnI undertrykkende handlinger på actin omsætning mangler at blive belyst. Eksperimentel data viser, at et funktionelt actin bindende domæne af PfnI er afgørende at reducere kræft cellemotilitet og tumor fænotype [29], [30]. I betragtning af den overflod af eksperimentel dokumentation for betydningen af ​​PfnI i reguleringen actin polymerisering og cellemigration, er det gådefuldt, hvordan lave ekspressionsniveauer af PfnI er forbundet med øget cellulær motilitet, og hvordan actin treadmilling kan reguleres.

I denne rapport, blev omsætningen af ​​lamellipodial actin undersøgt ved hjælp af fluorescens Recovery Efter Fotoblegning (FRAP) [39]. Vores resultater indikerer, at cytoskelettet ved forkanten af ​​kræftceller er meget mere dynamisk end ikke-tumorceller. Desuden øger PfnI niveauer i cancerceller fører til reduceret actin treadmilling og forringet cellulær motilitet. Endelig har vi også fundet beviser for, at actin treadmilling i cancerceller er ufølsom over for ekstracellulær regulering af vækstfaktorer.

Materialer og metoder

Cellekulturer

MDA-MB-231 humane brysttumor-cellelinier blev dyrket i DMEM F12-Ham medium og 10% FBS (Sigma). Den MCF10A human mammae epitel cellelinje blev dyrket i følgende dyrkningsmedium: HEPES 15 mM, hesteserum 5%, EGF 20 ng /ml, Hydrocortisone 0,5 mg /ml, koleratoksin 100 ng /ml, human insulin 10 mg /ml, 50 mg /ml penicillin og 50 U /ml streptomycin i DMEM F12 HAM (alle leveret af Sigma). A549 human lunge tumorcellelinie, MEF muse embryonale fibroblaster og HeLa humane cervix tumor-cellelinie blev dyrket i DMEM, suppleret med 50 mg /ml penicillin, 50 U /ml streptomycin og 10% FBS (Sigma-Aldrich). MDA-MB-231-celler blev indkøbt fra ATTC (USA; Ref HTB-26.). MCF10A celler, passage 8, var en generøs gave fra LP Saucedo (CNIO, Madrid, Spanien). A549 og HeLa-celler, passage 10, var en generøs gave formular H. Aguilar (ICO, Barcelona, ​​Spanien). MEF celler, passage 6, var generøse gave fra A. Angulo (IDIBAPS, Barcelona).

Immuncytokemi og billedanalyse

Kort fortalt for immuncytokemiske analyser, cellekulturer blev skyllet i PBS og fastsat for 15 min i 4% paraformaldehyd /PBS. Dækglas blev derefter vasket tre gange i PBS og inkuberet i 30 minutter i blokerende opløsning (2% gedeserum, 2% serumalbumin, 0,1% Triton X-100 i PBS). Antistoffer blev fortyndet til den passende koncentration i blokeringsopløsning. Dækglas blev inkuberet i 60 minutter i antistofopløsningen. Prøverne blev efterfølgende vasket tre gange og inkuberet i 30 minutter med de passende fluorescens-konjugeret sekundære antistoffer. Endelig blev dækglassene vasket fem gange og monteret med Mowiol. Fluorescensbilleder blev opnået med et inverteret mikroskop (Olympus IX70), ved anvendelse af en TILL monokromator som lyskilde. Billeder blev taget med en vedhæftet afkølet CCD-kamera (Orca II-ER, Hamamatsu)

Følgende antistoffer blev anvendt:. Anti-vinculin monoklonalt antistof (. Chemicon, ref MAB3574) og anti-profilin polyklonale og monoklonale antistoffer (Cell Signaling, ref. 3237 og Synaptic systemet, ref. 308 011). Sekundære antistoffer, Oregon green Phalloidin og Phalloidin-Alexa Fluor® 594 blev indkøbt fra Invitrogen. Billede J analyse software (National Institutes of Health) blev anvendt til at kvantificere sprede og fokal vedhæftning.

Cell området målinger og Focal sammenvoksninger kvantificering

Kort fortalt op til 10000 celler blev podet på 12 mm dækglas i plader med 24 brønde. Efter den tilsvarende behandling, blev cellerne fikseret i 4% PFA og plettet med Oregon-grøn Phalloidin eller Phalloidin-Alexa Fluor® 594. Trods den manglende stress fibre, Phalloidin farvning aktiveret målingen af ​​hele celleoverfladen. Celle område blev kvantificeret ved digital tærskelværdi analyse under anvendelse Billede J software.

Rekombinant protein

I nogle forsøg de intracellulære niveauer af profilin blev modificeret under anvendelse af en membran permeabel version af PfnI [24], [ ,,,0],40]. PTD4-profilin (21 kDa) blev dannet ved fusion af en transduktion domæne, PTD4 [41], til profilin. Det rekombinante protein blev udtrykt i

E. Coli

og oprenset som tidligere [40] beskrevne. Kort fortalt kompetent

E. Coli

BL21-plys transformeret med pRSETA-PTD4-pFN I vektoren blev induceret ved tilsætning af 1 mM IPTG (Sigma) ved 37 ° C i 6 timer. Bakterielle pellets blev lyseredes ved frysning og optøning protokol i flydende N

2, efterfulgt af sonikering på is i nærværelse af DNAse og et protein inhibitor cocktail (Sigma). Cellelysater blev adskilt ved centrifugering, og den opløselige protein blev isoleret ved anvendelse af Ni-NTA resin-pakkede kolonner (Quiagen). Protein vask og eluering blev udført med høje koncentrationer af imidazol. Buffer udveksling og koncentration af det rekombinante protein blev udført ved centrifugering i Amicon Ultra-15 10000 MWCO centrifugal filtre (Millipore), der erstatter elueringen medier med PBS. Proteiner blev nedfrosset i flydende N

2 og opbevaret ved -80 ° C i 10-15% glycerol-PBS. Bakterier og proteiner blev håndteret i overensstemmelse med de retningslinjer for sikkerhed for Laboratory personale, der arbejder med Trans-Aktivering transduktion (TAT) Protein Transduktion Domains.

transfektion

Transfektion blev udført ved hjælp af Efectene Transfection Reagent kit fra Qiagen efter producentens anvisninger. Adskillige ekspressionsvektorer blev anvendt: CMV-GFP, CMV-GFP-actin og CMV-MembraneCherry venligst stillet til rådighed af Dr. F Tebar (University of Barcelona, ​​Spanien), og CMV-GFP-PfnI venligst stillet til rådighed af Dr. Hitomi Mimuro (University of Tokyo, Japan).

Stabile cellelinier

Stabile cellelinjer blev frembragt fra MDA-MB-231 cancercellelinie transficeret med plasmider, der udtrykker GFP-actin, GFP-PfnI, MembraneCherry-PfnI og GFP under en CMV-promotor-kontrol (alt arbejde blev udført med celle passager 6.-8). Transfektioner blev udført med Efectene transfektionsreagens (Qiagen), som beskrevet i protokollen. Transficerede celler blev selekteret med tre ugers inkubation på gentamicin 1 mg /ml (Sigma). FACS blev anvendt til at separere høj- og lav-udtrykker GFP-actin celler. Bufferen cellesortering opløsning anvendes bestod af 5 mM EDTA, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% FBS (varmeinaktiveret) og PBS uden Ca

2 + /Mg

2+. Relative niveauer af rekombinant protein ekspression blev analyseret ved Western blot.

Cell motilitet assay

MDA-MB-231 celler blev podet på plader med 6 brønde (Nunc) ved 40% konfluens og mærket med DRAQ5, en celle-permeabelt langt-rødt fluorescerende DNA-farvestof, i 5 min (Cell Signaling Technology). Kultur plader blev monteret på scenen af ​​en Leica DMITCS SL laserscanning konfokal spektral mikroskop (Leica Microsystems Heidelberg, GmbH) knyttet til en Leica DMIRE2 inverteret mikroskop udstyret med en inkubation-system med temperatur og CO

2 kontrol. Alle eksperimenter blev udført ved 35 ° C og 5% CO

2. For visualisering af DRAQ5 farvede kerner, blev billeder erhvervet ved hjælp af en 40 × objektiv (NA 1.32) og ophidset med en 633 nm laser linje. Den konfokal pinhole blev fastsat til 4,94 Luftige enheder til at minimere fluorescens tab. Billeder blev taget hver 5 min i 8 timer. Billede J analysesoftware (NIH) blev anvendt til hastighed og retningsbestemmelse kvantificering. Direktionalitet data blev præsenteret som den lineære afstand (End) divideret med den samlede distance længde i løbet af 8 h, som beskrevet af Pankov et al., 2005 [42].

Fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP)

FRAP blev udført ved hjælp af følgende protocol:10 enkelte scanninger (pre-blegning) blev erhvervet ved 300 ms intervaller efterfulgt af 20 blegemiddel scanninger ved fuld lasereffekt ved hjælp af en firkantet område på 24 um

2. Under post-blegning periode blev 30-60 scanninger erhvervet til 300 ms mellemrum, efterfulgt af 100 billeder erhvervet ved 5 s intervaller, denne periode var nødvendig for at gøre det muligt for fluorescens at nå ligevægt. For at løse den indledende hurtig genopretning, blev udført nogle eksperimenter ved hjælp af Leica flyve dataopsamling; blegning blev udført under X flyve fremad scanning med 100% laser magt, og i løbet baglæns scanning, blev fluorescens læses med laser intensitet indstillet til billeddannelse værdier (185 ms billeder interval), mens post-blegning billeder (30-60 s) blev erhvervet på samme tidsinterval. For at undgå betydelig fotoblegning blev excitation intensitet svækket til ~ 5% af den laser strøm under erhvervelse billede. Fluorescens opsving blev kvantificeret ved hjælp af Image Processing Leica Konfokal Software. Baggrund fluorescens blev målt i en tilfældig felt uden for cellen, og trukket fra alle målinger. Den fluorescens-signalet målt i regionen af ​​interesse (ROI), blev korrigeret for erhvervelse fotoblegning og svingninger i hele fluorescens efter en dobbelt normalisering metode, bestemmes som følger: Irel = Det /I0 * T0 /Tt, hvor det er den gennemsnitlige intensitet i ROI på tidspunkt t; I0 er den gennemsnitlige intensitet af ROI i før-blegning periode; T0 er intensiteten under forbehandlingen blegning af det ikke-bleget område (normalt, en nabocelle eller det nukleare område); og Tt er intensiteten til tiden t af dette område. Indførelsen af ​​korrektionsfaktoren (T0 /Tt) tegner sig for eventuelle små udsving i alt fluorescensintensitet skyldes selve blegemiddel, og giver en mere nøjagtigt estimat af den målte fluorescens i ROI [43], [44].

den netto fluorescens opsving (mobil fraktion; Mf) målt i området af interesse blev bestemt som: Mf = Fend-Fpost /Fpre-Fpost, hvor Fend er ROI betyder intensitet ved steady-state; Fpost repræsenterer ROI intensitet efter fotoblegning; og Fpre er middelværdien præ-blegning ROI intensitet. Opsvinget tidskonstant (τ) blev opnået ved kurve fitting hjælp Prism Software (GraphPad), under forudsætning af en én-eksponentiel model (nederst, derefter stigende til toppen).

Intracellulære mængder af rekombinant profilin

Beregning af intracellulære mængder PTD4-PfnI blev udført ved Western blot densitometri. Kort fortalt celler vokser i 25 cm

2 kolber blev vasket fem gange, trypsinbehandlet, og vaskes grundigt ved centrifugering for at reducere den ekstracellulære proteinkoncentration. Cellelysater blev kørt i en SDS-polyacrylamidgel. Udvandet mængder af renset rekombinant PTD4-PfnI blev lagt i de samme brønde. Begge proteiner, endogene profilin og PTD4-PfnI blev let skelnes ved deres molekylvægte og blev probet med et monoklonalt antistof mod profilin I.

Statistik Salg

Alle data er repræsenteret som middelværdi ± SEM og blev analyseret ved hjælp af Prism-software (version 4.0 og 6.0, Graphpad). Dataene blev analyseret ved anvendelse af t-test efter behov. Betydning niveauer blev noteret som følger:. * P 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,001

Resultater

Actin dynamik kræftceller er kendetegnet ved en høj mobil fraktion og korte restitutionstid

for at studere dynamikken i actincytoskelettet over den stigende forkant af tumorceller, har vi valgt MDA-MB-231 breast cancer cellelinie. Denne cellelinie bærer

KRAS

G13D og

BRAF

G464V mutationer [45], og det er især velegnet til prækliniske undersøgelser, da det er meget aggressiv, både

in vitro

in vivo

[46]. MDA-MB-231-celler i kultur udviser en kontinuerlig og høj motilitet lamel forlængelse, der præsenterer talrige flæser langs membranen, hvilket gør denne celletype en fremragende kandidat til at studere omsætning lamellipodial actin hjælp FRAP. For at lette de billeddannende eksperimenter, havde vi tidligere genereret en stabil transficeret MDA-MB-231 cellelinie, der udtrykker GFP-aktin konstruktion. Det relative niveau af GFP-actin-ekspression blev undersøgt ved Western-blot og sammenlignet med GFP udtrykt cellelinie som en kontrol i gennemsnit ekspressionen af ​​fluorescens protein resulterede i 5,2% af den samlede profilin (data ikke vist).

Den karakteristiske forkant MDA-MB-231-celler er en 2 um bred struktur beriget med GFP-aktin og let identificeres ved Phalloidin-Alexa 594-farvning (figur 1A). Et rektangulært område stort nok til at dække hele forkant (4 um brede og 6 um lange) blev Lysblegede [39] (figur 1B). Som vist i figur 1C, MDA-MB-231-celler udviste en bedring af fluorescensen tæt på en 70% efter 15 s. Kinetikken recovery blev beskrevet af en to-komponent eksponentiel kurve godtgør en initial hurtig komponent efterfulgt af en anden langsommere komponent. Den oprindelige komponent havde en restitutionstid på næsten 500 ms, svarende til den værdi, der opnås, når opsvinget blev undersøgt i monomere GFP-transficerede celler (tau 100-200 ms; Figur S1). Dette er mest sandsynligt på grund af den hurtige diffusion af GFP-actin monomerer. Den indledende hurtige komponent blev først opdaget, da en hurtig overtagelse protokol blev ansat, og blev derfor forsømt i de fleste af forsøgene. Den anden langsommere komponent var drevet af actinpolymerisation [47], [48], hvilket blev bekræftet ved tilsætning af 90 nM cytochalasin D (en reversibel barbed-end blokker) til dyrkningsmediet fem minutter før FRAP eksperiment. I nærvær af cytochalasin D, GFP-actin-fluorescens ikke at have inddrevet (figur 1C), hvilket bekræfter, at actin polymerisation driver genvinding af fluorescens. I gennemsnit er den mobile fraktion målt 30 sekunder efter det tidspunkt maksimale blegning blev anslået til at være 71,5 ± 4%; Sidstnævnte element blev monteret af en én-eksponentiel kurve med en gennemsnitlig tau værdi på 4 ± 0,3 sekunder (røde stiplede linie i figur 1C).

A) MDA-MB-231-celler transficeret med GFP-aktin, dobbelt farvet med Phalloidin-Alexa 594 (a). Actin fluorescens akkumuleres primært på forkant området. Scale bar 5 um. Bemærk, at MDA-MB-231 celler har en iøjnefaldende mangel på actin stress fibre. Rigth: Detaljeret sektion af den forreste kant, der viser akkumuleringen af ​​GFP-actin (b) og actinfilamenter (c). Målestokken 2 um. B) Repræsentant billedrammer fra sekventielle FRAP eksperimenter. Før FRAP (præ-blegning), efter høj intensitet laser eksponering (blegning), i den indledende fase af recovery (5 s) og ved slutningen af ​​den stabile del af kurven (30 s). Den blegede forkant område er angivet ved den hvide kasse (4 × 6 um). C) Eksempel på et FRAP eksperiment; fluorescens genvinder en gennemsnitsværdi på 71,5 ± 4% efter en monoeksponentiel tidsforløb (fit afbildet med en rød stiplet linie). Inkubation med cytochalasin D (90 nM) hæmmer fluorescens opsving (CytD). D) Sammendrag graf over de gennemsnitlige mobile fraktioner fra MDA-MB-231-celler. Stabile transfekterede celler (s, n = 44), høje GFP-actin expressers (høj, n = 10), lav GFP-actin expressers (lavt, n = 10) og forbigående transficerede celler (231t, n = 6). Middelværdier af mobile fraktion viser ikke statistiske forskelle under alle eksperimentelle betingelser sammenlignet med den stabile transficerede cellelinje (t-test).

Vi spurgte derefter, om de observerede mobile fraktion værdier var afhængige af GFP-actin ekspressionsniveauer. Til dette formål har vi analyseret restitutionsniveauer til tre forskellige tilstande: celler med høje eller lave GFP-actin ekspressionsniveauer (populationer sorteret ved flowcytometri fra den genererede stabil GFP-aktin cellelinje) og efter en transient transfektion i 48 timer. Resultaterne, som er opsummeret i figur 1D, viste, at den gennemsnitlige mobile fraktion var ens for alle tre betingelser, understøtter den hypotese, at actin recovery rate ikke var afhængig af intracellulær GFP-aktin koncentration.

For at undersøge, om dette område af actin opsving er specifik for de MDA-MB-231 celler eller er et fælles kendetegn for de fleste kræftformer af epitel oprindelse, blev yderligere to kræft cellelinjer undersøgt. Således aktin dynamik på forkanten af ​​HeLa og A549-celler, en livmoderhalsen og en human pulmonal adenocarcinom henholdsvis [49], [50], blev undersøgt efter transient transfektion med GFP-actin (figur 2A). Begge cellelinier udviste en stor mobil fraktion efter 30 sekunder, med middelværdier svarende til dem i MDA-MB-231-celler (værdier fra 62 til 64%; Figur 2B) og gendannelsestider varierende inden for en lignende interval, fra 2 til 5 sekunder (Figur 2C). I øvrigt, A549 celler udviste den hurtigste genopretning, med en tau-værdi tæt på 2 sekunder (Figur 2C).

A) To eksempler på individuelle fluorescens genvinding af GFP-actin opnået fra A549 og HeLa-celler. B) Søjlediagram af gennemsnittet mobile fraktion sammenligning MDA-MB-231, HeLa og A549-celler. De beregnede middelværdier var 62,4 ± 4,2% for HeLa (n = 12) og 64,7 ± 4,3% for A549 (n = 10). Ingen statistiske forskelle blev fundet ved sammenligning med MDA-MB-231-celler. C) Middelværdier af tau eksponentialværdier opnået fra inddrivelse kurver montering. MDA-MB-231-celler udvundet med en tau-værdi på 4,1 ± 0,6 s, mens HeLa-celler viste en tau på 5,5 ± 1,7 s. A549 celler viste den hurtigste inddrivelse af alle, med en tau på 1,9 ± 0,35 s, hvilket var statistisk forskellig fra MDA-MB-231 restitutionstid (p 0,005, t-test).

Da MDA-MB-231 brystcancerceller har en epitelial oprindelse sammenlignede vi også deres actin dynamik med den for en ikke-cancercellelinie af MCF10A, en human epithelial bryst-cellelinje transficeret med GFP-aktin. Resultaterne (opsummeret i figur 3), at cytoskelettet af MCF10A havde en lavere actin mobil fraktion end den modsvarende cancercellelinie (50% versus 70%: Figur 3A-B). Recovery tid var også anderledes, med en gennemsnitlig værdi tæt på 7 sekunder. Lignende resultater blev opnået, når fibroblastceller fra et ikke-relateret oprindelse blev undersøgt. Murine embryonale fibroblaster (MEF’er) havde en mobil fraktion værdi tæt på 40%, med en restitutionstid på omkring 8 sekunder (Figur 3A-C). Sammenfattende de eksperimentelle data indikerer, at kræft testede celler viser en langt mere dynamisk cytoskelet end ikke-kræftceller.

A) To eksempler på individuelle actin recovery kurver på forkant efter fotoblegning af GFP-actin fra MCF10A (human) og MEF (murine) celler. Udvindingen af ​​MDA-MB-231-celler er afbildet som en rød stiplet linie til sammenligning. B) summerede data fra de mobile fraktioner af MEF’er (39 ± 4,2%, n = 18) og MCF10A (51,7 ± 1%, n = 6) sammenlignet med MDA-MB-231 tumorceller. Hver celletype viser statistiske forskelle sammenlignet med MDA-MB-231 mobile fraktion recovery (p 0,005, t-test). De mobile fraktioner af MCF10A og MEF celler var ikke statistisk forskellige (t-test). C) nyttiggørelse tidspunkter af begge MEF’er (tau = 7,5 ± 1,6 s) og MCF10A celler (tau = 6,5 ± 0,4 s) var statistisk forskellige end MDA-MB-231-celler (p lt; 0,005 og p 0,05; Students t -test).

MDA-MB-231 actin dynamik er uafhængige af tilstedeværelsen af ​​ekstracellulære vækstfaktorer

Erhvervet uafhængighed fra ekstracellulær vækstfaktor signalering er et typisk kendetegn for brystkræftceller [51]. I ikke-cancercellelinier, er cellemotilitet og polarisering ledet af en lokal akkumulering af PIP

3; meste drevet af PI3K aktivering eller lokal integrin aktivering. Faktisk afvigende PI3K signalering er et tilbagevendende tema i både initieringen og fremadskriden af ​​en række forskellige cancere, herunder brystcancer [45]. Dernæst ønskede at teste afhængigheden af ​​actin dynamik ved forkanten på den ekstracellulære tilstedeværelse af vækstfaktorer. Til dette formål har vi undersøgt de actin dynamik cancer og ikke-cancercellelinier efter en 16 timers serumudsultning periode. Resultaterne viser, at MDA-MB-231 mobile fraktion var upåvirket af serum sult tilstand (figur 4A), med en gennemsnitlig mobile fraktion værdi på 58 ± 3%, og en gennemsnitlig tau genindvundet 6,6 sekunder, hvilket ikke var statistisk forskellige fra værdierne opnået i nærvær af serum (figur 4B og D). En umiddelbar konsekvens af fraværet af vækstfaktorer er reduktionen af ​​PIP

3 signaleringen på membranen niveau. For at bekræfte indflydelsen af ​​PIP

3 på actin modulation, blev actin dynamik på avancerede analyseret 30 minutter efter at have behandlet af cellerne med PI3K-inhibitoren LY294002 (20 uM). Den mobile fraktion viste en middelværdi på 57 ± 2%, og fluorescensen udvundet med en tidskonstant på 4,2 sekunder, hvilket ikke var statistisk forskelligt fra den i kontrol- eller serumudsultning betingelser (figur 4B og D).

A) Eksempel på fluorescens bedring efter FRAP under kontrolbetingelser (10% FBS, FBS plot) og serum sult i 16 timer (Sultende plot). B) Sammendrag data af den gennemsnitlige mobile fraktion i MDA-MB-231-celler. Den gennemsnitlige mobile fraktion under FBS betingelser var 62 ± 5,2% (n = 6), sammenlignet med 58 ± 3% efter 16 timers udsultning og 57 ± 2% (n = 6) efter PI3K inhibering med LY294002 (n = 6) . Det skal bemærkes, at vi har medtaget nye kontrolforanstaltninger celler, der vokser parallelt og analyseret på samme dag og på samme vilkår; Derfor er den gennemsnitlige mobile fraktion har en lidt anden værdi, at den samlede gennemsnitlige middelværdi (70% versus 65%). C) Den mobile del af ikke-cancerceller under serum-udsultede betingelser blev reduceret til 27 ± 5,2% (n = 10) i muse fibroblast og til 28 ± 2,4% i MCF10A (n = 6), (p 0,05; Students t-test). D) Recovery tid resumé graf. MDA-MB-231 vokser i FBS tendens til at vise hurtigere dynamik (4,14 ± 0,6 s) ikke statistisk signifikante fra den af ​​udsultede celler (6,6 ± 1,7 s). Brugen af ​​LY294002, en kemisk inhibitor af PI3K, påvirkede ikke restitutionstid (4,2 ± 1,0 s). E) I modsætning hertil serum sult påvirket restitutionstid af ikke-kræftceller, øge den tid konstant fra 8,2 ± 0,2 s til 9,5 ± 0,1 s for MEF’er (p 0,05) og 6,5 ± 0,4 s til 8,0 ± 1,2 s for MCF10A celler (p 0,05; t-test)

i modsætning hertil var mobile brøkdel af MCF10A celler reduceret under serum hungersnød (middelværdi på 28 ± 2,4% i forhold til 51% under kontrol betingelser. , figur 4C). Tilsvarende afhængighed af ekstracellulær serum blev observeret i MEF’er, hvis mobile fraktion faldt fra en værdi tæt på 40% til en værdi omkring 27% (figur 4C). Recovery tid blev også berørt, i MCF10A celler steg fra 6,5 ​​± 0,4 sekunder til 8,0 ± 1,2 sekunder, mens i MEF celler steg fra 8,2 ± 0,2 til 9,5 ± 0,1 sekunder (Figur 4E).

Fra de opnåede resultater i dette afsnit, konkluderer vi, at i MDA-MB-231 celler, både actin mobile fraktion og tidsforløbet for bedring er upåvirket af tilstedeværelsen af ​​ekstracellulære vækstfaktorer og regulering membran af PIP

3 niveauer.

PfnI opregulering øger cellestørrelsen og antallet af FA’er

flere actinbindende proteiner dereguleret i cancercellelinier [28], [52], blandt dem profilin (PfnI), der blev foreslået som en tumorsuppressorprotein [27], [30]. PfnI ekspressionsniveauerne er betydeligt nedreguleret i forskellige typer adenocarcinomceller.