PLoS ONE: Methylering-Associated Delvis nedregulering af Mesothelin Årsager Modstand mod Anti-Mesothelin Immuntoksiner i en kræft i bugspytkirtlen Cell Linje

Abstrakt

Anti-mesothelin

Pseudomonas

eksotoksin A-baserede rekombinante immunotoxiner (RITS) udgør en potentiel behandling modalitet for pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC). At studere resistensmekanismer, blev den følsomme PDAC cellelinie KLM-1 intermitterende udsat for anti-mesothelin SS1-LR-GGS RIT. Overlevende celler var resistente over for forskellige anti-Mesothelin RITS (IC

50s 1 ug /ml), herunder det hidtil ukendte de-immuniseret RG7787. Disse resistente KLM-1-R-celler var lige følsomme over for anti-CD71 HB21 (Fv) -PE40 RIT som KLM-1, hvilket indikerer modstanden var specifikke for anti-Mesothelin RITS. Mesothelin genekspression blev delvis nedreguleret i KLM-1-R, hvilket resulterer i 5-fold lavere overflade proteinniveauer og nedsat cellulær optagelse af RG7787 sammenlignet med KLM-1. Bisulfit sekventeringsanalyse fandt, at mesothelin promotorregionen var signifikant mere methyleret i KLM-1-R (59 ± 3,6%) sammenlignet med KLM-1 (41 ± 4,8%), hvilket indikerer hypermethylering som en mekanisme til mesothelin nedregulering. DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidin restaureret oprindelige mesothelin overfladeekspression til mere end halvdelen i KLM-1-R og øget følsomhed over for RG7787 (IC

50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml), selvom celler forblev signifikant mindre følsomme i forhold til parentale KLM-1-celler (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml). Mesothelin cDNA introduktion i KLM-1-R førte til fem gange højere overflade protein niveauer og væsentligt højere RG7887 optagelse i forhold til KLM-1. Som følge heraf blev den oprindelige følsomhed over for RG7787 fuldt restaureret (IC

50 = 4,49 ± 1,11 ng /ml). En signifikant højere RG7787 optagelsen blev således kræves for at nå det oprindelige cytotoksicitet i resistente celler, antyder, at intracellulær RIT menneskehandel er også en begrænsende faktor. RNA dyb sekventering analyse af KLM-1 og KLM-1-R-celler støttede vores eksperimentelle resultater; sammenlignet med KLM-1, resistente celler udviste differentiel ekspression af gener forbundet med intracellulær transport og et ekspressionsmønster, der matchede en mere generel hypermethylering status. Afslutningsvis resistens over for anti-Mesothelin RITS i KLM-1 er koblet til en methylering-associeret nedregulering af mesothelin, mens afvigelser i RIT trafficking også kan spille en rolle

Henvisning:. Hollevoet K, Mason- Osann E, Müller F, Pastan i (2015) Methylering-Associated Delvis nedregulering af Mesothelin Årsager Modstand mod Anti-Mesothelin Immuntoksiner i en kræft i bugspytkirtlen Cell line. PLoS ONE 10 (3): e0122462. doi: 10,1371 /journal.pone.0122462

Modtaget: December 23, 2014; Accepteret: 17 Februar 2015; Udgivet: 24 marts 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af National Institutes of Health, National Cancer Institute, center for Cancer Research, og ved en aftale fælles forsknings- og udviklingsaftale (# 2791) mellem National Cancer Institute og Roche Pharmaceuticals. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. K.H. blev delvist understøttet af fonden for Videnskabelig Forskning Flandern (FWO, Belgien). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne forskning blev delvist støttet af Roche Pharmaceuticals. I.P. er en opfinder på adskillige patenter på immunotoksiner der alle er blevet overdraget til NIH (herunder US 8.357.783 “Humane anti-Mesothelin monoklonale antistoffer”, US 20120263674 “Pseudomonas exotoxin en med reduceret immunogenicitet” og US 20140094417 “Pseudomonas exotoxin en med mindre immunogen T-celle og /eller B-celle-epitoper “). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Vores laboratorium udvikler rekombinante immuntoksiner (RITS) til kræftbehandling. Aktuelle RITS i kliniske forsøg er sammensat af et antigenbindende Fv fusioneret til et 38-kDa delen af ​​

Pseudomonas

exotoksin A (PE) [1]. Efter receptormedieret endocytose, er RITS processeres proteolytisk, og PE foreslås at trafikken til trans-Golgi-netværket og spil fra en retrograd vej til endoplasmatisk reticulum, hvor den undergår translokation til cytoplasmaet [2]. Ved ankomsten i cytosolen, PE henvender Forlængelse Factor-2 (EF-2). Modent EF-2 produceres ved posttranslationel modifikation af histidin 715 af Diphthamide biosyntese proteiner (DPH) 1-5 og 7 [3, 4]. Dette ændrede histidin ( “diphthamide«) er ADP-ribosyleret af PE, som inaktiverer EF-2 og standser proteinsyntese, i sidste ende fører til programmeret celledød [2].

Vi har tidligere isoleret og karakteriseret adskillige leukæmiske cellelinjer resistente over for

Moxetumomab pasudotox

[5-7], en anti-CD22 RIT øjeblikket i fase III klinisk forsøg (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01829711). Disse resistente cellelinier viser forskellige aberrationer i DPH ekspression, som forhindrer EF-2 ADP-ribosylering og beskytte celler mod proteinsynteseinhibering [5-7]. SS1 (dsFv) -PE38 (SS1P), en anden RIT i kliniske forsøg, er rettet mod mesothelin, en 40-kDa celleoverfladen glycophosphatidylinositol (GPI) -forankret protein [8], der er stærkt til udtryk i flere maligniteter, herunder lungehindekræft og pancreas ductal adenocarcinom ( PDAC) [9-11]. SS1P har begrænset klinisk aktivitet som et enkelt middel, primært på grund af dosisbegrænsende PE immunogenicitet hos patienter [12, 13]. Som reaktion herpå har SS1P blevet kombineret med immun-nedbrydende kemoterapeutika, hvilket resulterer i et hidtil uset reaktioner hos patienter med refraktær fremskreden lungehindekræft [14], og lav immunogene RITS er blevet manipuleret, hvor mange B- eller T-celle epitoper og protease-følsomme regioner af PE38 er fjernet. Sidstnævnte resulterede i et trunkeret og de-immuniseret 24-kDa toksinenheden (PE24), som har mindre reaktivitet med humant anti-sera, er resistent over for lysosomal nedbrydning, og viser en nedsat uspecifik toksicitet hos gnavermodeller

in vivo

[15-18]. I samarbejde med Roche Innovation Center Penzberg, Tyskland, har denne PE24 rygrad blevet integreret i en ny anti-mesothelin RIT, kaldet RG7787, ved at knytte den til en humaniseret anti-mesothelin Fab, og derved øge størrelse og kredsløbssygdomme halveringstid [19].

Vi har for nylig viste, at RG7787 har betydelig aktivitet i en PDAC xenograft model, som blev etableret ved podning KLM-1 celler i immun manglende mus. RG7787 var også cytotoksisk mod flere andre PDAC cellelinjer, selv om

in vitro

celledrab ikke var absolut [19]. Vi har tidligere rapporteret, at en ubalance mellem pro- og anti-apoptotiske proteiner beskytter kræftceller, herunder PDAC, fra PE-induceret celledød [20-22]. For at få indblik i andre resistensmekanismer, er formålet med denne undersøgelse var at isolere og karakterisere celler fra KLM-1, der var resistente over for anti-Mesothelin RITS.

Materiale og metoder

rekombinante immunotoksiner og reagenser

Klinisk-grade anti-mesothelin SS1P og anti-CD25 LMB-2 [anti-Tac (Fv) -PE38] blev fremstillet og leveret af Advanced BioScience Laboratories, Inc. (Kensington, MD). huSS1 (Fab) -LR-GGS-LO10-PE24 (RG7787) blev leveret af Roche Innovation Center Penzberg, Tyskland i henhold til en aftale fælles forsknings- og udviklingsaftale (# 2791). Anti-mesothelin SS1 (dsFv) -LR-GGS-PE24 (SS1-LR-GGS) og anti-CD71 immuntoksin HB21 (Fv) -PE40 blev produceret i vores laboratorium, ifølge en standardprotokol [23]. Både SS1-LR-GGS og RG7787 er omlagte lavt immunogene versioner af SS1P, der består af en PE24 fragment. Specifikke modifikationer indbefatter fjernelse af hovedparten af ​​PE-domæne II, hvilket efterlader en furinkløvningssitet, og tilsætning af en Gly-Gly-Ser (GGS) -baseret peptidlinker efter furinkløvningssitet. RG7787 er yderligere optimeret til klinisk anvendelse ved at erstatte muse-anti-mesothelin Fv (SS1) med et humaniseret Fab (huSS1), for at øge størrelsen og derfor halveringstid i kredsløbet, og ved at indføre syv mutationer (R505A, R427A, R490A, R467A, D463A, R456A, og R538A) i det katalytiske domæne III i PE til tavshed B-celle epitoper [19]. 5-azacytidin (AZA) (Sigma) er en DNA-methyltransferase inhibitor, og blev opløst i RPMI-1640 medium.

Cellekultur

PDAC cellelinie KLM-1 [24] blev holdt i RPMI-1640 og forudsat i 2011 af Dr. Udo Rudloff (NCI, Bethesda, MD), som oprindeligt opnåede celle linje fra Riken Cell Bank. Epidermoid cancer A431-cellelinien blev opretholdt i DMEM og doneret i 1982 af Dr. George Todaro (NCI, Bethesda, MD), der oprindeligt isoleret cellelinjen [25]. Medier blev suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen). For at isolere resistente celler, 3 x 10

5 KLM-1-celler blev podet i en 6-brønds plade og inkuberet med 1 ug /ml SS1-LR-GGS i 72 timer, hvilket dræbte mere end 90% af cellerne (S1 fig.). Resterende celler blev ekspanderet i 5 uger i RIT-fri cellemedium, hvorefter en anden runde af selektion blev udført på lignende måde med 1 ug /ml SS1-LR-GGS, hvilket resulterer i KLM-1-R. Disse celler blev udvidet i RIT-frit medium og opbevares levedygtigt frosset i N

2 for yderligere undersøgelser. Cellelinie identiteter blev verificeret ved hjælp af kort tandem repeat analyse (NCI, Frederick, MD). Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2.

celleproliferation, celledød og proteinsyntese inhiberingsassays

KLM-1 og KLM-1 -R cellevækst blev sammenlignet ved at tælle levedygtige celler med en Cellometer Vision (Nexcelom). Døde celler blev udelukket ved anvendelse af trypanblå-farvning, og hvert tidspunkt blev talt tre gange. For at evaluere behandlingseffekt blev RITS tilsat ca. 16 timer efter podning af cellerne i en 6- eller 96-brønds plade. Vækstinhibering blev vurderet ved måling ATP-niveauer med Cell Titer-Glo Luminescent Cell Levedygtighed assay (Promega). Værdier blev normaliseret mellem kontrol af 1 pM staurosporin (Sigma-Aldrich) og puffer (Dulbeccos phosphatbufret saltvand uden Ca og Mg (D-PBS), Quality Biological, Inc.) indeholdende 0,2% humant serumalbumin (Afdeling for Veterinær Resources, NIH , Bethesda, MD) eller medium. Bright-field billeder blev taget på en Zeiss mikroskop med en 10X EF Plan-Neofluar mål ved hjælp af AxioCam MRC kameraet og AxioVision 4.7.2 erhvervelse software. Celledød blev evalueret ved brug af Annexin V-PE Apoptose Detektion Kit I (BD Pharmingen) ifølge producentens instruktioner. Apoptotiske celler blev anset Annexin V-positive, som bestemt ved slusning af ubehandlede celler. Proteinsyntese hæmning blev kvantificeret ved at måle [

3H] leucin (Perkin Elmer) inkorporering som udført tidligere [22]. Værdier er præsenteret i forhold til kontrol af D-PBS 0,2% humant serumalbumin og 100 pg /ml cycloheximide- (Sigma-Aldrich) behandlede kontroller.

Real-time RT-qPCR

RNA var isoleret og oprenset fra celler under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen), revers transkription blev udført med QuantiTect Reverse transcription kit (Qiagen), og amplifikation med QuantiFast SYBR Green PCR-kittet (Qiagen). Primersekvenser for DPH1-5, DPH7, mesothelin, og β-actin er vist i S1 tabel. Real-time RT-qPCR blev udført på en ABI HT 7900 RT-PCR-maskine, analyseres ved hjælp af den komparative C

metode T (ΔΔ

C

T) metode med SDS manager (Applied Biosystems) . og normaliseret for den endogene β-actin

overfladeprotein ekspression ved flowcytometri

Mouse anti-human mesothelin (MN; Rockland Immunochemicals, Inc.) og R-PE-anti-humant CD71 ( Biolegend) blev anvendt til at evaluere overflade proteinekspression. En muse-IgG-R-PE isotypekontrol (BD Biosciences) blev anvendt som en negativ kontrol for mesothelin farvning. Anti-mesothelin og isotypekontrol blev farvet med et sekundært gede-anti-muse-IgG-R-PE (1: 250 fortynding, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Fluorescensintensitet blev analyseret ved flowcytometri på en FACSCalibur. QuantiBRITE R-PE-perler (BD Pharmingen) blev anvendt til at kvantificere antallet af Mesothelin-bindingssteder per celle.

Shed Mesothelin niveauer i celle medium

Opløselige Mesothelin niveauer i cellelinie medium blev målt in duplo med et mesothelin Meso Scale assay (Morphotek, Inc.) ved anvendelse af elektrokemiluminescens teknologi Meso Scale Discovery. Celler blev podet i regelmæssig celledyrkningsmedium i en plade med 12 brønde. Efter 20 timer blev mediet opsamlet blev volumenet målt, og antallet af celler pr talt. Efter centrifugering mediet, blev supernatanter opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Cellesupernatant blev fortyndet 50 gange og sat til brønde i en plade med 96 brønde, der tidligere er overtrukket med opfangningsantistof. Proceduren blev udført som tidligere beskrevet [26], og signalerne blev målt på en MSD Discovery Workbench (Meso Scale Discovery). Mængden af ​​mesothelin skur af KLM-1 og KLM-1-R blev beregnet ved at gange den opnåede mesothelin koncentration med godt volumen, og standardiseret for antal optalte celler pr.

RG7787 cellulær optagelse

RITS blev mærket med Alexa Fluor 647 Labeling Kit (Invitrogen) i 3,5 timer og oprenset ifølge producentens instruktioner. Høstede celler blev inkuberet i 30, 75 og 150 min ved 37 ° C med en mættende 2 ug /ml SS1P-Alexa647 eller RG7787-Alexa647 og bearbejdet som tidligere beskrevet [22]. Fluorescensintensitet blev analyseret på en FACSCalibur. Optagelse blev udtrykt i antallet af internaliserede RG7787 molekyler, som blev beregnet ved at antage RG7787-Alexa647 GEOMEAN overfladeekspression af KLM-1 svarende til 60 x 10

3 RG7787 molekyler (= overflade mesothelin bindingssteder pr KLM-1 celle, som vurderet ved flowcytometri og QuantiBRITE R-PE-perler).

methyleringsanalyse

Evaluering af status for methylering af en region i mesothelin genpromotor site blev gjort ved EpigenDx (Hopkinton, MA). Bisulfit modifikation blev henrettet ved hjælp af Zymo Research EZ Methylering Gold kit. Genomisk DNA (500 ng) blev anvendt til bisulfit modifikation, efterfulgt af PCR-amplifikation under anvendelse Hot-Star Taq Polymerase (Qiagen). Pyrosekventering blev udført ved anvendelse af PSQ HS 96 Pyrosequencing System (Qiagen). Den analyserede region blev valgt på grundlag af tilgængelige primere (ADS2475-RS1 og ADS2475-RS2) på EpigenDx, som dækkede en 147 bp region opstrøms for mesothelin transkriptionsstartsitet (CHR16: 808.890-808.742; ENST00000563941). Methylering kvantificering blev udført med PyroQCpG software, der beregner for hver enkelt CpG forholdet mellem dets methylerede og ikke-methylerede form resulterer i den gennemsnitlige procentdel af methylering grad.

Mesothelin transfektion i KLM-1-R

KLM-1-R-celler blev transficeret ved lipofectamin (Invitrogen) med kontrol pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) eller pMH107, en pcDNA3.1 (+) vektor med fuld længde mesothelin cDNA og Geneticin som selekterbar markør [27]. Celler blev transficeret i tre dage, vælges med 6 ug /ml Geneticin og vedligeholdes i regelmæssig RPMI-medium med 3 ug /ml Geneticin. Enkelt celle sortering med en FACSVantage SE (BD Biosciences) og efterfølgende efterfølgende ekspansion resulterede i det monoklonale cellelinje KLM-1-R-

Msln

at stærkt og homogent udtryk mesothelin på overfladen.

toksin-induceret ADP-ribosylering af EF-2

Celler blev lyseret i RIPA buffer med proteasehæmmere (Roche Applied Science), og 3 ug cellelysat blev inkuberet med ADP-ribosylering buffer [20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 1 mM EDTA og 50 mM DTT], 5 pM 6-Biotin-17-NAD (Trevigen) og 10 ng af RG7787 til forskellige tidspunkter ved 25 ° C. Prøver blev underkastet SDS /PAGE efterfulgt af Western blotting med streptavidin HRP-konjugat (Invitrogen) for at detektere biotin ADP-ribosyleret EF-2.

Western blot-

Celler blev høstet, vasket med D- PBS, og opløst i RIPA buffer med proteasehæmmere (Roche Applied Science). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af et Coomassie Plus kit (Pierce). Lige store mængder protein blev påsat NuPAGE 4% -12% Bis-Tris-geler (Invitrogen) til SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen). De følgende primære antistoffer blev anvendt: muse-anti-MN (Rockland), kanin-anti-EF-2 # ab33208 (Abcam) og muse-anti-β-actin # 8226 (Abcam). HRP-konjugeret muse sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology) blev visualiseret med ECL eller ECL Plus substrater (GE Healthcare). EF-2 protein niveauer blev kvantificeret og korrigeret for β-actin med Image J [28].

RNA dyb sekventering og dataanalyse

Total RNA blev ekstraheret fra KLM-1 og KLM-1 -R celler ved anvendelse Qiagen RNeasy kit, og on-søjle DNA fordøjelse (Qiagen) blev udført ifølge producentens anvisninger. Efter RNA kvalitetskontrol med en Agilent Bioanalyzer, blev de samlede RNA-prøver sendt til bibliotekskonstruktion og dyb sekventering til NCI Core Facility (Bethesda, MD). De rå sekvenser blev kvalitet kontrolleres og tilpasses til RefSeq [29]. Rå tæller blev normaliseret og indlæses i Qlucore omik Explorer v_3.0 (35) til differentiel udtryk analyse. Anvendelse Qlucore s varians filter blev en liste over de 989 mest markant ændrede gener genereret som vi adskilt i op- og ned-regulerede gener.

Gene Set Enrichment Analyse

(GSEA) justering blev udført indefra Qlucore. For tilpasning til Gene Ontology- (GO), Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) – og Reactome-veje, op- og nedreguleret gen Listen blev indlæst i string-db.org [30] og p-værdier for datasæt med signifikante ændringer blev udvundet.

Statistisk analyse

Eksperimenter blev typisk udført uafhængigt mindst to gange, og vises repræsentative eller gennemsnitlige data. Data er præsenteret som middelværdi ± standardfejl på måling af replikate eksperimenter. Anvendt statistik omfatter Student t-test eller envejs ANOVA med Tukeys flere sammenligning tests. Statistisk analyse og figur udarbejdelse blev udført under anvendelse af GraphPad PRISM 6 (GraphPad Software, Inc.). En

s

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant, medmindre andet er angivet.

Resultater

KLM-1 celler isoleret efter SS1-LR-GGS inkubation er resistente til anti-mesothelin RITS Salg

Som beskrevet i metodeafsnittet blev KLM-1-celler intermitterende eksponeret med SS1-LR-GGS og overlevende celler (KLM-1-R) blev ekspanderet i RIT-frit medium. KLM-1 og KLM-1-R-celler blev ikke skelnes ved lyse-field mikroskopi (S2A Fig.), Og på flowcytometri frem og side scatter, hvilket indikerer en lignende celle størrelse og granularitet (S2B Fig.). Celleproliferation blev sammenlignet ved at pode 1 x 10

5-celler på dag 0, og tælle levedygtige celler dagligt i 6 dage. KLM-1-R-celler voksede betydeligt hurtigere end KLM-1 celler fra dag 2 på (

s

0,0001) (S2C Fig.). For at vurdere niveauet af resistens, KLM-1 og KLM-1-R-celler blev inkuberet i 72 timer med anti-Mesothelin RITS. ATP levedygtighed analyser viste, at KLM-1-celler var følsomme over for SS1-LR-GGS (IC

50 = 1,73 ± 0,01 ng /ml) og RG7787 (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml) efter aftale med tidligere resultater [19]. I modsætning hertil KLM-1-R-celler blev meget modstandsdygtige over for begge RITS (IC

50s 1 ug /ml) (figur 1A.) Og SS1P (data ikke vist). I resistente celler, der var et lille fald i celleproliferation ved RIT koncentrationer over en 100 ng /ml. Som en kontrol, testede vi aktiviteten af ​​LMB-2, et anti-CD25 RIT [31], der ikke binder KLM-1-celler, og observeret en ikke-specifik reduktion på 1 ug /ml LMB-2. Dette indikerer, at faldet ved 1 ug /ml RG7787 i KLM-1-R kunne tilskrives ikke-specifik optagelse (fig. 1A). Den etablerede modstand var stabil; blev ikke observeret nogen ændring, når KLM-1-R-celler blev i RIT-fri kultur i flere måneder (data ikke vist). Fordi ATP analyser ikke kan skelne mellem cellevækst anholdelse og celledød [32], vi evaluerede respons med Annexin V-PE Apoptose Detection kit. I modsætning til KLM-1 (

s

0,0001), viste KLM-1-R-celler ingen eller begrænset apoptose, når de behandles i 72 timer med 100 ng /ml (

s

= 0,33 ) eller 1 ug /ml RG7787 (

s

= 0,02), sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 1B). Disse data bekræfter, at KLM-1-R-celler er meget resistente over den celledræbningsaktivitet af anti-Mesothelin RITS

A:. KLM-1 og resistent KLM-1 (KLM-1-R) celler blev inkuberet i 72 timer med anti-mesothelin SS1-LR-GGS, RG7787 eller anti-CD25 LMB-2 som en kontrol. Vækstinhibering blev vurderet med en ATP celleviabilitetstest. Med IC

50s under 10 ng /ml, KLM-1 er sensitiv over for de anti-Mesothelin RITS, hvilket ikke er tilfældet for KLM-1-R (IC

50s 1 pg /ml). 1 ug /ml LMB-2 faldt cellelevedygtighed, hvilket indikerer, at denne RIT koncentration inducerer ikke-specifik optagelse. B: KLM-1 og KLM-1-R-celler blev inkuberet i 72 timer med 100 eller 1000 ng /ml RG7787. Apoptose blev vurderet med Annexin V-PE Apoptose Detection Kit I. RG7787 inducerer en betydelig stigning i apoptotiske KLM-1 celler, hvorimod KLM-1-R-celler viser ingen relevant stigning i apoptose. C: KLM-1 og KLM-1-R-celler blev inkuberet i 72 timer med HB21 (Fv) -PE40. Vækstinhibering blev vurderet med en ATP celleviabilitetstest. Begge cellelinjer er meget følsomme over for denne RIT.

Modstand i KLM-1-R-celler er specifik for anti-mesothelin RITS

For at vurdere, om modstanden i KLM-1- R gælder også for RITS målrettet mod andre receptorer på KLM-1-R-celler, testede vi HB21 (Fv) -PE40 der retter sig mod CD71 [33]. CD71 udtrykkes på overfladen på et tilsvarende højt niveau i KLM-1 og KLM-1-R (data ikke vist), og begge cellelinier havde en lignende følsomhed over for HB21 (Fv) -PE40 efter en 72 timers inkubation (fig. 1C). At evaluere følsomheden til andre terapeutiske midler blev celler også behandlet i 72 timer med paclitaxel, en mitotisk inhibitor og gemcitabin, en nukleosidanalog. Levedygtighed analyser viste ingen forskel i følsomhed over for paclitaxel mellem KLM-1 og KLM-1-R (IC

50 KLM-1 = 3,0 ± 1,6 ng /ml vs. IC

50 KLM-1-R = 3,7 ± 1,7 ng /ml) (

s

= 0,80). KLM-1-R (IC

50 = 44,2 ± 5,7 ng /ml) var 3 gange mindre følsom over for gemcitabin end KLM-1 (IC

50 = 15,2 ± 1,9 ng /ml) (

s

= 0,04), hvilket er langt mindre udtalt end modstanden mod RG7787. Disse resultater viser, at modstanden i KLM-1-R ikke generelt og derfor specifikke for anti-Mesothelin RITS.

Mesothelin udtryk og RG7787 optagelse er nedsat i KLM-1-R

første skridt i RIT virkningsmekanismen er bindende for målrettede celleoverfladeantigen efterfulgt af RIT internalisering. Mesothelin overflade udtryk, som vurderet ved flowcytometri, var 4,9 ± 0,5 gange lavere i KLM-1-R (12 x 10

3 steder pr celle) i forhold til KLM-1 (60 x 10

3 steder pr celle) (fig. 2A). Flowcytometri viste en homogen KLM-1-R cellepopulation, hvilket antyder en ensartet fald i mesothelin overfladeekspression. Analyse af Mesothelin-negative A431-celler og anvendelse af et isotype antistof kontrol bekræftede, at mesothelin signal i KLM-1-R-celler var specifik. Som forventet viste western blots, at KLM-1-celler indeholdt et større bånd af modent mesothelin ved 37-kDa og en svagere precursor bånd ved 72 kDa. De resistente celler havde små mængder af modne mesothelin, men precursoren blev ikke påvist, sandsynligvis på grund af dets lave overflod (fig. 2B). Overskydende udgydelse af mesothelin i KLM-1-R kunne redegøre for lavt mesothelin overflade niveauer. Brug af Meso Scale Assay, fandt vi, at kaste mesothelin var 4,8 ± 0,03 gange lavere i medierne af KLM-1-R (40,7 ± 5,3 pg /10

5 celler) sammenlignet med KLM-1 (149,0 ± 23,4 pg /10

5 celler). I medium uden celler (negativ kontrol), blev der ikke mesothelin detekteret. Disse data er i overensstemmelse med forskellen i overfladeniveauer og viser, at den lave mesothelin på KLM-1-R ikke skyldes øget udskillelse. For at bestemme om faldet mesothelin skyldtes mindre mRNA, udførte vi RT-PCR og fandt at mesothelin RNA var 7,3 ± 4,3 gange lavere i KLM-1-R (C

T = 24,1 ± 0,09) sammenlignet med KLM-1 (C

T = 21,54 ± 0,73). For at vurdere, om den resterende mesothelin på KLM-1-R overflade kunne binde og internalisere anti-Mesothelin RITS, vi vurderet den cellulære internalisering af RG7787-Alexa647. Optagelse i KLM-1-R steget over tid, men var betydeligt lavere end KLM-1 ved hvert tidspunkt (4- til 5-fold,

s

0,01). Efter 150 min inkubation, for eksempel KLM-1 internaliseret ca. 40 x 10

3 RG7787 molekyler, sammenlignet med kun 8 x 10

3 i KLM-1-R (fig. 2C). Disse data viser, at KLM-1-R-celler har en delvis nedregulering i mesothelin og derfor internalisere betydeligt mindre RG7787, som udgør en potentiel forklaring på den observerede resistens

A:. Surface Mesothelin niveauer er 5 gange lavere i resistent KLM-1 (KLM-1-R) sammenlignet med KLM-1. Mesothelin ekspression af KLM-1, KLM-1-R og Mesothelin-negative A431-celler (negativ kontrol) blev vurderet ved anvendelse af flowcytometri. Fyldte histogrammer er sekundære antistofkontroller. B: Hele mesothelin proteinniveau er faldet i KLM-1-R. Precursor (72 kDa) og spaltet modent mesothelin (37 kDa) var til stede i KLM-1. I KLM-1-R blev den spaltede del opdaget på et lavt niveau. Proteinniveauer blev probet i ubehandlet KLM-1 og KLM-1-R-cellelysat ved Western blot. p-actin fungerer som ladningskontrol. C: På hvert tidspunkt, cellulære optagelse af RG7787-Alexa647 i KLM-1 er væsentlig højere end i KLM-1-R, og væsentligt lavere end i KLM-1-R-

Msln

(transficeret med mesothelin ). Optagelse blev evalueret ved 30, 75 og 150 min. Gennemsnitlige GEOMEAN fluorescensintensiteter omregnet til mængde RG7787 molekyler.

AZA delvist genskaber mesothelin overflade udtryk i KLM-1-R med begrænset effekt på følsomhed over for RG7787

Mesothelin udtryk kan afbrydes ved DNA methylering af CpG sites i sin promotorregion [34-37]. AZA, en DNA methyltransferase inhibitor, kan vende sådan hypermethylering. Vi gav celler 500 nM AZA dagligt i 3 uger, og fandt, at mesothelin udtryk blev øget i KLM-1-R (KLM-1-R-AZA) med ca. 3 gange, op til 34 x 10

3 steder pr celle, der er stadig mindre end 60 x 10

3 steder pr celle i KLM-1 (fig. 3A). AZA forbedret følsomhed til RG7787 i KLM-1 og KLM-1-R, selv om sidstnævnte stadig meget modstandsdygtigt efter en 72 timers inkubation (IC

50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml) (fig. 3B). Disse data link mesothelin nedregulering til hypermethylering

A:. AZA fører til en 2,8 gange forøgelse af mesothelin overflade udtryk i resistent KLM-1 (KLM-1-R). Flowcytometri histogram af KLM-1, KLM-1-R, og KLM-1-R-AZA. Fyldte histogrammer repræsenterer sekundært antistof kontroller. B: Tre ugers inkubation med AZA, en DNA methyltransferase inhibitor, øger følsomheden til RG7787. KLM-1, KLM-1-R, og AZA-behandlede celler (KLM-1-AZA og KLM-1-R-AZA) blev behandlet i 72 timer med RG7787. Vækstinhibering blev vurderet med en ATP celleviabilitetstest. Stiplede linjer repræsenterer AZA-behandlede celler. C: CpG’er i en region opstrøms for mesothelin transkriptionsstartsitet er mere denatureret i KLM-1-R end i KLM-1. Tre ugers inkubation med AZA nedsætter methylering i KLM-1-R-celler. Det analyserede region er placeret på CHR16: 808.890-808.742 og spænder 147 bp og syv CpG’er. D: Mesothelin transfektion i KLM-1-R resulterer i signifikant overekspression af mesothelin sammenlignet med KLM-1 (5 gange) og KLM-1-R (23 gange). Flowcytometri overflade Mesothelin niveauer i KLM-1, KLM-1-R og Mesothelin-transficeret resistente celler (KLM-1-R-

Msln

). E: Mesothelin overekspression i KLM-1-R genskaber følsomhed over for RG7787. KLM-1 og KLM-1-R-

Msln

celler blev inkuberet i 72 timer med RG7787. Væksthæmning blev evalueret med en ATP celleviabilitetstest.

CpG’er i mesothelin promoter regionen hypermethyleret i KLM-1-R

For at bekræfte, at mesothelin genet er faktisk underlagt hypermethylering i KLM-1-R, vi udførte en eksplorativ analyse af status methylering af syv CpG’er i mesothelin promoter region (CHR16:. 808.890-808.742, S3 fig) ved hjælp bisulfit sekventering. Dette 147 bp websted regionen blev udvalgt på baggrund af primerne til rådighed på EpigenDx. Resultaterne viste, at disse CpG’er havde en signifikant højere methylering i KLM-1-R (59 ± 3,6%) sammenlignet med KLM-1 (41 ± 4,8%) (

s

0,05) (. Fig 3C) . Behandling med AZA bragte methylering niveauer i KLM-1-R tilbage til dem af KLM-1 (p 0,05). Disse data understøtter endvidere, at mesothelin nedregulering i KLM-1-R er associeret med hypermethylering af mesothelin genet.

Overekspression af mesothelin i KLM-1-R genskaber følsomhed over for RG7787

Hvis du vil gendanne mesothelin udtryk i KLM-1-R indførte vi fuld længde mesothelin cDNA (KLM-1-R-

Msln

). Surface mesothelin udtryk for KLM-1-R-

Msln

var 22,6 ± 5,3 gange højere end for KLM-1-R, og oversteg det oprindelige udtryk i KLM-1 med 5,3 ± 1,3 gange, hvilket resulterer i omkring 300 x 10

3 steder pr celle (fig. 3D). Som en konsekvens, overtagelse af RG7787-Alexa647 i KLM-1-R-

Msln dele på hvert tidspunkt var betydeligt højere end i KLM-1 (5 til 10 gange,

p

0,05) og KLM-1-R (24- til 46-fold,

s

. 0,001) (figur 2C). Efter en 72 timers inkubation, RG7787 havde en lignende IC

50 i KLM-1-R-

Msln

(4.49 ± 1,11 ng /ml) som i KLM-1 (4,41 ± 0,38 ng /ml) (

s

= 0,80). Men KLM-1-R-

Msln

var, mere følsomme end KLM-1 ved højere koncentrationer RG7787, med cellelevedygtighed faldende til nul ved 100 ng /ml (fig. 3e). Indførelse af kontrol pcDNA3.1 (+) havde ingen effekt på Mesothelin niveauer eller resistens over for RG7787 (data ikke vist). Disse data bekræfter, at modstanden i KLM-1-R er bundet til et fald i mesothelin. For at opnå et tilsvarende niveau for følsomhed over for RG7787 ses i KLM-1, KLM-1-R kræver betydeligt højere Mesothelin niveauer end KLM-1. Dette fund antyder, at modstanden også kunne være bundet til ineffektiv handel med RG7787 til cytosolen, eller at proteinsyntesen hæmning påvirkes i KLM-1-R.

Proteinsyntese hæmning af RG7787 er begrænset i KLM-1- R, EF-2 ADP ribosylering er intakte

Proteinsyntese hæmning påbegyndes efter toksin trafikker fra celleoverfladen til cytosolen og inaktiverer EF-2 ADP-ribosylering. KLM-1-celler blev inkuberet med RG7787 i 16 timer, og KLM-1-R-celler i 16 og 48 timer, hvorefter proteinsyntese blev undersøgt ved at måle [

3H] leucin inkorporering (fig. 4A). Efter 16 timer, RG7787 inducerede en dosisafhængig reduktion i proteinsyntese i KLM-1, men ikke i KLM-1-R.