PLoS ONE: Forstærkning af 20Q Kromosomal Arm opstår tidligt i Tumorgenetisk Transformation og kan påbegynde Cancer

Abstrakt

Gentagelser af kromosomal arm 20q forekommer i prostata, livmoderhalskræft, kolon, gastrisk, blære, melanom, bugspytkirtel og bryst kræft, tyder på, at 20Q forstærkning kan spille en kausal rolle i tumorigenese. Ifølge en alternativ visning, kromosomal ubalance er hovedsagelig en almindelig bivirkning af cancer progression. For at teste om en specifik genomisk aberration kan tjene som en kræft initierende begivenhed, vi etableret et in vitro system, som modeller den evolutionære proces af tidlige stadier af prostata tumor dannelse; normale prostataceller blev udødeliggjort af over-ekspression af human telomerase katalytisk subunit hTERT, og dyrket i 650 dage til adskillige transformation kendetegnende blev observeret. Genekspressionsmønstre blev målt og kromosomafvigelser blev overvåget ved spektral karyotype-analyse på forskellige tidspunkter. Flere kromosomafvigelser, især dobbeltarbejde kromosomal arm 20q, forekom tidligt i processen, og blev fikseret i cellepopulationer, mens andre aberrationer uddøde kort efter deres udseende. En bred vifte af bioinformatiske værktøjer, anvendt på vores data og data fra flere kræft-databaser, afslørede, at spontan 20Q forstærkning kan fremme kræft indvielse. Vores beregningsmæssige model antyder, at 20Q forstærkning induceret deregulering af flere specifikke kræftrelaterede veje herunder MAPK pathway, p53 pathway og Polycomb gruppe faktorer. Desuden blev aktivering af Myc, AML, B-Catenin og ETS familie transkriptionsfaktorer identificeret som et vigtigt skridt i udviklingen af ​​kræft drevet af 20Q forstærkning. Endelig identificerede vi 13 “cancer initierende gener”, beliggende på 20q13, som var betydeligt over-udtryk på mange tumorer, med ekspressionsniveauerne korreleret med tumor kvalitet og resultater tyder på, at disse gener inducere maligne proces på 20Q forstærkning.

Henvisning: Tabach Y, Kogan-Sakin I, Buganim Y, Solomon H, Goldfinger N, Hovland R, et al. (2011) Forstærkning af 20Q Kromosomal Arm opstår tidligt i Tumorgenetisk Transformation og maj Indled kræft. PLoS ONE 6 (1): e14632. doi: 10,1371 /journal.pone.0014632

Redaktør: Vladimir Brusic, Dana-Farber Cancer Institute, USA

Modtaget: Juli 9, 2010; Accepteret: December 3, 2010; Udgivet: 31 Jan 2011

Copyright: © 2011 Tabach et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Leir Charitable Foundation og af EF FP6 finansiering. Delvis finansiering blev leveret af Center for kvinders sundhed Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nedsat genom stabilitet er et af kendetegnene for kræft [1]. Lokal DNA kopiantal aberrationer har vist sig at være prædiktiv for udfaldet [2], [3], [4] eller af behandlingsrespons [5], [6], [7] i flere kræftformer. Selv om de fleste cancerceller udviser gevinst eller tab af kromosomale regioner [8], der stadig er en debat mellem forskere, om genomiske afvigelser er afgørende for kræft initiering [9], [10] eller et resultat af tumorigen proces [11], [12 ], [13]. Mens nogle rapporter tyder på, at gevinst på et ekstra kromosom udøver anti-proliferative virkninger [14], [15], andre hævder, at aneuploidi afvigelser forekomme på en præmaligne fase [10], [16], [17], [18] hvilket resulterer i kromosomale variationer og neoplastisk fænotype [9].

Flere kromosomale dobbeltarbejde er blevet hyppigt observeret i mange typer af kræft. Blandt disse, tilbagevendende gevinst og forstærkning af den lange arm af kromosom 20 (20q) er blevet observeret i 90% af pancreas cellelinier [19], 15-83% af pancreas adenocarcinom [20], omkring 70% af de primære gastrisk kræft [21] og for tyktarmskræft [18], [22], 50% af æggestokkene og livmoderhalskræft og 90% af bryst [23] cancere. Gevinst af 20Q kromosomale arm viste sig også at være en meget hyppig begivenhed på tidlige stadier af prostata carcinogenese [24], [25]. Desuden blev gevinst af 20Q kromosomale region bemærket transient i tidlige passage lagre af humane mammae fibroblaster, udødeliggjort med hTERT og SV40 stort-tumor oncoprotein [26]. Mærkbart, i næsten alle disse studier 20q er den hyppigste forstærkning, og sletning af denne arm er meget sjælden. Desuden viser flere undersøgelser, at forstærkning af 20Q er korreleret med dårlig prognose [27], aggressiv tumor fænotype, progression [28] og metastase dannelse [19], [29], [30].

Vurdering af, om kromosomal ubalancer spiller en forårsagende rolle i tumorigenese, i modsætning til at være omkringstående er en vanskelig opgave. Undersøgelser udført på kliniske prøver, både kromosomale afvigelser og genekspression, hindres af en række forstyrrende faktorer, som stammer fra forskellige genetiske baggrunde af patienter, variabel og ukarakteriserede mutationer i tumorer, og de ukontrollerede forureninger ved inflammatorisk, endotel, og stromale celler. For at overvinde disse forhindringer, vi tidligere etableret en in vitro transformation model baseret på de menneskelige lungefibroblaster, WI-38, som gav anledning til identifikation af genekspression signaturer [31], [32], [33] i forbindelse med genetiske afvigelser [ ,,,0],34]. Derudover er humane faste tumorer normalt fra resektioner udføres på et tidspunkt, hvor tumoren er allerede fuldt udviklet, hvilket udelukker adgang til vigtige oplysninger om tumor initiering og progression.

For at opnå ny viden om den tidlige stadier af forvandling og de genetiske netværk forbundet med kromosomafvigelser, vi brugte en in vitro model af prostata cellulær transformation. I denne model primære prostata epitelceller, som tidligere blev udødeliggjort ved at indføre den katalytiske subunit af telomerase, blev hTERT (EP156T) [35] dyrkes i kultur under kontrollerede forhold. Det specifikke formål med denne undersøgelse var at undersøge den hypotese, at et bestemt genomisk aberration forekommer ved tidlige fase af carcinogenese ledsages af ændringer i genekspression, der kunne tjene som en drivkraft for tumorigenese. Efter 650 dage i kultur de EP156T afledte celler delt flere fænotypiske, kromosomal og transkriptionelle attributter med prøver prostatakræft. Vi rapporterer her om to vigtigste resultater. Den første er den fremtrædende og tidlig rolle 20Q amplifikation i udviklingen af ​​vores in vitro-cellekultur i retning af en præ-malign fænotype, med en forbedret proliferationshastighed. For det andet, vi forklare den maligne potentiale 20Q dobbeltarbejde ved at identificere 13 “cancer initierende gener”, beliggende på 20q13, der er over-udtrykt i flere former for kræft, og hvis udtryk er korreleret med tumor kvalitet og resultat.

Materialer og metoder

Udarbejdelse af cellelinjer

Normale humane prostata celler udødeliggjort af telomerase introduktion [35] blev dyrket i kultur i 650 dage, hvor de blev analyseret for cellevækst sats, kromosomal ændringer og ekspression profilering. hTERT elongates kromosomalt ender forhindrer replikativ senescens af flere slags normale humane celler [36]. hTERT immortaliserede EP156T celler blev betegnet her som N line (figur 1). The C, G og M linier blev afledt af N linje (figur 1) efter 25 passager (svarende til ca. 150 dage). til dette formål blev en mutant af tumor suppressor p53 (p53R175H) klonet i en retroviral vektor pLXSN indført i N linje. de nye celler, der stabilt udtrykker den p53R175H mutant, blev betegnet M-linjen. I parallelle N-celler blev også inficeret med pLXSN vektoren indeholdende GSE56 sekvens, der koder for et kort peptid, der inaktiverer p53 tumor-suppressor gen i en dominant negativ måde [37], der gav anledning til G linje. Den tomme pLXSN plasmid blev anvendt som kontrol genererer C serien. Onkogent H-RASV12 klonet i pBabe-Hygro retroviral plasmid blev anvendt til infektion af C, G og M linjer lige før passage 80 genererer C8R, den G8R og M8R celler. Ekstra linier blev skabt ved infektion af sene passage N-celler med pLXSN plasmid, der koder enten p53R175H mutant (N8M), den GSE56 (N8G) eller med det tomme plasmid (N8C) (figur 1). Infektionen blev fulgt ved at opretholde cellerne i to uger i nærvær af 400 ug /ml neomycin (for celler inficeret med pLXSN vektor) eller med 50 ug /ml Hygromycin (for celler inficeret med pBabe-Hygro-vektor) for at selektere for stabil ekspression af de indførte plasmider. Proceduren for retroviral infektion er beskrevet i [32]. Vækstbetingelser og medier komponenter er beskrevet i [35].

Skematisk fremstilling af de vigtigste afledte kulturer af EP156T prostata epitelceller. Hver linje står for subkultur genereret in vitro ved indføring af specifikke genetiske modifikationer. X-aksen repræsenterer antallet af passager i kultur (ca. en uge per passage). De chip symboler repræsenterer punkter, hvor cellerne blev opsamlet og deres RNA hybridiseret til microarrays; koden for den resulterende prøve, fx G5, betegner linien (G) og det omtrentlige antal (50) af passager i kultur divideret med ti. Den kromosom symbol angiver en SKY måling.

Genekspression profilering langs evolution processen med EP156T afledte kulturer

For genekspression profilering, blev der udtaget prøver på 32 punkter langs dyrkning proces og hybridiseret med GeneChip human Genome U133A 2.0 Array (figur 1). Mikroarrayene blev forbehandlet ved anvendelse RMA [38] og normaliseret. Alle data er MIAME kompatibel; de rå data er blevet deponeret i en GEO database. Det GEO rekordstore antal er-GSE23038. De 5000 mest varierende gener blev sorteret af SPIN algoritme [39] og grupperet hjælp SPC [40] til at identificere 2 vigtigste stabile klynger af gener med en korreleret mønster af udtryk.

Spectral Karyotype Analysis (SKY)

Eksponentielt voksende celler blev inkuberet med Colcemid (0,1 ug /ml) natten over, trypsiniseret, lyseret med hypotonisk buffer og fikseret i iseddike /methanol (01:03). Kromosomerne blev samtidigt hybridiseret med 24 kombinatorisk mærkede kromosom maleri sonder og analyseret ved hjælp af SD200 spektrale bioimaging systemet (Applied Spectral Imaging Ltd., Migdal Haemek, Israel).

S-fase analyse

Subkonfluente kulturer blev mærket i en time med 10 pM BrdUrd (Sigma). Celler blev løsnet med trypsin, fikseret i 70% ethanol, og behandlet som følger (PBS vaske mellem hvert trin): 2 M HCI og 0,5% Triton X-100 i 30 minutter ved stuetemperatur; 0,1 M Na

2Br

4O

7 ved pH 8,5; FITC-konjugeret anti-BrdUrd (Becton Dickinson) fortyndet 1:03 i PBS /1% BSA /0,5% Tween 20 i 1 time ved stuetemperatur; og endelig, 5 pg /ml propidiumiodid og 0,1 mg /ml RNase A. Prøverne blev analyseret ved todimensionel flowcytometri til at detektere både fluorescein og propidiumiodid fluorescens under anvendelse af en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS) (Becton Dickinson). Mindst 10.000 celler blev analyseret per prøve.

Isolering af Total RNA

Total RNA for microarray eksperiment og for Kvantitativ Real Time PCR (QRT-PCR) blev isoleret ved hjælp NucleoSpin RNA-ekstrakt kit (Macherey -Nagel) ifølge producentens protokol.

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

En 2 ug portion af det totale RNA blev revers transkriberet under anvendelse af MMLV RT (Promega) og tilfældig hexamere primere. QRT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR-Green PCR Master Mix reagent (Applied Biosystems) på en ABI 7300 instrument (Applied Biosystems). Ekspressionsniveauet for hvert gen blev normaliseret til den for GAPDH housekeeping-genet i den samme prøve. Primerne blev designet ved hjælp af Primer Express software. Primer sekvenser er tilgængelige efter anmodning.

Den Expression Karyotype

Expression data blev tidligere anvendt til at udlede kromosomafvigelser [41], [42]. Vores arbejde hypotese er, at ændringer i kopiantallet af DNA’et af en fuld kromosom eller en del af det afspejles i genekspression. Sletning af et kromosom forårsager, i gennemsnit, nedregulering i udtrykket af generne af denne kromosom, mens dobbeltarbejde bør afspejles ved en højere udtryk niveau. For at identificere kromosomale ubalancer, vi sammenlignet ekspressionsniveauer for de gener, der er placeret på hver kromosomal arm i hver prøve, til en reference prøve af normale celler (n0), og søgt efter betydelige forskelle i ekspressionsniveauerne. Vi introducerede her en metode til Kromosomal Ubalance Analysis, baseret på en parret t-test, for at udlede kromosomal kopi nummer information fra udtryk data. Den Kromosomal Ubalance Analyse metode er beskrevet, afprøvet og sammenlignet med en tidligere afledt teknik [42] i den supplerende tekst S1, se figur S1 og S2.

Sammenligning af de to beregningsmetoder med SKY

To fremgangsmåder er blevet anvendt til at identificere “ekspression karyotype” i prøver. Brug af Kromosomal Ubalance Analysis vi beregnet, for hver prøve

s

, en P-værdi for hvert kromosom at teste, om den gennemsnitlige forskel mellem de gener i N0, sammenlignet med prøve

s

, er forskellig fra nul. Den binomial tilgang [42] bestemmer, om en væsentlig del af generne på kromosomet er overudtrykt i

s

versus N0 (eller under-udtrykt). For nærmere oplysninger om forskellene mellem de to tilgange se supplerende tekst S1.

De opnåede ved SKY resultater, som blev brugt til at estimere forudsigelseskraft af de to beregningsmetoder, blev analyseret som følger. Hvis der blev observeret en kromosomafvigelser i mere end 50% af de karyotyped celler, blev det anset som en sand aberration; ellers blev fortolket som støj og fjernet fra analysen. Med denne definition af himlen resultater som “jord sandheden”, vi sammenlignet udførelsen af ​​de to beregningsmetoder, ved hjælp af receiver transporterende egenskaber (ROC) analyse (se figur S2). Opførelser af de to metoder var ens, og vi vedtog Kromosomal Ubalance Analysis her.

Kromosomal Ubalance Analyse korrelation

Betegne som

E

gs

ekspressionsniveauet (efter log og tærskling) af probeset

g

i prøve

s

. For hver probeset gi prøve

s

beregner vi Δ

E

gs

=

E

gs

–

E

g,

n0. Beregn for hver prøve

s

medianen af ​​Δ

E

gs

for markant ændrede probeset fra 20Q (som defineret i den supplerende tekst S1 på Kromosomal Ubalance Analysis), for at få

M

s

. For hver probeset

g

fra 20Q vi beregne Pearson korrelation mellem de to sæt tal:

E

gs

og

M

s

, og opkald dette som Kromosomal Ubalance Analyse korrelation af probeset

g

(med udtrykket karyotype af 20Q).

Konstruere karyotype evolutionære træ

Vi konstruerede en “karyotype evolutionær træ” kombinere data fra himlen resultater og udtrykket karyotype. De normale karyotype “arter” (46, XY) var roden /forfader af alle udviklede karyotyper. Træet blev bygget manuelt ved hjælp af data fra både udtrykket karyotype og SKY. Hvis dataene fra udtryk karyotype ikke var i overensstemmelse med de SKY data ved et bestemt punkt, vi interpoleret adfærd to tilstødende punkter, forudsat at vi havde at gøre med en kontinuerlig proces.

Kopier nummer analyse

Ultra-høj opløsning Affymetrix genom-dækkende menneskelige SNP arrays 6,0 blev brugt til at undersøge erhvervet genomisk kopi nummer ændringer og tab af heterozygositet af EP156T celler. Genomisk DNA blev oprenset ved anvendelse af Tissue DNAkit (Cat. # D3396-02, EZNA, OMEGA Biotek). DNA prehandling og array hybridisering blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner (P /N 702.504, rev3, Affymetrix, Santa Clara, Californien), og scannet i en Affymetrix GeneChip Scanner 3000. Kvalitetskontrol, genotype calling, sonde niveau normalisering og kopiere nummer normalisering at producere log

2 nøgletal blev foretaget i Affymetrix GeneChip® Genotypning Console v3.0.1. Et in-house henvisning fil genereret fra 59 raske bloddonorer blev anvendt. Dataanalyse og visualisering blev udført i kromosom analyse suite med en tærskel på minimum 100 kb og 20 markører. Afvigelser rapporteres i henhold til ICSN nomenklatur og NCBI bygge 36.

Netværk og grafiske fremstillinger

Data blev analyseret ved brug af Opfindsomhed Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Netværket er en grafisk repræsentation af de molekylære forhold mellem gener /genprodukter. Gener eller genprodukter er repræsenteret som knudepunkter, og det biologiske forhold mellem to knudepunkter er repræsenteret som en kant (linje). Alle kanter er støttes af mindst én reference fra litteraturen, fra en lærebog eller fra kanonisk information lagret i opfindsomhed Pathways Knowledge Base. Menneske, mus, rotte og orthologer af et gen lagres som separate objekter i Ingenuity Pathways Knowledge Base, men er repræsenteret som en enkelt knudepunkt i netværket. Nodes vises ved hjælp af forskellige former, der repræsenterer den funktionelle gruppe af genet produkt.

Resultater

En in vitro model for tidlig prostata carcinogenese

For at følge den oprindelige progression etaper mod malignitet i prostata carcinogenese, har vi etableret et system baseret på hTERT-udødeliggjort benign prostata epitelial (EP156T) celler [35]. Disse immortaliserede celler betegnes her som N linje. Ved passage 25, blev N-celler manipuleret til over-express reagenser, som inaktiverer tumor-suppressor p53. Med henblik herpå blev p53R175H mutant af tumor suppressor p53 klonet i en retroviral vektor pLXSN indført i N linje parallelt med GSE56, en p53-inaktiverende peptid, klonet i pLXSN vektor og med en tom pLXSN plasmid som kontrol . De fire immortaliserede cellelinjer, herunder Normal (N), transduceret med GSE56 (G), med mutant- p53R175H (M) og med en tom vektor til kontrol (C) blev dyrket i yderligere 500 dage in vitro. Figur 1 viser skematisk denne model. I hele dette manuskript, prøver betegnet med LX, hvor L = N, G, M eller C, og tallet X angiver antallet af passager (± 3), ved hvilken den specifikke prøve blev taget, divideret med ti (f.eks G4 repræsenterer prøve udtaget fra GSE linje på passage ~ 40). Lige før passage 80, oncogen Ras (H-RASV12) blev indført i C, M og G hvilket giver C8R, M8R og G8R linjer, henholdsvis som vist i figur 1. Til dette formål H-RASV12 onkogen klonet ind pBabe- Hygro retroviral vektor blev anvendt. Derudover blev de retrovirale reagenser beskrevet ovenfor anvendes til over-udtrykke GSE56 og mutant p53R175H i cellerne af den N linje på et sent passage, genererer N8G, N8M og N8C linier (figur 1). En retroviral infektion blev efterfulgt af to ugers selektion lægemiddel til at inducere stabil ekspression (se Materialer og fremgangsmåder). For at få et samlet billede af de evolutionære ændringer i løbet af langvarig dyrkning af cellekulturer, vi ønskede at kombinere analyser af celle vækst, kromosomale ændringer og udtryk profilering langs 650 dage i kultur af N, C, G og M linjer. For at nå dette mål, blev celler udtaget langs denne periode, og analyserne af celleproliferation, genekspression og karyotype blev udført (figur 1).

Ved etableringen af ​​vores in vitro-transformation model, var det vigtigt at evaluere hvorvidt dette system kan repræsentere in vivo human cancer på en pålidelig måde. Til det formål har vi undersøgt, om langs de 650 dages dyrkning, skal EP156T celler erhvervet molekylære og fænotypiske egenskaber er typiske for faktiske tumorer. Som cellulær proliferation er den grundlæggende træk ved kræft transformation, cellevæksthastigheden og procentdelen af ​​prolifererende celler (i. E., Cellerne på S-fasen af ​​cellens cyklus), blev vurderet. Faktisk en stigning i celle vækst var tydelig dyrkning celler skred (figur 2A). Efter aftale med dette, blev en højere andel af prolifererende celler påvises på senere passager, som bedømt af BrdU mærkning og FACS-analyse (figur 2B). Derudover ekspressionen af ​​p16INK4a tumorsuppressorgen faldt med tiden i kultur i alle fire cellelinjer (figur 2C). Reducerede niveauer af p16INK4a er almindeligt observeret i avanceret prostata tumorer [43], og viste sig at være en af ​​de centrale begivenheder i en in vitro transformationsproces af humane WI-38 fibroblaster [31], [32], [33]. Så vi har ønsket at undersøge, om genekspression mønster af EP156T-afledte kulturer ligner in vivo tumorer. For at nå dette mål, blev gennemført den følgende analyse. Ved genekspression profilering af de EP156T celler blev en klyngedannelse analyse udført for at identificere de gener med korreleret ekspressionsmønster. De ekspressionsmønstre for de to mest fremtrædende klynger er præsenteret i figur 2D og 2E. Den første klynge (figur 2D) indeholdt 177 transkripter, der var op reguleret over tid i kulturen. Ved behandlingen af ​​Gene Ontology (GO) berigelse ved hjælp af David software [44], fandt vi, at disse gener var forbundet med celleproliferation. Således er denne klynge betegnet “proliferation klynge” langs manuskriptet. Denne tendens udtryk blev valideret af QRT-PCR på tre repræsentative gener (Figur S3). Den anden klynge (figur 2E) indeholdt 296 glycoprotein og celleadhæsionsmolekyle udskrifter og deres udtryk negativt korreleret med spredning klynge. At vurdere, om disse ændringer i genekspression kan relateres til transformering af EP156T celler undersøgte vi ekspressionen af ​​generne af begge klynger i et datasæt af 99 prøver, opnået fra normal prostata, tumor og metastase af prostatacancerpatienter [45 ]. Påfaldende, ekspressionen af ​​gener fra begge klynger signifikant korreleret med deres ekspression i dette sæt af kliniske cancer progression prøver (Figur 2D og 2E, nederst). Det fund, at genekspressionen mønster af vores in vitro-model ligner den for fremskreden prostatacancer, antyder, at denne model rekapitulerer de molekylære begivenheder, som forekommer under in vivo malign transformation i prostata. Den detaljerede analyse af disse klynger og sammenligningen til in vivo-data leveres i tekst S1. Tilsammen disse observationer tyder på, at i løbet af forlænget in vitro dyrkning af EP156T prostata immortaliserede celler, en udvælgelsesproces fandt sted begunstige overlevelsen af ​​celler med højere proliferative kapacitet, som kan føre til en transformeret fænotype.

A. Antal populationsfordoblinger af EP156T-afledte kulturer (C, G og M) beregnet i 50 dages intervaller i løbet af 650 dage gammel kultur periode efter hTERT-infektion, sammen med antallet af populationsfordoblinger udføres med ikke-inficerede EP156 celler i den første 50 dage i kultur og EP156T (N) celler i løbet af de næste 100 dage i kultur. B. Procentdel af prolifererende celler (S-fase) blev målt ved BrdU mærkning af tidlig passage (C4) og sen passage (C8) celler. C. Real time QRT-PCR for p16INK4a udtryk i forskellige prøver af EP156T system. D. Top: Expression matrix af en klynge af gener, hvis udtryk steget under omstillingsprocessen. Inden for hver linje prøver bestilles fra tidligt til sent passager. Nedre panel: den gennemsnitlige ekspressionsmønster af disse gener i prøver fra prostatacancerpatienter [45]. P-værdi for forskellen i ekspression mellem normale og cancer er p = 0,00024 og fra normale og cancer til metastase er p = 0,00013. E. Top: Cluster af gener, der indeholder overrepræsenteret glycoprotein og ekstracellulære region gener, er prøverne for hver linje bestilt fra tidligt til sent passager. Klyngen nedreguleres under omstillingsprocessen. Den nederste figur viser den gennemsnitlige udtryk for klyngens gener i prøver kræft [45]. Den p-værdi for forskellen i udtryk mellem normal og kræft er p = 0,00013 og fra normal og kræft til metastaser er p = 0,00023.

Eksogen indførelse af telomerase inducerede immortaliseringen af ​​EP156T celler på grund af telomer forlængelse, som var tydelig efter opretholdelse af cellerne for lang periode in vitro [35]. Endvidere over-ekspression af mutant form af p53 tumor suppressor og af p53 inaktiverende peptid GSE56 blev også opretholdt i lang tid efter deres indføring i cellerne. En detaljeret analyse af de specifikke funktioner af mutant p53R175H overudtrykt i EP156T celler er præsenteret i [46]. Bevarelsen af ​​telomerase og ændrede former for p53 i EP156T celler over tid tyder på, at disse gener kan spille en rolle i opretholdelsen af ​​transformation.

20Q forstærkning opstod og domineret cellepopulationen på tidlige stadier af processen

kromosomafvigelser.

Vi vendte at undersøge de kromosomale kopi nummer variationer i vores celler, da disse har vist sig at være relateret til kræft fænotyper. Til dette formål har vi anslået kromosomafvigelser mønster på befolkningsniveau hjælp beregningsmæssige analyse af udtryk data (se Metoder), og på niveauet af enkelte celler ved hjælp af spektral karyotypebestemmelse (SKY). Vi brugte vores data til at følge den tidsmæssige udvikling af “udtrykket karyotype” – det vil sige kromosomafvigelser, som de blev afspejlet i genekspression mønster. Vores data udgør et tidstro serie, hvilket giver os betydelige fordele i at identificere progressionen af ​​de dominerende kromosomale afvigelser.

“udtryk karyotype” viste betydelig tidsmæssig variation af ekspressionsniveauerne af generne af flere kromosomale arme til de forskellige linjer (figur 3). Kromosomal arm 20Q viste de mest udtalte ændringer i ekspression og var forbundet med de væsentligste p-værdier i alle linjer. Sammenlignet med N0, ekspressionen af ​​20Q viste ca. 1,5 gange stigning i N-line og i de tidlige passager i M, G og C linjer. Interessant nok i de sene passager i M, G og C linjer denne fold ændring steg til ~1.8. Disse resultater tyder på, at celler med et trisomi af 20Q domineret cellepopulationen tidligt i processen, og i C, G og M linjer sekundære begivenheder følges og skabte mere end 3 eksemplarer af 20Q arm. Yderligere afvigelser, der blev observeret var amplifikationer af 9q og 13q i N linje; af 7 p, 7q, 18q og senere i processen, med 3p i C linje; forstærkning af 9 p, 11 p og mindre væsentligt, af 13q i G linje; i M linje identificerede vi, ud over amplificeringer af 13q og 20p, også deletioner af 10p og kromosom 16 (efter passage 60).

ekspressionsniveauet af hvert gen kommenteret til en bestemt kromosomal arm blev sammenlignet med dets ekspressionsniveau i den n0 prøve (EP156 primære celler ved passage 8), som repræsenterer den parentale kultur af alle fire linjer. For hvert af de N, C, G og M linjer (se tekst) det øverste panel viser de koordinerede ændringer i medianen af ​​ekspressionen af ​​gener kommenteret til specifikke kromosomale regioner, divideret med deres median ekspression i N0. Den nederste panel er det -log

10 (p-værdi) af den parrede t-test mellem generne i n0 og de øvrige prøver (x-aksen) på en bestemt kromosomal arm. Figuren præsenterer de statistisk signifikante kromosomale arme (p-værdi 0,001 og median fold Change 1,5 eller 0,5 mindste på et tidspunkt).

Vi udførte 24 SKY målinger på forskellige stadier af processen; i hvert undersøgte vi mellem 4-10 celler (resultaterne er opsummeret i tabel 1). SKY, efter aftale med udtrykket karyotype, identificeret dobbeltarbejde kromosomer 20, 3, 7, 9, 18 og sletning af 16 langs de forskellige linjer. Hertil kommer, translokationer, der involverer kromosomer 10, 11 og 20, der blev identificeret ved SKY, blev anerkendt som sletninger /gentagelser ved udtrykket karyotype (som vil blive diskuteret nedenfor).

På flere punkter Himlen resultater ikke optræder i overensstemmelse med vores forventninger (tabel 1). For at udføre SKY analyse blev celler optøet og re-dyrket på flere punkter stedet for at bruge præcis den samme befolkning, der blev taget for microarrays. grundlæggervirkning kan således være ansvarlig for uoverensstemmelser mellem forskellige SKY resultater (f.eks gentagelse af kromosom 7 i passagen 41 er uforenelig med passager 31 og 52) og mellem SKY og udtrykket karyotype observeret på nogle punkter (f.eks gentagelse af kromosom 18 i C linje eller sletninger af kromosomerne 13 og 5 i prøve N8).

den karyotype evolutionære træ.

for bedre at forstå evolutionære processer, der fandt sted i løbet af vores eksperiment, vi konstrueret en “karyotype evolutionær træ” (figur 4), der kombinerer data fra himlen resultater og udtryk. I lighed med andre evolutionære træer, den “karyotype evolutionære træ” giver os mulighed for at forstå bedre som karyotype “arter” dukke, udvikle sig eller uddø i løbet af processen. Den evolutionære træ påpeger træk (i vores tilfælde den specifikke indsættelse, sletning eller aberration), der giver den valgte karyotype vækst fordel frem for andre karyotyper. Hvis dataene fra udtrykket karyotype ikke var i overensstemmelse med data fra SKY analyse på et bestemt punkt, vi interpoleret adfærd to tilstødende punkter (se metoder). For eksempel, himlen resultater i C linje viste celler med kombinationer af yderligere amplifikationer og sletninger. Selvom flere mulige konstruktioner af C serien træet var muligt, beviser fra både ekspressionen karyotype og fra SKY foreslog, at de mest dominerende virkning i disse celler var overlapning af kromosom 7 (ved passage 40) efterfulgt af overlapning af kromosom 18, som senere blev efterfulgt af duplikering af kromosom 3. på den anden side udtrykket karyotype i prøver C6 og C7 viste uventet fald i median fold ændringer i alle de afvigende kromosomer (se figur 3). Vi mener, at SKY repræsenterer mere nøjagtigt det sande karyotype på disse tidspunkter.

Figuren blev genereret på grundlag af de 24 SKY resultater langs prostatakræft omstillingsprocessen og udtrykket karyotype. Normal prostata humane celler (venstre side af figuren) blev anvendt til at etablere fire foreviget forskellige linjer: GSE, Kontrol, Normal, og Mutant p53 (se tekst), der formere løbet 80 passager (x-akse).