PLoS ONE: Amygdalin Influences blærekræft Cell Adhesion og invasion i Vitro

Abstrakt

cyanogene diglucosid amygdalin, der stammer fra Rosaceae kerner, er ansat af mange patienter som en alternativ anti-cancer behandling. Men om amygdalin faktisk virker som et anti-tumor middel er ikke klart. Metastase blokerende egenskaber af amygdalin på blærekræft cellelinjer blev derfor undersøgt. Amygdalin (10 mg /ml) blev påført UMUC-3, TCCSUP eller RT112 blære cancerceller i 24 timer eller i 2 uger. Tumorcelleadhæsion til vaskulært endotel eller til immobiliseret collagen samt tumorcellemigration blev undersøgt. Virkninger af lægemiddelbehandling på integrin α og p subtyper, på integrin-linked kinase (ILK) og total og aktiveret fokal adhæsion kinase (FAK) blev også bestemt. Integrin knock-down blev udført for at vurdere integrin indflydelse på migration og vedhæftning. En 24 h eller to uger amygdalin ansøgning tydeligt reduceret tumor celle vedhæftning og migration af UMUC-3 og RT112 celler. TCCSUP vedhæftning blev også reduceret, men migration blev forhøjet under amygdalin. Integrin subtype ekspression blev signifikant og specifikt ændret af amygdalin afhængigt af cellelinjen. ILK var moderat, og aktiveret FAK kraftigt, tabt i alle tumorcellelinier i nærvær af amygdalin. Banke ned af β1 integrin forårsagede et signifikant fald i både adhæsion og migrering af UMUC-3-celler, men en betydelig stigning i TCCSUP adhæsion. Banke ned af β4 integrin forårsagede et signifikant fald i migration af RT112 celler. Da de forskellige aktioner i amygdalin på de forskellige cellelinjer blev afspejlet af β1 eller p4 vælte, postuleres det, at amygdalin påvirkninger vedhæftning og migrerende egenskaber af blære kræftceller ved at modulere β1 eller β4 integrin udtryk. Den amygdalin inducerede stigning i TCCSUP vandrende adfærd indikerer at de anti-tumor fordele fra amygdalin (set med de andre to cellelinjer) kan afhænge af kræft celletype

Henvisning:. Makarević J, Rutz J, Juengel E , Kaulfuss S, Tsaur I, Nelson K, et al. (2014) Amygdalin Påvirker blærekræft Cell Adhesion og Invasion

In Vitro

. PLoS ONE 9 (10): e110244. doi: 10,1371 /journal.pone.0110244

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: Juni 23, 2014, Accepteret: 14. september 2014 Udgivet: 15 oktober 2014

Copyright: © 2014 Makarević et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af “Brigitta und Norbert Muth Stiftung” og “Freunde und Förderer der Goethe-Universität Frankfurt” (finansiering modtaget af RAB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

anvendelse af komplementær og alternativ medicin (CAM) er steget støt gennem de seneste årtier. CAM omfatter ikke-konventionel behandling såsom homøopati, vitamin terapi, Phytomedicine og traditionel kinesisk medicin, akupunktur og yoga [1]. Forbruget af naturlige produkter er mest udbredt. Op til 80% af kræftpatienter i USA [2], og mere end 50% af kræftpatienter i Europa bruger CAM sammen med eller i stedet for konventionel behandling [3]. Utilfredshed med konventionel behandling og nedbringelse af kemoterapeutiske bivirkninger er de mest almindeligt begrundes brug af CAM [4], [5].

I modsætning til den udbredte brug af naturlige forbindelser, information om deres terapeutiske effektivisering er sparsom. Forskellen mellem brug og faktuel fordel er især tydelig med cyanogene diglucosid amygdalin (D-mandelonitril-β-gentiobioside), til stede i kerner af frugter fra Rosaceae arter såsom Prunus persica (fersken), Prunus armeniaca (abrikos) og Prunus amygdalus amara (bitter mandel). Amygdalin blev første gang isoleret i 1873. Siden 1920’erne har amygdalin blevet mundtligt anvendt til behandling af kræftpatienter i USA. I 1950’erne blev en intravenøs form for amygdalin syntetiseret og patenteret som Laetrile [6]. Selvom Laetrile er forskellig kemisk fra amygdalin, der udtrykkene i flæng, hvilket gør tolkning af kliniske data vanskelig. Nærværende rapport udelukkende henviser til “amygdalin”.

Amygdalin var en af ​​de mest populære, ikke-konventionelle, anti-cancer behandlinger i 1970’erne og i 1978 havde 70.000 amerikanske kræftpatienter brugt amygdalin [7]. Stadig, evidensbaseret forskning om amygdalin var og er sparsom og dens fordel kontroversielle. Fortalere overveje amygdalin en naturlig kræft kur, mens modstanderne advarer om, at amygdalin er ineffektiv og endda giftige. Randomiserede kliniske forsøg og opfølgende undersøgelser er aldrig blevet gennemført. En klinisk undersøgelse sponsoreret af National Cancer Institute 30 år siden afslørede ikke tegn på tumor regression [8], mens en retrospektiv analyse af 67 tumor patienter, der tager amygdalin rapporteret 2 komplet og 4 partielle responser [9]. Ambivalens er også blevet afspejlet i case-rapporter, hvor amygdalin var ineffektive i fem og effektivt i fire tilfælde [6].

Den foreliggende undersøgelse blev designet til at vurdere, om amygdalin ændrer metastatisk tumor celle progression in vitro siden invasionen og metastase er kritiske trin i ondartet tumor progression og den vigtigste årsag til behandlingssvigt. Derfor forstyrrer tumor celle invasion kaskade kan være en innovativ løsning til at modvirke tumor formidling metastatisk. Anvender et panel af blærekræft cellelinier blev effekten af ​​amygdalin at blokere tumor-matrix og tumor endotel interaktion evalueret. Derudover skal muligheden for amygdalin forhindre motile spredning blev vurderet. En kohorte af adhæsionsmolekyler er involveret i den komplekse proces formidling tumor celle. Da adhæsionsreceptorer af integrin α og β familie er tæt involveret i tumor celle binding og transendothelial penetration, disse var de genstande af undersøgelsen. Membranøs integrinreceptor ekspressionsprofil, samt intracellulært protein indholdet af hver undertype, blev sammenlignet i amygdalin behandlede og ikke-behandlede celler. siRNA vælte undersøgelser blev også udført for at undersøge de parametre ændret af amygdalin, som kan have klinisk relevans. In vitro data, der præsenteres her, peger på betydelig vedhæftning og invasion blokerende virkning af amygdalin, sandsynligvis fremkaldt ved at ændre β1 eller β4 integrin udtryk.

Materialer og metoder

Cell kultur

RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Tyskland) og TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blærecarcinomceller blev dyrket og subdyrket i RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum (FCS), 20 mM HEPES-puffer , 1% Glutamax og 1% penicillin /streptomycin (alle: Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Subkulturer fra passager 7-24 blev udvalgt til eksperimentel brug. Humane endotelceller (HUVEC) blev isoleret fra humane umbilical årer og høstet ved enzymatisk behandling med dispase (Gibco /Invitrogen). HUVEC blev dyrket i Medium 199 (M199; Biozol, München), suppleret med 10% FCS, 10% poolet humant serum, 20 pg /ml endotelcellevækst faktor (Boehringer, Mannheim, Tyskland), 0,1% heparin, 100 ng /ml gentamycin og 20 mM HEPES-buffer (pH 7,4). Subkulturer fra passager 2-6 blev udvalgt til eksperimentel brug. HUVEC blev anvendt i undersøgelsen. Den institutionelle etiske udvalg af Goethe-Universitetshospital, Frankfurt am Main, Tyskland, godkendt undersøgelsen og givet afkald på, at et samtykke, da HUVEC blev brugt anonymt til in vitro-assays med nogen forbindelse til patientdata.

Amygdalin behandling

Amygdalin fra abrikoskerner (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) var frisk opløst i tumor celledyrkningsmedium og derefter tilsat til tumorceller i en koncentration på 10 mg /ml i enten 24 timer eller i 2 uger [10 ] til at evaluere akut versus kronisk behandling. Kontroller modtog tumor celledyrkningsmedium alene. I alle eksperimenter blev behandlet tumor cellekulturer sammenlignet med de ikke-behandlede dem. For at udelukke toksiske virkninger af amygdalin blev cellelevedygtigheden bestemt ved trypanblåt (Gibco /Invitrogen).

Tumor celleadhæsion

At analysere tumorcelleadhæsion, HUVEC blev overført til 6-brønds multiplates ( Sarstedt, Nürnbrecht, Tyskland) i komplet HUVEC-medium. Når sammenflydende, RT112, UMUC-3 eller TCCSUP celler blev løsnet fra dyrkningskolberne ved Accutase behandling (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) og 0,5 × 10

6 celler blev derefter tilsat til HUVEC monolag i 30, 60 eller 120 min. Efterfølgende blev ikke-adhærente tumorceller vasket af med opvarmede (37 ° C) Medium 199. De tilbageværende celler blev fikseret med 1% glutaraldehyd. Adhærente tumorceller blev talt i fem forskellige områder af en defineret størrelse (5 x 0,25 mm

2) ved anvendelse af et fasekontrastmikroskop og middelværdien cellulær adhæsion blev beregnet.

Attachment til immobiliseret collagen

6-brønds plader blev overtrukket med kollagen G (ekstraheret fra kalveskind, bestående af 90% kollagen type i og 10% kollagen type III Biochrom, Berlin, Tyskland, fortyndet til 400 ug /ml i PBS) natten over. Plastskåle tjente som baggrundskontrol. Pladerne blev vasket med 1% BSA (bovint serumalbumin) i PBS for at blokere ikke-specifik celleadhæsion. 0,5 × 10

6 tumorceller blev derefter tilsat til hver brønd og efterladt i 60 min inkubation. Efterfølgende blev ikke-adhærente tumorceller vasket af, blev de resterende adhærerende celler fikseret med 1% glutaraldehyd og talt mikroskopisk. Den gennemsnitlige celleadhæsion sats, defineret af adhærente celler

belagt godt – vedhængende celler

baggrund, blev beregnet ud fra fem forskellige observation felter

Måling af tumor celle migration

Serum induceret. kemotaktisk bevægelse blev undersøgt ved hjælp af 6-godt Transwell kamre (Greiner, Frickenhausen, Tyskland) med 8- um porer. 0,5 × 10

6 RT112, UMUC-3 eller TCCSUP celler /ml blev placeret i det øverste kammer i serum-frit medium, enten fri for amygdalin (ophørt “amygdalin A”) eller indeholder amygdalin (ophørt “amygdalin B”) . Serumfrit medium i det øvre kammer og 10% serum i det nedre kammer billede serum gradient nødvendig for tumorcellemigration i denne model. Efter 20 h inkubation blev den øvre overflade af Transwell membran forsigtigt aftørres med en vatpind til at fjerne celler, der ikke havde migreret. Celler, der var flyttet mod serum gradient til den nedre overflade af membranen blev farvet under anvendelse af hæmatoxylin og talt mikroskopisk. Vandringshastigheden middelværdi blev beregnet ud fra fem forskellige observation felter.

Integrin overfladeekspression

Tumorceller blev vasket i blokeringsopløsning (PBS, 0,5% BSA) og derefter inkuberet i 60 minutter ved 4 C med phycoerythrin (PE) -konjugeret monoklonale antistoffer rettet mod følgende integrin undertyper: anti-a1 (lgG1; klon SR84), anti-a2 (IgG2a; klon 12F1-H6), anti-a3 (lgG1; klon C3II.1), anti-α4 (lgG1; klon 9F10), anti-α5 (lgG1; klon IIA1), anti-α6 (IgG2a; klon GoH3), anti-β1 (lgG1; klon MAR4), anti-β3 (lgG1; klon VI-PL2 ) eller anti-β4 (IgG2a, klon 439-9B; alt: BD Pharmingen, Heidelberg, Tyskland). Integrin udtryk for tumorceller blev derefter målt ved hjælp af en FACscan (BD Biosciences, Heidelberg, FL-2H (log) kanal histogram analyse 1 × 10

4 celler /scan) og udtrykt som gennemsnit fluorescensenheder. En mus IgG1-PE (MOPC-21) eller IgG2a-PE (G155-178; alt: BD Biosciences). Blev anvendt som en isotypekontrol

Western blotting

For at undersøge integrin indhold, tumor cellelysater blev påført en 7% polyacrylamidgel og elektroforesebehandlet i 90 minutter ved 100 V. proteinet blev derefter overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokering med fedtfri tørmælk i 1 time, blev membranerne inkuberet natten over med de monoklonale antistoffer, der er anført ovenfor. Endvidere blev integrin-signalering udforsket af anti-integrin-linked kinase (ILK; klon 3, fortynding 1:1000), anti-fokal adhæsion kinase (FAK, klon 77, fortynding 1:1000) og anti-phospho-specifik FAK (pY397, klon 18, fortynding 1:1000) antistoffer (alle: BD Biosciences). HRP-konjugeret gede-anti-muse-IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA; fortynding 1:5.000) tjente som det sekundære antistof. Membranerne blev kortvarigt inkuberet med ECL detektionsreagens (ECL ™, Amersham /GE Healthcare, München, Tyskland) for at visualisere proteinerne, og derefter analyseret ved Fusion FX7 systemet (Peqlab, Erlangen, Tyskland). β-actin (1:1.000, Sigma, Taufenkirchen, Tyskland). tjente som intern kontrol

Gimp 2.8 software blev anvendt til at udføre pixeltæthed analyse af proteinbåndene. Forholdet mellem protein intensitet /β-actin intensitet blev beregnet, og udtrykt i procent, i forhold til kontrol sat til 100%.

siRNA vælte undersøgelser

tumorceller (3 × 10

5/6-brønd) blev transficeret med lille interfererende RNA (siRNA) rettet mod integrin β1 (2 uM, målsekvens: AAAAGTCTTGGAACAGATCTG, HS_ITGB1_5, Qiagen, Hilden, Tyskland) eller integrin β4 (2 uM, målsekvens: GTGGATGAGTTCCGGAATAAA; Hs_ITGB4_5 , Qiagen) med en siRNA /transfektionsreagens (HiPerFect transfektionsreagens; Qiagen) forhold på 01:06. Ikke-behandlede celler og celler behandlet med 5 nM kontrol siRNA (Alle stjerner negativ kontrol siRNA; Qiagen) tjente som kontroller. Efterfølgende blev tumorcelleadhæsion til immobiliseret collagen samt tumorcellemigration analyseret som anført ovenfor.

Statistik

Alle eksperimenter blev udført 3-6 gange. Statistisk signifikans blev bestemt ved Wilcoxon-Mann-Whitney-U-test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på ap værdi mindre end 0,05.

Resultater

Amygdalin mindsker tumor-endotel og tumor matrix interaktion

Amygdalin væsentligt reduceret fastgørelse af alle tre blærekræft celle linjer til HUVEC sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 1). Celleadhæsion af TCCSUP og RT112 blev stærkere ændret af amygdalin end UMUC-3-celler. Ingen forskel mellem kortsigtet (24 timer) og lang sigt (2 uger) amygdalin behandling var tilsyneladende. Bindingskapacitet UMUC-3, TCCSUP og RT112 celler til immobiliseret collagen var også signifikant nedreguleres, sammenlignet med kontroller (fig. 2). Udvidelse af behandlingsperioden fra 24 timer til 2 uger ikke yderligere at øge blokerende potentiale amygdalin. Intet tegn på toksicitet, der skyldes amygdalin blev registreret af trypan udelukkelse test blå.

Tumorceller blev behandlet med 10 mg /ml amygdalin i enten 24 timer eller i 2 uger. Kontroller modtog celledyrkningsmedium alene. 0,5 × 10

6 tumorceller /brønd blev tilsat til HUVEC-monolag i 0,5, 1 og 2 timer. Mean adhærente tumorceller fra fem felter blev beregnet og afbildet som procent af kontrol 100% (stiplet linje). En repræsentant for seks eksperimenter er vist. * Viser signifikant forskel med kontroller.

Tumorceller blev behandlet med 10 mg /ml amygdalin i enten 24 timer eller i 2 uger. Celler ikke behandlet med amygdalin tjente som kontrollerne. 0,5 × 10

6 celler /brønd blev tilsat til immobiliseret collagen i 60 min. Gennemsnitlige antal adhærente tumorceller fra fem felter blev beregnet. En repræsentant for seks eksperimenter er vist. * Angiver signifikant forskel til kontrol.

Amygdalin ændrer vandringsadfærd af tumorceller

udsættes tumorcellerne til amygdalin i 24 timer ikke ændre deres vandrende aktivitet (fig. 3) . Men efter en 2 uge forbehandlingsperiode antallet af UMUC-3 og RT112 som ligger under Transwell kammer membranen blev reduceret, sammenlignet med de ubehandlede kontrolceller. Den inhiberende virkning i UMUC-3-celler var mere udtalt, når amygdalin forblev i celledyrkningsmediet under 20 timer vandrende inkubation ( “amygdalin B”) sammenlignet med amygdalin medium ( “amygdalin A”). Denne forskel i 20 timer vandrende inkubation med eller uden amygdalin blev ikke påvist i de RT112 celler, hvor migration blev blokeret i et lignende omfang. I modsætning til RT112 og UMUC-3-celler, en massiv stigning i TCCSUP cellevandring efter 2 uger amygdalin forbehandling blev bemærket.

Tumorceller behandlet med amygdalin i 24 timer eller i 2 uger blev podet i det øvre kammer med en kemo-tiltrækningsstof i den nedre brønd. Cellerne fik lov til at bevæge sig i 20 timer, enten i amygdalin-frit medium (amygdalin-A) eller i amygdalin-holdigt medium (amygdalin-B). Celler migrerer til den nedre membranoverflade blev talt. Kontroller blev sat til 100%. En repræsentant for seks eksperimenter er vist. * = Signifikant forskel til kontrol. # = Signifikant forskel mellem amygdalin-A og amygdalin-B.

Amygdalin virker på integrin α og β overflade udtryk

integrin undertyper α2, α3, α5, α6, β1 og β3 var stærkt udtrykt på UMUC-3 celler blev α4 meget moderat udtrykt og α1 og β4 blev ikke udtrykt (fig. 4, til venstre). Amygdalin forhøjede α3 men reduceret α5, α6, β1 og β3, uafhængig af eksponeringstid. Ingen amygdalin induceret ændring blev bemærket i α4 integrin. Den α2-receptor blev nedreguleret efter 24 timer, men opreguleret efter 2 uger amygdalin eksponering (fig. 4, højre). TCCSUP celler tydeligt udtrykte α2, α3, α5, α6, β1 og p4 integrin medlemmer (fig. 5, venstre). Den β3 type var moderat til stede på celleoverfladen. Både a1 og a4 undertyper var ikke påvises. Amygdalin førte til en betydelig stigning i integrin α5, α6, β1 og β4 på TCCSUP, hvorved 2 uger ansøgning inducerede stærkere virkninger end de 24 timers inkubering (fig. 5, højre). A2 og p3 undertyper blev forbedret efter 2 uger, men ikke efter 24 timer. α3 blev ikke ændret ved amygdalin. RT112 celler blev præget af en høj α2, α3, α6, β1 og β3 udtryk niveau (fig. 6, til venstre). Integrin α5 var moderat til udtryk, og β3 blev kun let hævet over baggrunden. Integriner α1 og α4 blev ikke udtrykt på RT112 celler. Integrinerne α3, α6, β3 og β4 blev alle undertrykt af amygdalin (fig. 6, højre). Virkningerne på α3 og β3 ikke afhænge af, om amygdalin var blevet anvendt i 24 timer eller 2 uger, mens α6 og β4 blev formindsket i højere grad efter 2 uger, sammenlignet med 24 timer. α2 tydeligt forøget efter 2 uger, men ikke efter 24 timer, og α5 og β1 forblev uændret ved amygdalin.

venstre panel viser integrin udtryk som histogram plots med en stiplet linje, der angiver baggrund fluorescens og en solid linje indikerer specifik fluorescens i ubehandlede celler. Højre panel viser integrin undertype udtryk efter 24 timer og 2 uger amygdalin eksponering, sammenlignet med kontroller, der er på 100%. N.C. = Ikke beregnet. * Angiver signifikant forskel til kontrol.

Det venstre panel viser integrin udtryk som histogram plots med en stiplet linje, der angiver baggrund fluorescens og en solid linje indikerer specifik fluorescens. Højre panel viser integrin undertype udtryk efter 24 timer og 2 uger amygdalin eksponering, sammenlignet med kontroller, der er på 100%. N.C. = Ikke beregnet. * Angiver signifikant forskel til kontrol.

Det venstre panel viser integrin udtryk som histogram plots med en stiplet linje, der angiver baggrund fluorescens og en solid linje indikerer specifik fluorescens. Højre panel viser integrin undertype udtryk efter 24 timer og 2 uger amygdalin eksponering, sammenlignet med kontroller, der er på 100%. N.C. = Ikke beregnet. * Angiver signifikant forskel til kontrol.

Ændringer af integrin proteiner ved amygdalin

Ændringer af integrin proteinindhold induceret af amygdalin er vist i figur 7 (venstre) og kvantificering udtrykkes som procentvise forskel mellem kontrol- tumorceller og tumorceller behandlet med amygdalin (højre). I UMUC-3 celler, α6 og β3 blev undertrykt af både 24 timer og 2 uger amygdalin ansøgning, mens α2 og β1 var opreguleret. En amygdalin inducerede stigning i α5 var tydelig, men denne virkning var begrænset til 2 uge amygdalin ansøgning. α3 integrin var lidt forbedret i forhold til kontroller efter 24 timer, men ikke efter 2 uger. Integrinerne α1, α4 og β4 var ikke påviselig ved Western blotting. Den integrin relaterede signalering proteiner ligesindede og pFAK blev formindsket efter 2 uger amygdalin ansøgning. Lignende sag blev udøvet på TCCSUP celler, da α2, α5 og β1 steget og β3 faldt under amygdalin (2 uger 24 h). I modsætning til UMUC-3 blev α6 forstærket efter 24 timer, men nedsat efter 2 uger. β4, ikke udtrykkes i UMUC-3, blev nedreguleret ved amygdalin (2 uger 24 h). Den to uger amygdalin ansøgning førte til et tab af pFAK og lidt formindsket ILK. Evaluering af RT112 afslørede forøget α2 integrin forårsaget af 24 timer eller 2 uger amygdalin behandling. a6 og p4 integriner blev nedreguleret med to uger 24 timer. Der var også en lille stigning i α3 efter 24 timer, men ikke efter 2 uger, et fænomen ses også i UMUC-3 celler. Modsat UMUC-3 og TCCSUP, den α5 undertype i RT112 var kun moderat påvises i kontrol- celler og blev yderligere formindsket efter medicinsk behandling. Amygdalin desuden påvirket integrin relaterede signalering i RT112, fremgår af formindsket FAK og pFAK.

Controls forblev ubehandlet. p-actin tjente som den interne kontrol. Figuren viser en repræsentant fra tre separate forsøg. n.d. angiver “ikke påviselig”. Kvantificering af integrin undertype udtryk er afbildet til højre. Pixeltæthed er givet i procent sammenlignet med kontroller ikke er behandlet med amygdalin. * Angiver signifikant stigning efter både 24 timer og 2 uger amygdalin behandling, #indicates signifikant fald efter både 24 timer og 2 uger amygdalin behandling, sammenlignet med kontrolgruppen.

β1 og β4 integrin knockdown

Amygdalin tydeligt ændret integrin udtryk profilen af ​​alle tre blære kræft cellelinjer. For at undersøge om integrin modifikationer er relevante for metastatisk progression, vælte undersøgelser blev udført med p-integrin medlemmer tjener som repræsentanter. Da β1 (men ikke β3 og β4) blev overudtrykt på kontrol UMUC-3 og TCCSUP og væsentligt mindre af amygdalin, blev β1 slået ned i disse celler og vedhæftning og migrationseksperimenter gentagne (fig. 8). Den β1 integrin blev også meget udtrykt på RT112 men ikke ændret af amygdalin, i modsætning til p4 der opfyldte begge kriterier, dvs. høj initial udtryk og betydelig graduering af amygdalin. Derfor blev β4 bankede ned i RT112 cellelinje før underkastelse til vedhæftning og migration assay (fig. 8, nederst til højre). Tab af β1 var ledsaget af en signifikant reduktion i UMUC-3-binding (fig. 8) og migration (fig. 9). På den anden side blev TCCSUP binding til collagen forstærket (fig. 8), hvorimod TCCSUP migration ikke var påvirket af β1 banke ned (fig. 9). Ned-regulering af β4 integrin i RT112 celler ændrede ikke vedhæftning (fig. 8), men massivt blokeret migration (fig. 9).

Tumor celler blev transficeret med integrin β1 eller p4 siRNA. Ikke-behandlede celler (kontrol) og celler behandlet med røræg siRNA (siRNA kontrol) tjente som kontroller. Effektivitet af receptor knockdown blev evalueret ved Western blotting (nederst til højre). En repræsentant for seks eksperimenter er vist. * Angiver signifikant forskel til kontrollerne.

Tumor celler blev transficeret med integrin β1 eller p4 siRNA eller krypteret siRNA (siRNA kontrol). Kontroller forblev ubehandlet (kontrol). Værdier er vist som migrerede celler pr 0,25 mm

2. En repræsentant for seks eksperimenter er vist. * Viser signifikant forskel til den ubehandlede kontrol. Indsætte taget fra figur 8.

Diskussion

Eftersom tumorcelle interaktion med det vaskulære endotel er nødvendig for tumorceller at forlade blodstrømmen i virksomheden på sekundære steder, forstyrrer denne proces er afgørende for at hindre metastase. Denne rapport viser, at amygdalin i væsentlig grad hæmmer fastgørelse af blære cancerceller til endotelceller. Da amygdalin reducerer antallet af tumorceller, kan færre celler kravle under endotel lag for at etablere kontakt med matrixproteiner at metastaserer. Det næste trin i metastase involverer collagenmatrix. Interaktion af tumorceller med kollagen, skal ikke kun ske for at undslippe den primære tumor, men også for at give invasiv spredes til målorganet, når tumorcellerne har gennemløbet den endotheliale blod barrieren [11]. I nærvær af amygdalin, tumorcellerne anvendt i denne undersøgelse mistet deres evne til at binde til immobiliseret collagen. Derfor kan amygdalin langsom metastatisk progression ved at forhindre mekaniske kontakter af cirkulerende tumorceller til karvæggen og subendoteliale matrix. formidling tumor, er imidlertid ikke begrænset til binding. Cellerne skal også løsnes fra matrixproteiner at invadere væv. Amygdalin påvirket migrationen kapacitet af alle blærekræft cellelinier efter 2 uger, men ikke efter 24 timer, hvilket indikerer, at langvarig behandling kan være nødvendigt at ændre tumorcellemotilitet.

Amygdalin optræden på den anden tumor celle linjer var ikke identiske. Migration af UMUC-3 og RT112 blev blokeret, mens antallet af migrerende TCCSUP celler steg med amygdalin. Det betyder, at selvom amygdalin formindsker vedhæftning niveau ved alle cancercellelinier, er der risiko for, at kronisk amygdalin eksponering til enkelte tilbageværende celler af en bestemt tumor undertype som TCCSUP kan resultere i øget lokomotiv aktivitet. Hvad enten det skyldes en erhvervet eller indre resistens eller på grund af udviklingen af ​​uønsket tilbagekoblingssløjfer fortsat uklar, men det betyder indikere, at ikke alle blærecancerpatienter kan drage lige godt fra amygdalin. I tråd med denne spekulation er det for nylig blevet vist, at udviklingen af ​​resistens er ledsaget af en funktionel omskifter af integrinreceptorer, kørsel tumorceller til høj motilitet [12].

Chen et al. nylig spekuleret på, at tumorceller med en høj hastighed migration er langt mere tilbøjelige til at metastaserer end dem med en lav hastighed migration [13]. Dette kunne imidlertid ikke bekræftes af en anden undersøgelse, hvor antallet af migrerende tumorceller og afstanden og hastigheden af ​​migrering ikke korrelerer med maligne potentiale af tumorcellerne [14]. Snarere retning af cellemotilitet indikerede malignt potentiale cancercellerne [14]. For at få yderligere forståelse, har dyreforsøg netop blevet indledt for at undersøge in vivo tumor progression under amygdalin behandling.

rolle integriner i at danne celle-celle og celle-matrix obligationer, der er nødvendige for vedhæftning, ekstravasation og migration har været anbrud [15], [16], hvorved β1 integrin-underenheden blev vist at spille en central rolle i blæren cancercellelinie T24. Det er dog ikke alle blærekræft cellelinjer kendetegnet ved den samme integrin mønster. I den foreliggende undersøgelse amygdalin modificeret vedhæftning og migration og ændret integrin udtryk profiler forskelligt i forskellige cellelinier. Integrin β4 blev ikke udtrykt på UMUC-3, men på RT112 og TCCSUP, mens β3 kun var marginalt påvises på RT112 men stærkt påvises i UMUC-3 og TCCSUP celler. En undersøgelse involverer indflydelsen af ​​valproinsyre på blæren celleadhæsion til collagen [17], har også afsløret modifikation af integrin ekspressionsprofilen afhængigt af cellelinjen anvendes. Andre forskere har rapporteret forskellige integrin underfamilier i UMUC, T24, J82, RT-4, 253J og Hu456 celler [18], [19]. Hver cellelinie kan derfor besidder en karakteristisk receptor sæt og lægemiddelbehandling kan påvirke integrin underfamilier forskelligt.

Undersøgelser af prostatacancerceller har afsløret, at den oprindelige integrin profil af en bestemt tumor klon kan bestemme sin molekylære respons på narkotikabehandling [20]. Faktisk amygdalin påvirket integrin sammensætning af de vurderede blære tumorceller forskelligt. I UMUC-3 celler β1 og β3 overflade ekspression blev formindsket med amygdalin, men forstærket i TCCSUP celler. I RT112 celler β4 stedet for β1 blev ændret af amygdalin. Intracellulær og membran integrin niveauer blev også forskelligt påvirket af amygdalin i UMUC-3 og TCCSUP celler. I UMUC-3 celler intracellulær β1 integrin blev ophøjet og overfladeekspression blev formindsket, hvilket indikerer, at amygdalin inducerer translokation af β1 integrin bort fra overfladen membran. I TCCSUP celler p1 integrin ekspression blev øget både intracellulært og på overfladen membran. Amygdalin inducerede et fald i intracellulært β3 integrin i begge UMUC-3 og TCCSUP celler. Overfladeekspression, var imidlertid ikke det samme, med UMUC-3-celler viser en amygdalin induceret fald i β3 integrin og TCCSUP celler viste en stigning. Den vigtigste translokation i TCCSUP celler fra cytoplasmaet til overflademembranen synes derfor at rettet mod β3 integrin.

Fjernelse af visse integrin undertyper fra celleoverfladen er ikke den eneste mekanisme regulerer kræft celleadhæsion. Integrin handel mellem intracellulære rum og celleoverfladen har vist sig at være en nødvendig forudsætning for receptor fjernelse ved basis af celle- fremspring. Genanvendelse integrin tilbage til førende celle kant understøtter vedhæftning [21]. En præklinisk undersøgelse om renale cancerceller har vist, at både integrinreceptor op- og nedregulering kan køre kræftceller mod malignitet. Derfor terapeutisk intervention rettet mod ‘re-translokation »visse integrin molekyler kan give en mulighed for at forhindre malignitet [22].

Relevansen af ​​integriner til vedhæftning og migration blev påvist ved knock-down undersøgelser af p-integriner med enten høj initial overflade udtryk eller stærk amygdalin induceret ændring. Disse kriterier blev opfyldt for β1 i UMUC-3 og TCCSUP celler og for β4 i RT112 celler. Undertrykkelse af β1 korreleret godt med reduceret binding og migration aktivitet UMUC-3, som indrømmer in vitro-forsøg med T24 og 5637 celler [23], [24]. Derfor tab af β1 kan være en mekanisme, hvorved amygdalin bremser UMUC-3 tumor formidling. TCCSUP celler imidlertid opførte sig forskelligt under β1 blokade. Binding begivenheder til collagen faktisk steget, hvilket indikerer, at denne receptor i disse celler blokerer celle-celle- eller celle-matrix-kontakter. Differential integrin guidet klæbende adfærd forskellige tumor underlinjer er tidligere blevet observeret. Blokering af α3 underenheden har vist sig at inhibere HCV29 blærekræft cellebinding til matrixproteiner laminin og fibronectin, men har en modsat virkning på T24 og Hu456 celleadhæsion.