PLoS ONE: SILAC-Based massespektrometri Analyse viser, at Epibrassinolide fremkalder apoptose via Aktivering endoplasmatisk reticulum Stress i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Epibrassinolide (EBR) er en polyhydroxyleret sterol derivat og biologisk aktiv forbindelse af brassinosteroider. Foruden velbeskrevne roller i plantevækst, EBR inducerer apoptose i LNCaP prostatacancerceller, der udtrykker funktionelle androgen receptor (AR). Det foreslås derfor, at EBR kan have en hæmmende potentiale på androgen receptor signalvej. Imidlertid er den mekanisme, hvormed EBR udøver sine virkninger på LNCaP dårligt forstået. For at løse dette hul i viden, brugte vi en fordomsfri globale proteomics tilgang, dvs. stabil-isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC). I alt blev 964 unikke proteiner identificeret, 160, som blev differentielt udtrykt efter 12 timer af EBR behandling. Kvantificeringen af ​​de differentielt udtrykte proteiner viste, at ekspressionen af ​​det udfoldede protein respons (UPR) chaperone-protein, calreticulin (CALR) blev dramatisk nedreguleret. Faldet i CALR ekspression blev også bekræftet af immunblotting. Fordi vores data viste inddragelse af UPR som reaktion på EBR eksponering, vurderet vi udtryk for de andre UPR proteiner. Vi viste, at EBR behandling nedregulerede calnexin og opreguleres BIP og IRE1α ekspressionsniveauer og induceret CHOP translokation fra cytoplasmaet til kernen. Translokation af CHOP var associeret med caspase-9 og caspase-3-aktivering efter en 12 timers EBR behandling. Samtidig behandling af EBR med rapamycin, en opstrøms mTOR inhibitor, forhindrede EBR-induceret levedygtighed celletab og PARP-spaltning i LNCaP prostatacancerceller, hvilket antyder, at EBR kunne inducere ER stress i disse celler. Desuden har vi observeret lignende resultater i DU145 celler med ikke-funktionelt androgen receptor. Når proteasomalaktivitet nedbrydning af proteiner blev blokeret af MG132 co-behandling, EBR behandling yderligere induceret PARP spaltning i forhold til medicinsk behandling alene. EBR også induceret Ca

2+ beslaglæggelse, som bekræftede ændringen af ​​ER vej på grund af medicinsk behandling. Derfor foreslår vi, at EBR fremmer ER stress og inducerer apoptose

Henvisning:. Obakan P, Barrero C, Coker-Gurkan A, Arisan ED, Merali S, Palavan-Unsal N (2015) SILAC-Based-massespektrometri analysen afslører, at Epibrassinolide fremkalder apoptose via Aktivering endoplasmatisk reticulum Stress i prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (9): e0135788. doi: 10,1371 /journal.pone.0135788

Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, UNITED STATES

Modtaget: 4. august, 2014 Accepteret: 27 Juli 2015; Udgivet: 9 September, 2015

Copyright: © 2015 Obakan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:.. Denne undersøgelse blev støttet af Istanbul Kultur University videnskabelige projekter Support center og Temple University Fels Institut for Cancer og Molekylær Biologi Institut ved at bruge deres egne ressourcer

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

brassinosteroider (bRS) er steroid-afledte molekyler med mange fysiologiske virkninger, herunder reguleringen af ​​hormonelle balance, aktiveringen af ​​protein og nukleinsyresyntese, enzymatisk aktivitet, cellecyklussen og cellevækst [1, 2]. Udover de velbeskrevne effekter i planter, er deres rolle i pattedyrsceller dårligt forstået og undersøges i øjeblikket som anticancermidler [3-5]. Den seneste forståelse er, at EBR, et medlem i grundforordningerne, inducerer apoptose mere effektivt i nuklear hormon receptor (NHR) udtrykkende cancer cellelinjer, såsom LNCaP prostata [med androgen receptor (AR)] [4] eller MCF-7 bryst cancer cellelinjer [med østrogen receptor (ER)] [3]. Den strukturelle lighed EBR med pattedyr steroider [6] er blevet foreslået som mulig årsag til den hormonale specificitet. Imidlertid har den molekylære basis for EBR specificitet ikke blevet belyst. Vores tidligere erfaring viste, at selv om EBR (25 uM) var en stærk apoptotisk inducer i LNCaP (AR +) prostatacancerceller, det var også overraskende effektivt inducerer apoptose i DU 145 (AR-) celler. Vigtigt er det, blev EBR behandling ikke cytotoksisk for PNT1a normale prostata epitelceller [4]. For bedre at tydeliggøre terapeutiske potentiale af EBR, undersøgte vi hele proteomanalyse af LNCaP celler med eller uden EBR behandling.

Anvendelse af kvantitative proteom tilgange vil sandsynligvis give oplysninger om de vigtigste molekylære signaturer og detaljeret forståelse af de involverede mål [7]. SILAC (stabile isotoper Mærkning af aminosyrer i Cell Culture) analyse er et massespektroskopi (MS) -Kombineret proteomisk tilgang uden radioaktiv mærkning. SILAC afhængig af inkorporering af en given “let” (

12C mærket L-lysin eller L-arginin) eller “tunge” (

13C mærket L-lysin eller L-arginin) form af aminosyren ind i proteiner. Efter en række celledelinger, er hvert enkelt aminosyre erstattet af sin isotop analog og inkorporeret i nyligt syntetiserede proteiner [8]. I denne undersøgelse, brugte vi SILAC tilgang til at udforske nye apoptotiske potentiale EBR i androgen lydhør LNCaP prostatacancerceller.

Vi observerede, at EBR væsentligt påvirket udtrykket profil 160 proteiner, der involverer i forskellige cellulære funktioner (celle cytoskelet, nukleinsyre og energimetabolisme, celledød og protein ubiquitinering) sammenlignet med ubehandlede kontrolprøver. Endoplasmatiske reticulum (ER) resident calreticulin (CALR), en chaperone protein, var signifikant nedreguleret blandt de 160 proteiner. Vi fastslå, at niveauerne af ER stressproteiner blev ændret efter EBR behandling i LNCaP AR (+), og den samme profil blev også observeret i den ikke-funktionelle AR-udtrykkende DU145 prostatacancer-cellelinie. Ændringer i ER stress biomarkører udløste apoptose i hver cellelinje; i LNCaP-celler, blev apoptose induceret af CHOP transaktivering og translokation til kernen. Tilsætningen af ​​rapamycin, som translationsrepressor af mTOR (mammalian target of rapamycin), eller MG132, en proteasominhibitor, der reducerer nedbrydningen af ​​ubiquitin-konjugeret proteiner, ændret EBR-induceret apoptose, hvilket tyder på, at ER stress blev aktiveret efter EBR behandling i LNCaP-celler. For at bevise sammenhængen mellem ER medieret celledød mekanisme efter EBR behandling blev CALR plasmidtransfektion udført. EBR-induceret cellelevedygtighed tab blev forhindret i CALR + LNCaP celler. Hertil kommer, når CALR + LNCaP celler blev behandlet med EBR, vi ikke observere ER stress medieret apoptotisk induktion, hvilket tyder på, at CALR er et vigtigt mål for EBR.

Materialer og metoder

Kemi og antistoffer

Heavy lysin og arginin [(13C6, 15N2) -L-lysin og (13C6) -L-arginin] blev opnået fra Cambridge Isotope (Andover, MA); lys aminosyrer (L-lysin og L-arginin) blev opnået fra Sigma (St, Louis, MO). Proteaseinhibitoren cocktail blev opnået fra Sigma (St, Louis, MO). Antistofferne mod ER stress (BIP, CALNX, CALR, CHOP, IRE1α, Perk, ATF4, ATF6 og PDI) og apoptose (caspase-12, caspase-3, caspase-9 og PARP) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Tunicamycin blev indkøbt fra Sigma (St, Louis, MO) og opløst i DMSO (10 mg /ml). Den pmCherry-mærkede CHOP plasmid blev købt fra Addgene (CHOP-promotor (-649 /+ 136) pmCherry-1, 36035). Calcium grønt farvestof til bestemmelse af intracellulære Ca

2 + niveauer blev indkøbt fra Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Rapamycin og MG132 blev købt fra Tocris (Ellisville, MI, USA) og Sigma (St Louis, MO), hhv.

Cell kultur

LNCaP (CRL-1740) og DU 145 ( HTB-81) human prostatacancer-cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). HEK-293 (CRL-1573) celler blev anvendt til vildtype CALR mRNA isolation og opnået fra ATCC. Celler blev dyrket i DMEM-medium (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), suppleret med 10% kalvefosterserum (PAN Biotech, Aidenbach, Tyskland) og 10000 U penicillin /ml og 10 mg streptomycin /ml (PAN Biotech, Aidenbach , Tyskland). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 inkubator (HERAcell 150; Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA).

Cellekultur i SILAC medier

SILAC DMEM (Pierce Biotechnology) blev suppleret med 10% dialyseret føtalt bovint serum (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 1% streptomycin /penicillin. Den tunge medium blev suppleret med

13C

6 L-arginin og

13C

6,

15N

2-L-lysin. Lyset medium blev suppleret med normal L-arginin og L-lysin. For SILAC eksperimenter blev LNCaP-celler dyrket i parallel i enten let eller tung medier i 5 dage, med udskiftning medier hver 24 timer.

1-D SDS-PAGE separation og i-gel trypsinfordøjelse

totalt celleprotein blev isoleret fra LNCaP-celler ved anvendelse af RIPA-buffer (25 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS). Protein kvantificering blev udført ifølge Bradford-metoden (Bio-Rad Protein Assay) [9]. Prøver indeholdende en kombineret 40 ug totalt protein (20 ug ” tunge “og 20 ug ” lys”) blev fortyndet med Laemmli prøvepuffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) indeholdende 5% β-mercaptoethanol. Blandingen blev derefter opvarmet i 5 minutter ved 90 ° C og fyldt på 10% polyacrylamid gels.1-D SDS-PAGE separation blev udført med mini Protean II-systemet (Bio-Rad) ved 200 V i 45 minutter. Bånd blev visualiseret med Simply Blå Safe Stain (Life Technologies, CA, USA), og baner blev skåret i 12 sektioner, som blev hakkede i ~ 1×1 mm kvadrater. Efter distaining med 50% volumen /volumen acetonitril (ACN) i 25 mM ammoniumbicarbonat-puffer (bicarbonatpuffer) blev proteiner i gelstykker reduceret med 10 mM dithiothreitol (DTT) i bicarbonatbuffer og alkyleret ved inkubation med 50 mM iodacetamid i bicarbonatbuffer . Efter gel dehydrering med 100% ACN blev gelstykker dækket med ca. 50 pi 12,5 ug /ml trypsin i bicarbonatpuffer til in-gel digestion. Inkubation i spaltningen blev udført ved 37 ° C i 12 timer. Trypsin blev inaktiveret med myresyre ved 2% slutvolumen, og peptiderne blev ekstraheret og renset ved anvendelse af en C18 Tip søjle (ZipTips, Millipore, Medford, MA, USA), som tidligere beskrevet [10].

GeLC- MS /MS og dataanalyse

Peptider blev tørret i en vakuum centrifuge og resuspenderes i 20 pi 0,1% v /v trifluoreddikesyre (TFA) /H

2O. Peptid prøver blev læsset på to-gg kapacitet peptid fælder (CapTrap; Michrom Bio-ressourcer) og adskilt ved hjælp af en C18 kapillarsøjle (15 cm 75 mm, Agilent) med en Agilent 1100 LC pumpe leverer mobile fase ved 300 nl /min. Gradienteluering under anvendelse af mobile faser A (1% ACN /0,1% myresyre, balance H

2O) og B (80% ACN /0,1% myresyre, balance H

2O) var som følger (procenter for B, balance A): lineær fra 0 til 15% ved 10 min, lineær til 60% ved 60 min, lineær til 100% ved 65 min. Nano ESI MS /MS blev udført under anvendelse af en HCT Ultra ion trap-massespektrometer (Bruker). ESI blev leveret under anvendelse af en distal-spray coating Silica spids (id 20 um, tip indre id 10 um, New mål, Ringoes, NJ). Massespektre blev erhvervet i positiv ion-mode, kapillær spænding på -1100 V og aktiv ion opladning kontrol fælde scanning 300-1500 m /z; ved hjælp af en automatisk skift mellem MS og MS /MS-tilstande, var MS /MS fragmentering udført på de to mest udbredte ioner på hvert spektrum ved hjælp af kollision-induceret dissociation med aktiv udstødelse (udelukket efter to spektre og løsladt efter 2 min). Det komplette system var fuldt kontrolleret af HYSTAR 3.2 software.

Massespektre databehandling blev udført ved hjælp af Mascot Distiller (Version 2.4.3.3) med søgning og kvantificering værktøjskasse muligheder. Den genererede de-isotoped peak liste blev forelagt en in-house Mascot server 2.4.0 til søgning mod SwissProt database versionen 2013_01 (538849 sekvenser; 191337357 rester). Mascot søgeparametre blev fastsat som følger: arter, Homo sapiens (20,233 sekvenser); enzym, trypsin med maksimal 2 savnet spaltning; fast ændring: cystein carbamidomethylation; variable modifikationer: methionin oxidation, Gln- pyro-Glu (N-term Q), Glu- pyro-Glu (N-term E), Label: 13C (6) 15N (2) (K), og Label : 13C (6) (R); 0,90-Da mass tolerance for precursor peptidioner; og 0,6 Da for MS /MS fragment-ioner. SILAC kvantificering blev udført i Mascot Distiller hjælp SILAC K + 8 R + 6 kvantificering metode; SILAC nøgletal for tunge og lette peptid par blev beregnet under anvendelse af Simpsons integration anvendes, minimum 1 peptid med enestående sekvens og 0,05 af signifikant tærskel. Følgende kriterier blev anvendt til at vurdere protein identifikation: et eller flere unikke peptider med ion score ≥45 og to eller flere unikke peptider med ion score ≥30 (p 0,05 tærskel); proteiner identificeret, blev udvundet ved hjælp af MS data Miner (MDM) [11]. Kvantificerede proteiner med ≥ 2 og ≤ 0,5-gange ændring blev udvalgt og grupperet af biologiske funktioner, sti og netværksanalyse hjælp Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (www.ingenuity.com) for bioinformatik analyse.

Konstruktion af p-EGFP CALR plasmid

Totalt RNA blev isoleret fra HEK-293-humane embryoniske nyreceller ved anvendelse TriPure (Roche) ifølge producentens anvisninger. Første streng cDNA blev transkriberet under anvendelse iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). CALR cDNA blev amplificeret under anvendelse af designet CALR gen-specifikke kloningsprimere: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ‘; omvendt, 5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3 ‘. Protokollen indeholdt en indledende denatureringstrin ved 94 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 30 cykler med 30 sek. af denaturering ved 94 ° C, 30 sekunder af annealing ved 55 ° C og 45 sek. forlængelsesgrad ved 72 ° C efterfulgt ved et endeligt forlængelsestrin 72 ° C i 10 min. Ti mikroliter af PCR-produkt og 1 ug pEGF-LC3.1 plasmider blev fordøjet med 10 U /pl EcoRI og BglII (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) i 30 minutter ved 37 ° C. Fordøjelsesprodukteme blev underkastet 1,5% agarosegelelektroforese og derefter ekstraheret fra agarosegelen. Ligering af PCR-produktet: plasmid blev fremstillet ved anvendelse af 1: 1, 1: 3 og 1: 5 forhold med T4 DNA-ligase (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland). Rekombinant DNA blev transformeret ind i HB101-celler, der blev fremstillet under anvendelse af CaCl

2 metode. Positive kloner blev selekteret ved anvendelse af ampicillin (Amp) LB-agarplader. Alle kolonier blev opsamlet og dyrket i 1 ml Amp + LB og inkuberet natten over ved 37 ° C. Plasmider fra hver koloni blev isoleret ved anvendelse af QIAprep Spin Miniprep-søjler (Qiagen, Valencia, CA, USA). Plasmider fra udvalgte ti kolonier blev anvendt som templates til at amplificere CALR genet under anvendelse kloningsprimere i PCR. Én valgt amplificeret positiv plasmid blev sekventeret for at bekræfte den åbne læseramme (ORF) af EGF-CALR fusionsgenet (İontek, Tyrkiet). Det sekventerede rekombinante plasmid blev anvendt til overekspressionen eksperimenter.

Transient transfektion af pEGFP-CALR plasmid

LNCaP-celler blev podet natten over på plader med 6 brønde ved en densitet på 3×10

5 celler /brønd. Ca. 1 pg /pl pCMV-CALR i nærvær af transfektionsreagens (Fugene HD, Roche, Mannheim, Tyskland) blev fremstillet i serumfrie medier. Blandingen blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur og forsigtigt tilsat dråbevis på celler. Efter 48-h plasmid transfektion blev cellerne behandlet med 25 pM EBR, og totalt RNA blev isoleret for CALR ekspression analyse eller proteinekstraktion for western blotting.

Transient transfektion af CHOP-promotor (-649 /+ 136) pmCherry -1 plasmid

for at bestemme aktiviteten af ​​CHOP, blev LNCaP-celler transficeret med reporter-konstruktionen CHOP-promotor (-649 /+ 136) pmCherry-1 (Addgene plasmid 36035) under anvendelse af Fugene HD ifølge producentens anvisninger ( Roche, Mannheim, Tyskland), og kloner resistente over for kanamycin (500 pg /ml Sigma, St. Louis, MO, USA) blev dannet.

Evaluering af apoptotisk celledød ved Annexin V-FITC-farvning

LNCaP-celler blev podet i 6 brønde plader (3×10

5 celler /brønd) og behandlet med 25 pM EBR i 24 timer. Både flydende og adhærerende celler blev opsamlet, resuspenderet i Annexin V bindingsbuffer og inkuberet med Annexin V-FITC og PI efter producentens instruktioner (BD Biosciences, Bedford, MA). Et tusind hændelser per prøve blev erhvervet på Accuri C6 (BD Biosciences). Fluorescensemissioner blev opsamlet gennem 530 nm og 570 nm band-pass filtre til FITC og PI hhv. Data er præsenteret som dot plots (Annexin fluorescens på x-aksen; PI-fluorescens på y-aksen). Numrene til stede i de fire kvadranter repræsenterer procentdelen af ​​levedygtige (nederst til venstre), nekrotisk (øverst til venstre), tidligt apoptotisk (nederst til højre), og sent apoptotiske (øverst til højre) celler evalueret under anvendelse BD Accuri C6 software (BD Biosciences).

Western blot-analyse

Celler blev dyrket i 60-mm petriskåle i komplet medium. Medierne blev kasseret, og cellerne blev vasket med iskold 1 x PBS og lyseret med ProteoJET pattedyrcelle lyseringsbuffer (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland). Totale proteinniveauer blev bestemt ved anvendelse af Bradford-metoden (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [9]. Totale cellelysater blev adskilt ved 12% SDS-PAGE-geler og elektrooverført på polyvinylidenedifluoride (PVDF) membraner (Roche, Mannheim, Tyskland) udsat for elektroforese. Membraner blev vasket i Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBS-T) [10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 0,05% Tween-20] (Tween 20, Sigma Ultra, St. Louis, MO, USA). Membranerne blev blokeret i 5% skummetmælk indeholdende TBS-T mælk natten over ved 4 ° C. PVDF-membraner blev inkuberet med buffer indeholdende 5% (vol: vol) skummetmælk opløsning med egnede antistoffer CALR, CALNX, BiP, IRE1α, CHOP, ATF4, ATF6, PERK, PDI, Caspase 12, spaltet caspase 9, caspase 3, PARP, spaltet PARP, β-actin (hver fortyndet 1: 1000) og inkuberet ved 4 ° C natten over. Anti-kanin sekundært antistof blev fremstillet 1: 1000 fortynding i 5% (vol: vol) skummetmælk opløsning (CST, Denvers, MA, USA). Membraner blev skyllet med TBS-Tween 20 og inkuberet med HRP-konjugerede sekundære antistoffer ved 4 ° C natten over. Efter tilsætningen af ​​forøget kemiluminescens-reagens blev signaler fra de HRP-koblede antistoffer detekteres ved anvendelse ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Alle resultater blev replikeret mindst tre gange og repræsentative blots blev givet.

Måling af intracellulær Ca

2 + niveauer

LNCaP-prostatacancerceller blev behandlet med EBR i 12 timer, og intracellulær Ca

2 + niveauer blev bestemt ved calcium grøn-1 (1 pmol /l, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) farvning for 30 minutter. Flowcytometrisk analyse af farvede celler blev udført med et flowcytometer Accuri C6 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Calcium green-1-farvede celler blev observeret ved fluorescens mikroskopi (excitation 506 nm, emission: 531 nm).

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af ensidet uparret t-test . P 0,05 blev taget som et signifikansniveau. Western blot-resultater blev gentaget mindst tre gange. Band intensiteter blev kvantificeret ved hjælp ImageJ software og normaliseret til p-actin.

Resultater

Proteome af EBR-behandlede LNCaP celler

For at opnå et globalt perspektiv ændringer i hele proteom blev LNCaP-celler behandlet med EBR (25 uM) og underkastet SILAC behandling. I alt blev 964 unikke proteiner identificeret ved denne teknik. Ændringer større end 2-fold (≥ 2 og ≤ 0,5) mellem lette og tunge proteiner blev betragtet som signifikante ifølge cutoffs af tidligere undersøgelser [10]. Kvantitativ analyse mellem parrede prøver viste, at blandt de 964 proteiner blev 160 ændret sig markant efter 12 timer EBR behandling (S1 tabel).

Funktionel karakterisering af identificerede proteiner og bioinformatik analyse

Vi næste analyseret 160 differentielt udtrykt proteiner med hensyn til biologisk funktion, sti og netværk ved hjælp af IPA-software. Som vist i figur 1, ifølge den biologiske funktion analyse, EBR-ændrede proteiner har funktioner i cellulær vækst og proliferation (16,6%), celledød og overlevelse (14%), cellulær samling og organisation (13,3%), cellulær funktion og vedligeholdelse (13,3%), nukleinsyre metabolisme (5%), DNA-replikation (4%), proteinsyntese og protein foldning (3,7 og 1%, henholdsvis) (fig 1). Analysen af ​​kanoniske pathways (p ≤ 0,05) identificerede aldosteron signalering i epitelceller samt cellulære metaboliske veje (herunder UDP-N-acetyl-D-galactosamin-biosyntese, glukoneogenese, fedtsyrebiosyntese, protein ubiquitinering pathway, cytoskelet signalering og andre) (figur 2). CALR udviste et signifikant ændring efter 12 timer EBR behandling med score 150, 11 kampe, en tung /let-forhold på 0.4372 og 4 peptider (S1 tabel). Ud ifølge molekylerne forbundet med SILAC analyseresultater CALR blev nedreguleret med 2,287 sammenlignet med kontrolprøver (tabel 1).

Cirklen graf præsenterer de 160 differentielt udtrykte proteiner.

grafen repræsenterer værtscellelinier funktioner med den højeste score (y-aksen) baseret på antallet af differentielt regulerede proteiner. Genoptrykt fra Opfindsomt Pathways Analyse under en CC BY-licens, med tilladelse fra QIAGEN Silicon Valley, original copyright 2000-2013.

EBR-induceret modulering af CALR udtryk

differentielt udtrykte proteiner efter EBR behandling blev kortlagt til 7 specifikke funktionelle netværk med hvert netværk indeholder 11 eller flere medlemmer “Focus”. Netværkene af interesse svarede til celledød og overlevelse, cellulær samling og organisation, cellulær kompromis, cellulær funktion og vedligeholdelse, lægemiddelmetabolisme, lipidmetabolisme, cellemorfologi og cellulær funktion. CALR blev fundet en større protein i den cellulære reaktion, cellulær samling og organisation net (Fig 3A). Fordi CALR er en chaperone protein, og fordi ændringer i CALR udtryk fører til den udfoldede protein respons og ER stress, vi har registreret interaktionerne mellem CALR med andre molekyler til at opdage tegn på UPR efter EBR behandling i LNCaP prostata kræftceller. Mens vi kører IPA for pathway analyse efter EBR behandling, forudsagde det system, varmeshockprotein chaperone protein familie også kunne været involveret i EBR-induceret stressbetingelser som vist i fig 3B. Desuden IPA sammenligning af EBR effekt med andre kendte anticancermidler forårsager lignende virkninger indikerede, at EBR kan virke som en ER stress inducer ligesom tunicamycin og er i stand til at ændre varmechokproteiner og CALR (fig 3C).

A) Rød, opreguleret proteiner; grønne, betydeligt nedreguleret proteiner; hvid, proteiner vides at være i netværket, men ikke identificeret i vores undersøgelse. Den farvedybde indikerer størrelsen af ​​ændringen i proteinekspressionsniveauer. Figurerne er indikativ for den molekylære klasse (dvs. proteinfamilie). B) IPA viser veje kan indebære i EBR-induceret cellulære ændringer, C. tunicamycin, som et anticancermiddel forårsager en lignende effekt. Linjer forbinder molekylerne indikerer molekylære relationer. Pilen stilarter angiver specifikke molekylære relationer og retningen af ​​interaktionen. Genoptrykt fra Opfindsomt Pathways Analyse under en CC BY-licens, med tilladelse fra QIAGEN Silicon Valley, original copyright 2000-2013.

Validering af identifikation protein og kvantificering

Fordi protein interaktion netværk og pathway-analyse afslørede ændringen af ​​UPR reaktion i prostata cancer celler udsat for EBR, vi næste bestemmes ekspressionsniveauerne for andre UPR proteiner ved Western blotting. Vi bekræftede, at ændringerne i forholdene mellem CALR i LNCaP celler var i overensstemmelse med dem, der stammer fra SILAC undersøgelser (Fig 4A, venstre panel). Som vist i figur 4, selvom EBR behandling nedreguleret ekspressionsniveauet for CALNX, blev den molekylære chaperone BiP opreguleres. En overdreven ophobning af fejlfoldede proteiner i ER udløser dissociation af BiP fra ER membran-beliggende receptorer, såsom IRE1α, PERK og ATF6 som en betydelig ER stress respons. Efter aftale med den ændrede BiP udtryk profil blev IRE1α, PERK og ATF6 opreguleret efter EBR behandling LNCaP celler (Fig 4A, venstre panel). Vi bestemt også ekspressionsniveauerne af andre ER stress-relaterede proteiner såsom CHOP, ATF4 og PDI i den samlede proteinlysater. Vi observerede, at bestrålingen af ​​LNCaP-celler til EBR forøgede ekspression af CHOP i både cytoplasmiske og nukleare fraktioner (Fig 4C). Interessant, PDI, et stressprotein rigelige i ER, ikke forhøjet som reaktion på EBR behandling. Overdreven og langvarig ER stress udløser apoptose. I overensstemmelse med denne konstatering, EBR tidsafhængigt aktiverede caspase-12, caspase-9 og caspase-3 og induceret spaltning af PARP (Fig 4A, venstre panel). Lignende resultater blev observeret i DU145 prostatacancerceller udsat for EBR (Fig 4A, højre panel). Annexin-V /PI farvningsresultater bekræftede, at EBR apoptose i LNCaP-celler (figur 4B). Disse resultater indikerer, at EBR apoptose via UPR akse i begge prostatacancerceller uanset den funktionelle AR ekspression.

A) Samlet protein blev isoleret efter EBR behandling, og udtrykket profiler af ER stress biomarkører, caspaser og PARP-spaltning blev bestemt ved immunblotting under anvendelse af egnede antistoffer. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. B) Ca. 2 x 10

5-celler blev podet i en seks-brønds plade og behandlet med EBR til 12 og 24 timer. Annexin V-PI-farvning blev udført for at bestemme apoptotiske cellepopulationer. Fluorescens signaler fra Annexin V-FITC og fra PI rapporteres på x-aksen og y-aksen, hhv. Tal i de fire kvadranter repræsenterer procentdelen af ​​levedygtige (nederst til venstre), nekrotisk (øverst til venstre), tidligt apoptotisk (nederst til højre) og sen apoptotiske (øverst til højre) celler. C) Efter 12 timers EBR behandling, cytosoliske og nukleare proteiner blev isoleret og adskilt i en 12% SDS-gel, overført til en PVDF-membran og blottet med et anti-CHOP-antistof. D) LNCaP-celler blev transficeret med reporter-konstruktionen CHOP-promotor (-649 /+ 136) pmCherry-1. Den CHOP aktivering blev visualiseret med fluorescens mikroskopi. Excitation: 575 nm Emission: 601.

For at verificere, at resultatet af EBR-induceret apoptose blev relateret til UPR, LNCaP celler blev transficeret med reporterkonstruktet af CHOP promotor (-649 /+ 136 ) pmCherry-1 plasmid. Som vist i fig 4D, EBR inducerede klart CHOP aktivitet og den resulterende puncta mønster i LNCaP-celler. For yderligere at validere virkningen af ​​EBR overfor ER stress-relaterede apoptose, vi inhiberede mTOR ved rapamycin behandling til at blokere

de novo

mRNA og proteinsyntese. Inhibering af mRNA-syntese fører til akkumulering af ufoldede /fejlfoldede proteiner i ER og derfor kan potentielt afhjælpe ER stress-induceret celledød [12]. Vi observerede, at samtidig behandling med rapamycin signifikant forhindrede EBR-induceret tab cellernes levedygtighed (Fig 5A) og apoptose (fig 5B, venstre panel) i LNCaP-celler. I modsætning, 26S proteasominhibitor MG132 co-behandlingen yderligere øget tab cellernes levedygtighed (Fig 5A) og apoptose (fig 5B, højre panel). Ifølge de opnåede data, foreslår vi, at tilstedeværelsen af ​​MG132 forhindrede EBR-induceret nedbrydning af fejlfoldede proteiner og forværret den apoptotiske respons i LNCaP prostata kræftceller. Kollektivt, disse resultater understøtter den hypotese, at EBR-induceret celledød mekanisme medieres af UPR i prostatacancerceller.

A) Celletab levedygtighed efter samtidig behandling med rapamycin (10 nM) eller forbehandling med MG132 (10 uM) i nærvær af EBR (25 uM) i 12 h blev målt ved MTT-assayet. B) Effekten af ​​rapamycinet eller MG132 +/- EBR blev bestemt ved PARP immunblotting. β-actin blev anvendt som en belastning kontrol.

CALR er et vigtigt mål for EBR

For at begynde at forstå den molekylære mekanisme bag EBR-induceret UPR, vi forbigående transficerede LNCaP celler med et GFP-mærket pCMV-CALR plasmid (fig 6A). Samtidig vi udnyttet tunicamycin som en positiv kontrol til at aktivere ER stress i AR-sensitive LNCaP-celler. Selvom CALR overekspression forhindrede EBR-afhængige tab af cellelevedygtighed, var det ikke udøve samme effekt efter tunicamycin behandling (Fig 6B). Selvom tunicamycin aktiveret ER stress vej ved at opregulere ekspression af CALR, CALNX, BiP og CHOP, EBR behandling kun inducerede opregulering af CHOP men nedreguleret CALR og CALNX. CALR overekspression mindsket den potentielle effekt af EBR på ER signalering spillere, som viste, at CALR er en kritisk mål for EBR i LNCaP celler. Desuden foreslår vi, at EBR adskiller sig fra tunicamycin gennem aktivering forskellige mål for ER stress maskiner (Fig 6C).

A) Effekten af ​​12-h EBR behandling efter pEGFP-CALR plasmidtransfektion blev visualiseret via GFP prikker i LNCaP-celler. Tunicamycin behandlingen blev udført som en positiv kontrol. B) Effekten af ​​EBR i pEGFP-CALR plasmid-transficerede LNCaP-celler efter 12 timers EBR behandling blev bestemt ved MTT-assayet. C) Virkningen af ​​EBR overfor ER stress og apoptose biomarkører i CALR-transficerede LNCaP-celler blev bestemt ved immunblotting. Tunicamycin-behandlede cellelysater blev anvendt som en positiv kontrol; β-actin blev anvendt som en belastning kontrol.

Næste, vi bestemmes apoptotiske effektivitet EBR i både WT og CALR + LNCaP celler. Som vist i fig 6C, EBR aktiveret caspase-12, som kulminerede i PARP-spaltning i LNCaP wt celler, men ikke i CALR + LNCaP-celler (figur 6C). Som CALR er en vigtig regulator af intracellulær Ca

2+ bufferkapacitet, hvilket også udløser apoptose, vi undersøgte Ca

2 + niveauer efter EBR behandling (figur 7). Vi observerede, at EBR behandling øge frigivelsen af ​​Ca

2+ med 6-fold i LNCaP-celler. Salg

Celler blev behandlet med EBR i 12 timer og farvet med calcium grøn. Fluorescensintensiteten blev bestemt med FACS flow og fluorescens mikroskopi (excitation 506 nm, emission: 531 nm).

Endelig foreslog vi, at EBR induceret apoptose i prostata kræftceller ved at forårsage ER stress relateret til CALR nedregulering og Ca

2+ udsætning i cytosolen (fig 8).

diskussion

EBR, en plantevækstregulator, er for nylig blevet foreslået som kandidat kemoterapeutisk medicin, fordi