PLoS ONE: Cancerimmunterapi Anvender et innovativt strategi til at øge CD4 + T-celle-hjælp i Tumor mikromiljø

Abstrakt

kemoterapi og /eller strålebehandling er almindeligt anvendt som kræftbehandling, men de antitumorvirkninger de producerer kan forøges ved kombination med immunterapi. Kemoterapi dræber tumorceller, men det frigiver også tumorantigen og tillader cross-præsentation af tumorantigenet at udløse antigenspecifikke cellemedierede immunresponser. Fremme CD4 + T hjælper celle immunreaktioner kan anvendes til at forbedre den tværgående præsentation af tumorantigenet efter kemoterapi. Pan HLA-DR bindende epitop (PADRE-peptid) er i stand til at generere antigenspecifikke CD4 + -T-celler, som binder forskellige MHC klasse II-molekyler med høj affinitet og har været meget anvendt i forbindelse med vacciner for at forbedre deres styrke ved at forbedre CD4 + T-cellereaktioner . Her har vi undersøgt om intratumoral injektion af PADRE og adjuvansen CpG i HPV16 E7-udtrykkende TC-1 tumorer efter cisplatin kemoterapi kan føre til potente antitumorvirkninger og antigenspecifikke cellemedierede immunresponser. Vi observerede, at behandling med alle tre midler producerede de mest potente antitumorvirkninger sammenlignet med parvise kombinationer. Desuden behandling med cisplatin, CpG og PADRE kunne kontrollere tumorer på et fjernt sted, hvilket indikerer, at vores tilgang er i stand til at inducere cross-præsentation af tumorantigenet. Behandling med cisplatin, CpG og PADRE forbedret også frembringelsen af ​​PADRE-specifikke CD4 + T-celler og E7-specifikke CD8 + -T-celler og faldt antallet af MDSCs i tumor loci. Den behandlingsplan præsenteres her repræsenterer en universel tilgang til kræft kontrol

Henvisning:. Song L, Yang MC, Knoff J, Wu TC, Hung CF (2014) Cancer Immunterapi Anvender et innovativt strategi til at øge CD4 + T-celle Hjælp i tumormikromiljøet. PLoS ONE 9 (12): e115711. doi: 10,1371 /journal.pone.0115711

Redaktør: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Holland

Modtaget: Marts 19, 2014 Accepteret: November 27, 2014; Udgivet: 22 December, 2014

Copyright: © 2014 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health /National Cancer Institute Livmoderhalskræft SPORE P50CA098252 og 2R01CA114425-06 tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kemoterapi og /eller strålebehandling er almindeligt anvendt som kræftbehandling. Både kemoterapi og strålebehandling er blevet vist at omdanne tumormikromiljøet i en egnet indstilling til efterfølgende immunterapeutisk vaccination [1], [2]. Vi har tidligere anvendt cisplatin kemoterapi at prime tumormikromiljøet til vaccination med en rekombinant protein, og fandt, at dette behandlingsregimen inducerede kraftige antitumorvirkninger og antigenspecifikke cellemedierede immunresponser [1]. Ikke alene cisplatin dræbe tumorceller, men også det frigiver tumorantigen og tillader cross-præsentation af tumorantigenet at udløse antigenspecifikke cellemedierede immunresponser. Imidlertid kan de antitumor virkninger af kemoterapi forbedres ved kombination med immunterapi.

En strategi for forstærket cross-præsentation af tumorantigenet efter kemoterapi er at fremme CD4 + T hjælper celle immunreaktioner. Et middel stand til at generere antigenspecifikke CD4 + -T-celler, som binder forskellige MHC klasse II-molekyler med høj affinitet er pan HLA-DR bindende epitop (PADRE-peptid) [3]. PADRE-peptidet er blevet bredt anvendt i forbindelse med vacciner for at forbedre deres styrke ved at forbedre CD4 + T celle responser [4] – [7]. Derfor intratumoral administration af PADRE potentielt kan skabe PADRE-specifikke CD4 + T-hjælper celler for yderligere at forbedre cross-præsentation til generering tumor antigen-specifikke CD8 + T-celler. Ansættelse af et immunstimulerende adjuvans med PADRE-peptidet kan yderligere forbedre tumor antigen-specifikke CD8 + T-celler.

toll-like receptor 9 (TLR9) -agonist CpG er en almindeligt anvendt adjuvans, som har vist sig at stimulere CD8 + T celle krydspriming ved at fremme type I-interferon produktion [8], [9]. CpG har også vist sig at have antitumorvirkninger, når injiceret direkte i tumoren [10] – [12]. Endvidere CpG er blevet vist, at blokere den immunsuppressive aktivitet af MDSCs i tumorbærende mus [13]. Disse undersøgelser antyder, at det immunstimulerende funktion CpG kan anvendes til at forbedre den tværgående præsentation af tumorantigenet at generere tumor antigen-specifikke CD8 + T-celle-medierede immunresponser.

I den aktuelle undersøgelse, vi hypotese, at cisplatin behandling efterfulgt af CpG-adjuvans og PADRE-peptid administration ville øge cross-præsentation af tumorantigen, hvilket fører til kraftige antitumorvirkninger. For at teste denne anvendte vi mus med HPV16 E7-udtrykkende TC-1-tumorer og behandlede dem med forskellige kombinationer af cisplatin efterfulgt af intratumoral injektion med CpG og PADRE-peptidet. Vi fandt, at behandling med alle tre midler producerede de mest potente antitumorvirkninger. Desuden behandling med cisplatin, CpG og PADRE kunne kontrollere tumorer på et fjernt sted, hvilket indikerer, at vores fremgangsmåde var i stand til at inducere cross-præsentation af tumorantigenet. Vi fandt, at behandling med cisplatin, CpG og PADRE forbedret generering af PADRE-specifikke CD4 + T-celler såvel som E7-specifikke CD8 + T-celler. Behandling med cisplatin, CpG og PADRE reducerede også antallet af MDSCs i tumor loci, en proces fundet at være medieret af Fas-FasL apoptose pathway. Behandlingskuren præsenteres her er en hidtil ukendt anvendelse af en kombination af immunoterapi der inducerer potent antitumor immunresponser uden at kræve viden om immunodominante tumorantigener, hvilket gør den fremgangsmåde potentielt bredt anvendelig.

Materialer og metoder Salg

Etik Statement

Alle animalske procedurer, der anvendes i denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt for denne specifikke undersøgelse og i overensstemmelse med anbefalinger til korrekt brug og pleje af forsøgsdyr ved Johns Hopkins University Animal Care og brug Udvalg. Alle cellelinjer blev etableret og opretholdt med godkendte protokoller. Mus blev aflivet med henblik på denne undersøgelse under anvendelse af CO

2 i overensstemmelse med dyret protokollen. Med hensyn til de menneskelige endpoint standarder, mus viser alvorlige angst eller bærer tumorer, der oversteg 20 mm i diameter blev aflivet med CO

2 i overensstemmelse med dyret protokollen.

Forsøgsdyr

Seks til otte -Uge gammel kvinde C57BL /6 mus blev opnået fra National Cancer Institute-Frederick Animal Production Area (Frederick, MD). Musene blev opstaldet i onkologi dyr facilitet i Johns Hopkins Hospital (Baltimore, MD).

Celler

TC-1 tumor model blev produceret i vores laboratorium ved transformation af primær lunge epitelceller fra C57BL /6 mus med aktive Ras sammen med HPV 16 E6 og E7 onkogener og produktion og vedligeholdelse i henhold til godkendte protokoller af denne cellelinie er tidligere [14] beskrevet. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium indeholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 10% natriumpyruvat, 10% ikke-essentiel aminosyre, og 100 pg /ml streptomycin i en befugtet atmosfære af 5% CO

2 /95% luft ved 37 ° C. E7-specifikke CD8 + T-celler blev frembragt fra splenocytter fra E7 vaccinerede mus og blev stimuleret med bestrålede TC-1-celler og 10 IU interleukin-2 (IL-2) hver uge. PADRE-specifikke CD4 + T-celler blev frembragt fra C57BL /6 mus immuniseret med pcDNA3-Ii-PADRE ved gen-gun. Celler blev stimuleret med bestrålede PADRE peptid-pulserede DC’er og IL-2 (10 IU) ugentligt [15].

Peptid, antistoffer og reagenser

PADRE-peptidet (Pan HLA-DR reaktiv epitop , AKFVAAWTLKAAA), og H2-D

b-begrænset HPV16 E7aa49-57 peptid (RAHYNIVTF) blev syntetiseret af Beckman Coulter ved en renhed på 90%.

FITC, PE og APC-konjugeret anti-muse CD8a (klon 53.6.7), FITC-konjugeret anti -mouse IFN-γ (klon XMG1.2), FITC og PE-konjugeret anti-muse CD4 (klon RM4-5), APC-konjugeret anti-muse CD11 (klon M1 /70), PE-konjugeret anti-muse Ly6G (klon 1A8), PE-konjugeret anti-muse CD154 (CD40L, klon MR1), Funktionel anti-muse CD95 (Fas, klon Jo2) agonistiske antistoffer, og FITC Annexin V Apoptose Detektion kit, blev indkøbt fra BD Pharmingen (San Diego, CA). PE-konjugeret CD178 (Fas-L, klone MFL3), PE-konjugeret anti-muse CD95 (Fas, klon 15A7), FITC-konjugeret anti-muse CD40 (cloneHM40-3), funktionel anti-muse CD40-agonist (klon 1C10) , og anti-muse CD154 (CD40L, klon MR1) antistoffer blev indkøbt fra eBioscience (San Diego, CA). PE-konjugeret, HPV 16 E7aa49-57 peptid og RAHYNIVTF indlæst H2-D

b tetramerer blev opnået fra National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme tetramere Facility (Atlanta, GA). Fas /Fas L antagonist Kp7-6 blev købt fra EMD Chemicals (San Diego, Californien).

In vivo

tumor behandling eksperimenter og antistof udtømning

tumor behandling eksperimenter Der blev udført to gange uafhængigt af hinanden. På dag 0, 1 x 10

5 TC-1 tumorceller blev inokuleret subkutant i C57BL /6-mus (5 pr gruppe). Fire dage senere blev tumorbærende mus behandlet med cisplatin (5 mg /kg legemsvægt) eller PBS-kontrol intraperitonealt. På dag 5 blev mus immuniseret intratumoralt enten med PBS-kontrol, 20 ug PADRE-peptid, 10 ug CpG, eller kombinationen af ​​de to sidstnævnte. Alle behandlinger blev gentaget 3 gange mere ved 7-dages intervaller. Tumorvækst blev overvåget ved visuel inspektion, palpering, og digitale calipre (Scienceware) to gange om ugen. Mus blev aflivet, når diameteren af ​​tumoren nåede 20 mm.

Til systemisk antitumor vurdering, mus (5 pr gruppe) blev udfordret subkutant med 1 x 10

5 TC-1 tumorceller på højre flanke . Fem dage senere, 3 × 10

4 TC-1 tumorceller blev inokuleret subkutant i venstre side. Tumorbærende mus blev enten behandlet med PBS-kontrol eller undergik tredobbelt terapi (cisplatin 5 mg /kg IP kombineret med 20 ug PADRE-peptid og 10 ug CpG ved intratumoral injektion) tre gange med 5 dages interval. I CD8 + T-celle depletion gruppe blev 100 ug anti-muse CD8-antistof (klon 2.43) leveret til musene via intraperitoneal injektion på dag 3, 4, 5 efter tumorprovokation. Efterfølgende blev 150 ug /muse-anti-muse CD8-antistof leveret per uge for at opretholde mere end 90% CD8 + T-celle depletion.

Fremstilling af enkelt-cellesuspensioner fra TC-1 subkutan tumor

tumor væv blev forsigtigt dissekeret fra musene. De faste tumorer blev derefter hakket i 1 til 2 mm stykker og inkuberes med serum-frit RPMI 1640-medium indeholdende 0,05 mg /ml collagenase I, 0,05 mg /ml collagenase IV, 0,025 mg /ml hyaluronidase IV, 0,25 mg /ml DNase I (begge fra Roche, Indianapolis, IN), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter som beskrevet tidligere [16].

CELLEOVERFLADEFARVNING, intracellulær cytokin farvning og flowcytometri-analyse

i tetramerfarvning, encellede suspenderet splenocytter eller tumorinfiltrerende lymfocytter blev farvet med oprenset anti-mus CD16 /32 (Fc-blok, BD Pharmingen, San Diego, CA) først, og derefter med anti-muse CD8-FITC, PE-konjugeret HPV16 E7 aa49-57 (RAHYNIVTF) peptidladede H2-D

b tetramer ved 4 ° C. Cellerne blev farvet med 7-AAD før flowcytometrianalyse at udelukke døde celler.

Til påvisning HPV16 E7-specifikke CD8 + T-cellereaktioner og PADRE-specifikke CD4 + T-celler ved IFN-γ intracellulær farvning, PBMC’er, encellede suspenderede splenocytter eller tumorinfiltrerende lymfocytter blev stimuleret med enten HPV16 E7aa49-57 eller PADRE-peptid (1 pg /ml) i nærvær af Golgiplug (BD Pharmingen, San Diego, CA) ved 37 ° C natten over. De stimulerede celler blev derefter vasket en gang med FACScan buffer og farvet med PE-konjugeret monoklonalt rotte-anti-muse CD8a eller anti-muse CD4. Celler blev udsat for intracellulær cytokin-farvning ved anvendelse af Cytofix /Cytoperm Kit ifølge producentens anvisninger (BD Pharmingen, San Diego, CA). Intracellulær IFN-γ blev farvet med FITC-konjugeret rotte-anti-muse IFN-γ. Flowcytometri-analyse blev udført under anvendelse FACSalibur med CELLQuest software. Alle analyser blev udført med Flowjo software (Tree stjerne).

Isolering af myeloide afledte suppressorceller i tumor-bærende mus og undertrykkelse af T-celle proliferation

CD11 + Ly6G

Hi MDSCs var isoleret fra encellede splenocytsuspensioner af Tc-1 tumorbærende C57BL /6-mus under anvendelse CD11 + Ly6G isolation kits og LS kolonner til magnetisk separation i overensstemmelse med producentens instruktioner (Miltenyi Biotec). Renheden var ikke mindre end 95%.

In vitro

MDSC apoptose evaluering

Rensede MDSCs blev inkuberet ved 37 ° C eller co-dyrket med PADRE-specifikke CD4 + T celler ved en 1:01 ratio for op til 24 timer i 96-brønds plader. Celler blev derefter farvet med APC anti-muse CD11, PE-anti-muse Ly6G, FITC-anti-muse Annexin V-antistoffer og 7-AAD (FITC Annexin V Apoptose Detection Kit, BD Pharmingen, San Diego, CA) og undersøgt ved flowcytometri. MDSCs blev først gatet på CD11 + og Ly6G

Hej, og derefter frekvensen af ​​apoptose blev målt ved Annexin V + og 7-AAD.

At evaluere antistof induceret MDSC apoptose, isoleret MDSC blev dyrket i 12 timer med anti-Fas agonistisk antistof (2 ug /ml, BD Pharmingen, klon Jo2, San Diego, CA), eller isotype mAb. Til in vitro blokering assay isolerede MDSCs co-dyrket med PADRE- specifik CD4 + T-celle på 01:01 ration, derefter inkuberet med isotype mAb eller Fas-Fas L antagonist (Kp7-6, Calbiochem) i 24 timer.

Statistisk analyse

Alle data præsenteres i denne undersøgelse er udtrykt som gennemsnit ± SE hvor det er angivet. Sammenligninger mellem individuelle datapunkter for intracellulær cytokin farvning med flowcytometrianalyse og tumorbehandling blev foretaget ved hjælp af to-halet t-test af Graph Prism 6.0. I forsøgene tumor behandling, den vigtigste resultat af interesse var varighed indtil musene aflivet. Begivenhedstidspunktet distributioner for forskellige mus blev sammenlignet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og log-rank test af Graph Prism 6.0. Alle p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Behandling af TC-1 tumor-bærende mus med cisplatin, CpG og PADRE peptid genererer potent antitumorvirkninger

TC-1 tumor-bærende mus blev anvendt til at undersøge de antitumorvirkninger af forskellige behandlinger kombinerer intraperitoneal cisplatin kemoterapi, intratumoral injektion af PADRE-peptid og /eller intratumoral injektion af CpG. C57BL /6-mus blev udfordret med 1 × 10

5 TC-1 tumorceller på dag 0, og opdelt i fem behandlingsgrupper. Mus i gruppe 1 var ubehandlet, de i gruppe 2 blev behandlet med cisplatin efterfulgt af intratumoral CpG, i gruppe 3 blev behandlet med cisplatin efterfulgt af intratumoral PADRE-peptid, i gruppe 4 blev behandlet med intratumoral CpG og PADRE, og dem i gruppe 5 blev behandlet med cisplatin efterfulgt af intratumoral CpG og PADRE (fig. 1A). Som vist i fig. 1B, behandling med cisplatin efterfulgt af intratumoral CpG og PADRE signifikant reduceret tumorvolumen i forhold til kontrol og behandling med CpG og PADRE kun. Endvidere behandling med cisplatin efterfulgt af intratumoral CpG og PADRE signifikant forbedret overlevelse sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper (fig. 1C). Disse data antyder, at kombinationen af ​​cisplatin, CpG og PADRE har betydelige antitumorvirkninger mod TC-1 tumorer.

C57BL /6-mus (5 mus /gruppe) blev provokeret subkutant med TC-1 tumorceller og behandlet med forskellige kombinationer af cisplatin, CpG og PADRE-peptidet. A. Skematisk diagram af behandlingsregimer. B. Plot af tumor vækst kinetik. C. Kaplan-Meier overlevelse plot. (*

s

0,05, ***

s

0,001, ***

s

0,0001).

behandling med cisplatin, CpG og PADRE-peptidet fremkalder stærke systemiske antitumorvirkninger Salg

Da behandling med cisplatin, CpG og PADRE genereret de mest potente antitumorvirkninger (fig. 1), vi næste undersøgt, om behandling med alle tre midler kunne generere antitumorvirkninger i en sekundær tumor. C57BL /6-mus blev subkutant udfordret med Tc-1 tumorceller i højre flanke på dag 0, og derefter igen på venstre flanke på dag 5. En gruppe mus blev derefter behandlet med anti-CD8-antistof på dag 3-5 og derefter ugentligt at depletere CD8 + T-celler. Mus blev behandlet som vist i fig. 2A, med cisplatin injiceret intraperitonealt og med CpG og PADRE injiceret intratumoralt i den primære tumor på højre flanke. Som vist i fig. 2B, volumenet af den primære tumor blev signifikant reduceret hos mus behandlet med cisplatin, CpG og PADRE sammenlignet med ubehandlede mus. Endvidere er mængden af ​​den sekundære tumor på venstre blev også signifikant reduceret hos mus behandlet med alle tre midler sammenlignet med ubehandlede mus (fig. 2C). Udtømning af CD8 + -T-celler faldt betydeligt den terapeutiske virkning af cisplatin, CpG og PADRE behandling i både de primære og sekundære tumorer, hvilket indikerer, at CD8 + T-celler er vigtige for behandlingseffekt (fig. 2B og C). Fig. 2D viser, at behandling med cisplatin, CpG og PADRE signifikant forlænger overlevelsen af ​​TC-1 tumorbærende mus sammenlignet med CD8 + T-celle-depleterede mus og ubehandlede mus. Tilsvarende, udtømning af CD4 + -T-celler væsentligt forringet de antitumor virkninger af den tredobbelte behandlingsregime (S1A Fig.). Endvidere infusion af PADRE-specifikke CD4 + T-celler i tumorbærende mus signifikant forøget antitumorvirkning (S1B Fig.). Disse resultater viser, at CD4 + T-celler er også vigtige for den observerede terapeutiske effekt. Taget sammen indikerer dataene, at behandling med cisplatin efterfulgt af CpG og PADRE genererer potente systemisk antitumor immunresponser stand til at virke mod tumorer på fjerne steder.

C57BL /6-mus (5 mus /gruppe) blev provokeret sekventielt med TC-1 tumorceller på dag 0 (højre flanke) og dag 5 (venstre flanke), og derefter var enten ubehandlet eller behandlet med cisplatin kombineret med intratumoral injektion med CpG og PADRE-peptidet i den primære tumor. I CD8 + T-celle depletion gruppe blev mus behandlet som ovenfor, med adition af 100 ug anti-muse CD8-antistof (klon 2.43) injiceret intraperitonealt på dag 3, 4 og 5 efter tumorbelastning, og derefter 150 ug pr uge senere. A. Skematisk diagram af behandlingsregime. B. Scatter plot af primær tumorvækst kinetik. C. Scatter plot af sekundære tumor vækstkinetik. D. Kaplan-Meier overlevelse plot. (***

s

0,001, ****

s

0,0001)

Behandling med cisplatin, CpG og PADRE øger systemisk PADRE. -specifikke CD4 + T celle responser i TC-1 tumor-bærende mus Salg

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​behandling med forskellige kombinationer af cisplatin, CpG og PADRE på systemiske CD4 + T-celle-immunresponser. TC-1 tumor-bærende mus blev behandlet med forskellige kombinationer af cisplatin, CpG og PADRE-peptid som vist i fig. 1A og PBMC’er blev analyseret ved flowcytometri 1 uge efter den sidste antigenafgivelse for tilstedeværelse af IFN-γ-udskillende PADRE-specifikke CD4 + T-celler. Som vist i fig. 3A og B, tumorbærende mus behandlet med cisplatin efterfulgt af CpG og PADRE genereret flest PADRE-specifik IFN-γ + CD4 + -T-celler systemisk sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. Dette indikerer, at behandling med cisplatin, CpG og PADRE kan generere potente PADRE-specifikke CD4 + T celle responser i TC-1 tumor-bærende mus.

C57BL /6-mus (5 mus /gruppe) blev udfordret subkutant med TC-1 tumorceller og efterfølgende behandlet med forskellige kombinationer af cisplatin, CpG og PADRE-peptid som angivet. PBMC’er blev analyseret 1 uge efter den sidste antigenafgivelse. Tilstedeværelsen af ​​PADRE-specifikke CD4 + T-celler i PBMC’er blev analyseret ved anvendelse intracellulær cytokin farvning for IFN-γ og CD4 + farvning efterfulgt af flowcytometri analyse. A. repræsentant flowcytometri konturplot afbilder frekvensen af ​​IFN-y-udskillende CD4 + -T-celler i kredsløbet efter at være blevet pulseret med PADRE-peptidet. B. Søjlediagram kvantificering af dataene (gennemsnit ± SE).

Behandling med cisplatin, CpG og PADRE inducerer lokale tumor antigen-specifikke CD8 + T celle responser i TC-1 tumor-bærende mus

TC-1 tumor-bærende mus blev behandlet med forskellige kombinationer af cisplatin, CpG og PADRE-peptid som vist i fig. 1A. Tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) blev høstet til analyse 12 dage efter den sidste antigenafgivelse. Tilstedeværelsen af ​​PADRE-specifikke CD4 + T-celler og E7-specifikke CD8 + T-celler blandt TIL’er blev karakteriseret under anvendelse af intracellulær cytokin-farvning for IFN-γ såvel som CD4 og CD8-farvning og analyseret ved flowcytometri. Som vist i fig. 4A og C, mus behandlet med cisplatin efterfulgt af CpG og PADRE genereret den højeste procentdel af PADRE-specifikke CD4 + T-celler blandt tumorinfiltrerende CD4 + -T-celler sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. Endvidere mus behandlet med cisplatin, CpG og PADRE genereret det højeste antal E7-specifikke CD8 + T-celler blandt tumorceller sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper (fig. 4B og D). Det er vigtigt at bemærke, at TIL’er indsamlet fra inden tumormikromiljøet er i en aktiveret tilstand, hvor T-cellereceptorer bliver internaliseret. Således forekommer farvning som en gradient på grundlag af de forskellige niveauer af TCR-internalisering. Dette udseende afviger fra farvningsmønstret sædvanligvis observeres i vurderingen af ​​antigenspecifikke T-celler i det systemiske kredsløb, hvor en særskilt population ville blive observeret. Taget sammen antyder disse data, at behandling med cisplatin, CpG og PADRE kan føre til cross-præsentation af tumorantigenet, E7, hvilket resulterer i forbedrede tumor antigen-specifikke CD8 + T-celle-medierede immunresponser i tumoren loci.

C57BL /6-mus (5 pr gruppe) blev udfordret subkutant med TC-1 tumorceller og behandlet med forskellige kombinationer af cisplatin, CpG og PADRE-peptid som angivet. 12 dage efter den sidste antigenafgivelse blev tumorinfiltrerende lymfocytter høstet for at analysere de immuncelleundergrupper. A. repræsentant flowcytometrianalyse afbilder frekvensen af ​​PADRE-specifikke IFN-y-udskillende CD4 + T-celler blandt de samlede tumorinfiltrerende CD4 + T-celler. B. Søjlediagram kvantificering af data fra A. (gennemsnit ± S.E.). C. repræsentant flowcytometrianalyse afbilder det absolutte antal E7 tetramer-bindende CD8 + T-celler i 5 × 10

5 enkelt-cellesuspension fremstillet ud fra tumorer. D. Søjlediagram kvantificering af data fra C. (gennemsnit ± SE).

Behandling med cisplatin, CpG og PADRE nedsætter myeloide afledte suppressor celler i tumor loci

For yderligere at undersøge virkninger af cisplatin, CpG og PADRE behandling, analyserede vi de immunosuppressive myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) blandt tumorinfiltrerende-lymfocytter af behandlede TC-1 tumor-bærende mus. Mellem 30 og 35 dage efter tumorprovokation blev tumorer høstet og analyseret ved flowcytometri som vist i fig. 5A. Fig. 5B viser, at tumorer i mus behandlet med cisplatin, CpG og PADRE havde en signifikant lavere procentdel af CD11 + Ly6G

Hi MDSCs i tumoren loci sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. Disse data antyder, at behandling med cisplatin, CpG og PADRE fremkalder antitumorvirkninger i det mindste delvist ved at reducere populationen af ​​MDSCs i tumormikromiljøet.

C57BL /6-mus (5 pr gruppe) blev udfordret subkutant med TC 1 tumorceller og behandlet med forskellige kombinationer af cisplatin, CpG og PADRE-peptidet. Ved 30-35 dage efter tumor udfordring, når tumor diametre oversteg 10 mm, blev tumor-infiltrerende celler høstet for at analysere for tilstedeværelsen af ​​CD11 + Ly6G

hi MDSCs. A. Repræsentative kontur plots skildrer frekvensen af ​​CD11 + Ly6G

hi MDSCs i single-celle suspension fremstillet af tumor. B. Søjlediagram kvantificering af data fra A (middel ± SE) (*

s

0,05, ***

s

0,0001).

PADRE-specifikke CD4 + T-celler inducerer MDSC apoptose gennem Fas og Fas-ligand pathway

Vi observerede, at behandling med cisplatin efterfulgt af CpG og PADRE reduceret antallet af MDSCs i tumor loci. Tidligere er det blevet vist, at MDSCs udtrykker Fas og vil undergå Fas-FasL-medieret apoptose, hvis den møder en T-celle der udtrykker FasL [17]. Vi derfor karakteriseret effekten af ​​aktiverede PADRE-specifikke CD4 + T-celler på MDSCs i form af apoptotisk aktivitet og fandt, at MDSCs inkuberet med PADRE-specifikke CD4 + T-celler havde signifikant højere ekspression af annexin V sammenlignet med dem inkuberet med medium kontrol, hvilket indikerer, at aktiverede CD4 + -T-celler er i stand til at inducere apoptose af MDSCs (fig. 6). Derudover observerede vi, at MDSCs samdyrket med PADRE-specifikke CD4 + T-celler kombineret med Fas-FasL-antagonist Kp7-6 faldt betydeligt frekvensen af ​​apoptose sammenlignet med kontrol (fig. 7). Taget sammen antyder disse data, at PADRE-specifikke CD4 + T-celler inducerer apoptose i MDSCs gennem en Fas-FasL-afhængige vej, hvilket viser, at MDSC aflivning kan forekomme via en ikke-antigen-specifik pathway.

Oprenset milt CD11b + Ly6G

Hi MDSCs blev inkuberet med PADRE-specifikke CD4 + T-celler eller medium kontrol i 24 timer. A. Repræsentant flowcytometri plots skildrer frekvensen af ​​CD11 + Ly6G

Hi Annexin V + MDSCs. B. Søjlediagram kvantificering af data A (middelværdi ± S.E.) (****

s

0,0001)

A.. Ekspression af Fas i MDSCs i nærvær og fravær af PADRE-specifikke CD4 + T-celler. B. Søjlediagram kvantificering af data i A (gennemsnit ± S.E.). C. Oprenset milt-Ly6G

Hi MDSCs blev inkuberet i 12 timer med Fas-agonist-antistof (Jo2) eller irrelevant kontrol-IgG, og CD11b + Ly6G

Hi-celler blev analyseret for frekvensen af ​​apoptose (Annexin V + og 7-AAD -). D. MDSCs blev co-dyrket med PADRE-specifikke CD4 + T-celler i 24 timer kombineret med irrelevant kontrol-IgG eller Fas-FasL antagonist Kp7-6. CD11b + Ly6G

Hi-celler blev analyseret for frekvensen af ​​apoptose, kendetegnet ved Annexin V + og 7-AAD-. Repræsentant flowcytometri dot plots skildrer frekvensen af ​​CD11 + Ly6G

Hi Annexin V + MDSCs. E. Søjlediagram kvantificering af data i D (middel ± SE) (***

s

0,001, ***

s

0,0001).

diskussion

i den foreliggende undersøgelse har vi vist, at behandling med cisplatin efterfulgt af intratumoral injektion af et potent adjuvans, CpG, og en pan HLA-DR reaktive epitop, PADRE-peptid, genererer potent antigen- specifik cellemedierede immunrespons og antitumorvirkninger. Notatet behandling med cisplatin, CpG og PADRE genereret systemiske antitumorvirkninger og var i stand til at kontrollere tumorer på fjerne steder. Desuden er vores behandling reducerede populationen af ​​MDSCs i tumor loci, og derved reducere immunsuppression i tumormikromiljøet. Taget sammen antyder disse data, at cisplatin, CpG og PADRE øge cross-præsentation af tumorantigenet at generere tumor antigen-specifikke CD8 + T-celle-medierede immunresponser. Kombinationen af ​​kemoterapi, adjuvans og immunogen peptid præsenteres her repræsenterer en universel tilgang til tumor kontrol.

Af note, giver den nuværende tredobbelte kombinationsbehandling tilgang omfatter ikke indførelsen af ​​E7-antigenet gennem vaccination. Ikke desto mindre er dannelsen af ​​E7-specifikke CD8 + T-celler observeret (fig. 4B). Vi ræsonnere, at den observerede E7-specifikke CD8 + T-celle-respons fremkaldt af cross-præsentation af E7-antigenerne frigives fra tumor efter cisplatin-induceret apoptose ved antigenpræsenterende celler. Type 1 Interferon produktion efter CpG behandling også tjener til at fremme cross-præsentation.

Her er vi konstatere, at PADRE-specifikke CD4 + T-celler er i stand til at dræbe MDSCs gennem Fas-FasL interaktion. Foruden PADRE-specifikke CD4 + T-celler, der kan dræbe MDSCs i tumormikromiljøet, kunne andre aktiverede T-celler også teoretisk dræbe MDSCs. Faktisk har vi for nylig vist, at E7-specifikke CD8 + T-celler og OT-1 T-celler er i stand til at inducere apoptose i MDSCs efter behandling med cisplatin, CpG og GP33 peptid (Wu et al, personlig kommunikation). Når den er aktiveret, CD4 + og CD8 + T-celler frigiver relevante cytokiner, såsom IL-2, hvilket fører til opregulering af Fas-ekspression på MDSCs. FasL udtrykkes af de aktiverede T-celler selv. Som et resultat, når en aktiveret T-celle møder en MDSC vil MDSC undergå Fas-FasL-medieret apoptose [17]. Fjernelsen af ​​immunosuppressive MDSCs fra tumor mikromiljø bidrager til tumor kontrol.

Den aktuelle undersøgelse tjener som en platform, der kan gælde for mange patienter med forskellige kræftformer. En unik egenskab ved PADRE-peptidet er, at epitopen den består af, er specifik for mange MHC klasse II-molekyler, og er derfor anvendelig til mange individer. Desuden vi formoder, at denne fremgangsmåde ikke kræver identifikation af tumor antigen. Den første runde af behandling kan inducere tumor celledrab og frigivelse af tumorantigen i tumoren mikromiljø samt genereringen af ​​PADRE-specifikke CD4 + T-celler (fig. 3). Efter efterfølgende runder af behandling, frigivelse af tumorantigen fører til den krydspriming og frembringelsen af ​​tumor antigen-specifikke CD8 + T-celler, som ligeledes i stand til at dræbe tumorceller (fig. 4). På grund af denne mekanisme er det ikke nødvendigt at kende immunodominante tumorantigener, hvilket gør den fremgangsmåde potentielt bredt anvendelig.

Da den nuværende fremgangsmåde involverer intratumoral injektion af terapeutiske midler, er det mest anvendelige til tilgængelige tumorer, herunder hoved- og hals, hud og cervikale tumorer. Dog kan den fremgangsmåde begrænses i tilfælde af utilgængelige tumorer, et problem, der skal løses for yderligere at udvide dette koncept til klinisk oversættelse. Dette kan løses ved at ændre PADRE peptid at omfatte tumor homing eller tumor miljø rettet mod aptamerer. For eksempel har CD13 ligand vist sig at være stand til at levere det antigene peptid til tumor loci [18], [19] og fremkalde en antigenspecifik antitumorreaktion [1]. Derudover har vi vist, at mesothelin og NKG2D kan anvendes som tumor-målsøgende moduler i kimære proteiner, der leverer de terapeutiske proteiner til tumor loci [20], [21]. Fremtidige studier er berettiget til at udvide anvendeligheden af ​​den nuværende tilgang til utilgængelige tumorer.

Den tilgang præsenteres her, kan være en ideel kandidat til klinisk oversættelse. Faktisk PADRE og CpG er blevet testet i forskellige kliniske forsøg og fundet at være sikker. PADRE er testet i en formulering af et præventivt cytomegalovirus (CMV) vaccine (NCT00722839) [22].