Abstrakt
Kræft i æggestokkene er en immun reaktiv malignitet med en kompleks immun undertrykkende netværk, der sløver immun udryddelse succes. Denne undertrykkende mikromiljø kan medieres af rekrutteringen eller induktion af CD4
+ regulatoriske T-celler (tregs). Vores undersøgelse søgt at undersøge sammenhængen af tumor-infiltrerende CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs og andre immunstoffer, med kliniske resultater i serøse æggestokkene kræftpatienter. Vi udførte immunofluorescens og kvantificering af intraepithelial tumorinfiltrerende tredobbelte positive tregs (CD4
+ CD25
+ Foxp3
+), samt CD4
+ CD25
+ Foxp3
-, CD3
+ og CD8
+ T-celler i tumor prøver fra 52 patienter med forhøjet stadie serøse ovariecancer. Tredive-en af patienterne havde god overlevelse (dvs. 60 måneder) og 21 havde dårlig overlevelse 18 måneder. Totale celletal samt celle-forhold blev sammenlignet blandt disse to outcome grupper. De samlede antal af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs, CD4
+ CD25
+ Foxp3
-, CD3
+ og CD8
+ celler ikke signifikant forskellig mellem grupperne. Men højere andele af CD8
+ /CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ Treg, CD8
+ /CD4
+ og CD8 /CD4
+ CD25
+ foxp3
– celler blev set i godt resultat gruppen sammenlignet med de patienter med dårligt resultat. Disse data viser for første gang, at forholdene mellem CD8
+ til både CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs og CD4
+ CD25
+ Foxp3
– T-celler er associeret med sygdom udfald i ovariecancer. Foreningen er tydelig i forhold snarere end absolut tælling af T-celler antyder, at effektor /suppressor-forhold kan være en mere vigtig indikator for udfaldet end individuel celletal. Således immunterapi strategier, der modificerer forholdet mellem CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs eller CD4
+ CD25
+ Foxp3
– T-celler til CD8
+ effektor celler kan være nyttige i at forbedre resultaterne i æggestokkræft
Henvisning:. Preston CC, Maurer MJ, Oberg aL, Visscher DW, Kalli KR, Hartmann LC, et al. (2013) forholdene mellem CD8
+ T-celler til CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ og Foxp3
– T-celler korrelerer med dårlig Klinisk Outcome i Human serøs kræft i æggestokkene. PLoS ONE 8 (11): e80063. doi: 10,1371 /journal.pone.0080063
Redaktør: Muriel Moser, Université Libre de Bruxelles, Belgien
Modtaget: 14. august 2013; Accepteret: 8 oktober 2013; Udgivet: November 14, 2013 |
Copyright: © 2013 Preston et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til KLK, ELG, LCH: P50-CA116201, R01-CA122443, og P50-CA136393.The finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i æggestokkene har den højeste dødelighed af kræft eksklusivt til kvinder. Trods mange terapeutiske indsats udnytte nye kemoterapi, har kuren satsen ikke forbedret væsentligt i årtier [1-3]. Det er velkendt, at kliniske resultater i kræft i æggestokkene er ret uensartet og ikke let forudsagt af standard kliniske og patologiske egenskaber (fx klasse, tumor histologi) [4-6]. Dette antyder, at der kan være andre tumormikromiljøet eller vært karakteristika med en dominerende rolle i overlevelse. I de senere år har der været interesse for at forstå den rolle af patientens immunrespons på hendes ovariecancer, da sygdommen antages at være et naturligt immune reaktiv malignitet med et komplekst undertrykkende netværk, der effektivt sløver immun udryddelse succes. Gennem det seneste årti har undersøgelser vist betydningen af immunsystemet i at påvirke patientens udfald. Især Zhang og kolleger offentliggjort en undersøgelse, der viste, at størstedelen af patienter med ovariecancer havde tumor-infiltrerende CD3
+ T-celler og at infiltration var positivt associeret med overlevelse [7]. Tilstedeværelsen af T-celler var særlig gavnligt for de personer, der demonstrerede en komplet klinisk respons på kirurgi og kemoterapi, hvor den femårige overlevelse var 74% i forhold til 12% for dem uden T-celler. Efterfølgende undersøgelser har raffineret vores forståelse af intratumoral T-celler, såsom arbejde af Sato et al., Der viste patienter, der havde høje niveauer af infiltrerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) havde en gennemsnitlig overlevelse på 55 måneder versus dem med få eller ingen CTL som havde en overlevelse på 26 måneder [8]. En unik egenskab ved de konventionelle terapeutiske strategier for kræft i æggestokkene, er, at T-celle funktion hurtigt genvindes efter konventionel kemoterapi [9]. De antigener, som patienterne er naturligt reagerer nu bliver systematisk undersøgt [10,11]. Tilsammen viser disse resultater, at anti-tumor-immunitet fremkaldes mod ovariecancer og påvirkninger det kliniske forløb af sygdommen. Imidlertid er det nu klart, at anti-tumor-immunitet opvejes af en immunundertrykkende mikromiljø [7,12-15].
En af de cellulære faktorer, der kan mægle denne immunsuppression i tumoren mikromiljø er de lovgivningsmæssige T-celle (Treg) befolkning. Forskning i tregs har avanceret hurtigt, især i forbindelse med cancer. Tregs er en heterogen CD4
+ T-celle subpopulation hvis primære funktion er immunregulering ved at blokere funktionen af aktiverede T-celler. CD4
+ tregs kan opdeles i to undergrupper: naturligt forekommende tregs med en CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ fænotype og induceret tregs med en variabel CD25 udtryk [12]. Tidligere undersøgelser har vist, at forkhead kasse P3 (Foxp3) er en central transkriptionsfaktor der regulerer udvikling og funktion af CD4
+ tregs [16,17]. Endvidere har undersøgelser også vist, at ekspression af CD25, en komponent af høj affinitet IL-2-receptoren, er afgørende for Treg overlevelse, som er meget afhængig af IL-2 [18,19]. I det seneste årti har der været flere undersøgelser forbinder tregs med overlevelse i mange typer af kræft. I kræft i æggestokkene, Curiel og kolleger oprindeligt viste en stærk sammenslutning af CD4
+ CD25
+ T celler med dårlig overlevelse [14]. Notatet specifikke rolle triple bejdset CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T celler ikke blev vurderet. Et par år senere, Sato og kolleger undlod at se nogen direkte forbindelse af CD25
+ Foxp3
+ T-celler i kræft i æggestokkene, men viste, at lave samlede CD8
+ T-celletal og CD8
+ /CD25
+ foxp3
+ T-celle-forhold var forbundet med dårligere overlevelse, igen i en population med varierende histologier [8]. I endnu en nyere undersøgelse, Milne og kolleger viste, højkvalitets serøs ovariecancer, at optællingen af intraepitel celler enkeltvis farvet for Foxp3
+ var forbundet med stærkt forbedret overlevelse [20]. Men deres undersøgelse ikke specifikt definere celletype udtrykker Foxp3. Eftersom andre celler ud over T-celler udtrykker Foxp3 (fx tumorceller og B-celler), betydningen af dette arbejde, mens interessant, er fortsat uklart [21,22]. Da både CD8
+ og CD4
+, regulatoriske og
in vitro
aktiverede T-celler vides at udtrykke Foxp3, den specifikke identitet af den celletype, der er involveret i modificering overlevelse er ukendt. mere for nylig, Kryczek og kolleger viste imidlertid, at i primære tumorer eller autoimmune læsioner, foxp3 og CD25 er en meget specifik og pålidelig markør sæt til primære humane CD4
+ tregs [23].
Det primære fokus for vores undersøgelse var at undersøge sammenslutningen af tumor infiltrerer CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs og andre T-celler med kliniske resultater i epitelial æggestokkene kræftpatienter, eftersom denne tilgang af triple farvning er ikke blevet gjort i ovarietumorer til vores bedste viden. Konkret har vi studeret en unik kohorte, er begrænset til patienter med fremskreden serøs ovariecancer (den mest almindelige og mest dødbringende histologi), består af to undergrupper af patienter med vidt forskellige kliniske resultater, den ene med meget dårlig overlevelse ( 18 måneder) og den anden af patienter med meget bedre overlevelse ( 60 måneder).
Materialer og metoder
patienter og kliniske karakteristika
undersøgelsen blev godkendt af Mayo Clinic Institutional Review Board og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til forskning brug af prøver. Power beregninger blev udført via simulation til at estimere antallet af prøver, der er nødvendige til at påvise en meningsfuld overlevelse forskel hos patienter med kræft i æggestokkene. Fifty-to patienter, udvalgt fra forskellige udfald grupper med dårligt resultat ( 18 måneder overlevelse) og godt resultat ( 60 måneder overlevelse), forudsat 82,5% magt på en alpha på 0,05 til at detektere en samlet overlevelse hazard ratio på 1,65 mellem dichotomous CD4
+ CD25
+ foxp3
+ Treg grupperinger på tværs af alle æggestokkene kræftpatienter. Dette svarer til mindst 80% magt til at opdage en effekt størrelse (ændring i antal eller forholdet mellem CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs) på 0,8, når de evaluerer tregs mellem de to forskellige udfald grupper med dårlig udfald (
n
= 21) og godt resultat (
n
= 31) med en Kruskall Wallace test, som udføres i denne undersøgelse. Alle prøver blev udvalgt fra patienter med optimalt debulked, høj scene, serøs æggestokke, æggeleder eller primær peritoneal carcinoma.
Farvning og immunfluorescens analyse af vævsprøver
Alle frosne eksemplar blokke, der tidligere indlejret i tissue-Tek oktober (Sakura Finetek, Torrance, CA), blev cryosectioned (5 um), fikseret i acetone i 10 minutter, lufttørret i 1 time og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse. Før farvning blev alle objektglas blokeret i 10 minutter ved stuetemperatur (25 ° C) med serum-frit protein blok (Dako, Carpinteria, CA) og derefter vasket med phosphatbufret saltvand (PBS). Farvning blev udført ved inkubation af objektglassene ved stuetemperatur (25 ° C) i fugtige mørke kamre til 2 timer med primære antistoffer fortyndet i antistoffortyndingsmiddel reagens (Dako, Carpinteria, CA). Kanin polyklonalt anti-humant Foxp3 (Abcam, Cambridge, MA) blev anvendt i en fortynding 1:75, monoklonalt muse-anti-humant CD4 (Abcam, Cambridge, MA) ved 1: 100, rotte monoklonalt anti-humant CD25 (Abd Serotec, Raleigh, NC) ved 1: 100, monoklonalt muse-anti-humant CD8 (BD Pharmingen, San Diego, CA) ved 1: 100, og muse-monoklonalt anti-humant CD3 (BD Pharmingen, San Diego, CA) ved 1:50. Efter farvning med primære antistoffer blev objektglassene derefter vasket i 15 minutter med PBS og inkuberet i 1 time i et fugtigt mørkt kammer med sekundære antistoffer (Alexa Fluor 405, 488 og 594 konjugeret, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) ved en fortynding på 1: 500. Antistoffer for foxp3, CD4 og CD25 blev anvendt til tredobbelt farvning af tregs mens antistoffer til CD3 og CD8 blev brugt som enkelte pletter. Enkeltvis farvede celler blev også modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 100 ng /ml) i 30 minutter. Humant tonsillar væv blev anvendt som en positiv kontrol og negative kontroller blev udført ved at udelade primært antistof og anvender isotypekontroller for hvert antistof.
Konfokal mikroskopi og celle kvantificering
De farvede objektglas blev evalueret i en LSM 510 konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Oberkochen, Tyskland). Intraepithelial farvede celler blev vurderet på høj-drevne forstørrelse scannede områder af tilfældige epitel sektioner undgå stromale områder. De scannede felter blev fordelt for at undgå overlapning og blegning samt at dække hele tumor sektionen. Tyve tilfældige felter (300 pm
2) blev digitalt fotograferet for hver patientprøve. Kvantificering af positive celler blev udført manuelt af observatører blindet til alle kliniske oplysninger. En delmængde af tilfældigt udvalgte prøver blev gennemgået af en sekundær observatør. Total tællinger af celler fra hvert felt blev registreret i enten tredobbelte farves (CD4, CD25 og foxp3) eller enkelt farvet (CD8 eller CD3) prøver.
Når tumorprøver blev undersøgt groft under konfokal mikroskopi, tumorinfiltrerende lymfocytter blev observeret i både stroma og epithel. Således blev nøje opmærksomhed rettes mod indførelse af tælle felter udelukkende inden epitel områder. Følgende celler blev kvantificeret i den tredobbelte farvede prøver og anvendes i analysen: CD4
+ CD25
+ Foxp3
+, CD4
+ CD25
+ Foxp3
-, CD4
+ CD25
-FOXP3
-, CD4
+ CD25
-FOXP3
+, CD4
-CD25
+ foxp3
+, CD8
+ DAPI
+ og CD3
+ DAPI
+. Intraepithelial tumor infiltrerer tregs blev defineret som CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ celler, med CD4 (rød signal) og CD25 (grønt signal) pletter påvist i de cytosoliske og membran områder giver en orange og /eller gul mønster og foxp3 (blå signal) detekteres som en mønster inden for nuklear og typisk stiplede pletten. Den primære vurdering af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ treg kvantificering var den samlede treg tælle på tværs af alle 20 billeder fra en tumor prøve. Dette blev gjort i modsætning til tidligere undersøgelser, der generelt kvantificeres tregs hjælp bruger-identificerede fokusområder for infiltration [8,14]. Vi testede gyldigheden af disse kendte fremgangsmåder ved også at anvende sekundære målinger for hver tumor, nemlig den højeste enkelt billede tælle fra en tumorprøve (max1), og summen af de tre højeste tællinger fra en tumorprøve (MAX3).
Tumor-infiltrerende lymfocytter isolation
I yderligere undersøgelser, tumor-infiltrerende lymfocytter (tils) blev høstet fra seks æggestokkræft og isoleres ved diskontinuerlig Ficoll gradient som tidligere beskrevet [24]. Kort beskrevet blev lymfocytterne adskilt fra tumorcellerne ved centrifugering af cellesuspensionen på en to lag Ficoll gradient, 100% lag på bunden og 75% lag ovenpå. De isolerede TIL’er blev derefter farvet til flow cytometrisk analyse som beskrevet nedenfor.
Flowcytometri
celleoverfladen og intracellulært markør-farvning blev udført i isolerede TIL’er (1 x 10
6) som beskrevet tidligere [25]. blev udført to sæt eksperimenter; i det første sæt un-stimulerede celler blev farvet med følgende konjugerede antistoffer: CD3-PE-Cy7, CD4-Pacific Blå, CD8-Alexa Fluor 700, CD1c-APC, BDCA2-FITC og CD68-PerCP-Cy5.5. I det andet, vi sat farvede un-stimulerede og stimulerede celler for CD4-Pacific blå, CD25-PE, Foxp3-Alexa Fluor 647 og TGF-β-PE-Cy7. Før farvning TIL’er blev stimuleret ved inkubering med 5 pg /ml concanavalin-A (Con-A, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 0,7 pi /ml BD GolgiStop ™ (BD Bioscience, San Jose, CA) i 8 timer, derefter vasket, talt og resuspenderet i FACS-buffer (PBS med 1 mM /l EDTA og 3% bovint serumalbumin). Foxp3 og cytokin-farvning blev udført ifølge producentens intracellulære farvningsprotokol (eBioscience, San Diego, CA). Passende isotype antistoffer blev anvendt som kontroller. Alle antistoffer blev indkøbt fra BD Bioscience (San Jose, CA) med undtagelse af de følgende antistoffer: TGF-β-PE-Cy7 og CD3-PE-Cy7 var fra eBioscience (San Diego, CA), BDCA2-FITC fra Miltenyi Biotec (Auburn , CA) og CD68-PerCP-Cy5.5 blev erhvervet fra BioLegend (San Diego, CA). Prøver blev kørt på en FACS Scan II og analyseret ved hjælp FlowJo 10.0.5.
Dataanalyse
distributioner af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ Treg tæller mellem patienter med god og dårlig resultat blev undersøgt grafisk og sammenlignes ved hjælp af Wilcoxon rank-sum test (Mann-Whitney
U
test). Forhold blev beregnet som antallet af CD8
+ celler divideret med antallet af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs for en given patient. Celletal er sammenfattet som median og interkvartile område (IQR). For parvise sammenligninger af flowcytometri data, blev en parret Students t-test anvendes. Den statistiske signifikans blev sat til en p-værdi på ≤ 0,05.
Resultater
Kliniske patientkarakteristika
Halvtreds to tumorprøver der opfylder undersøgelsens blev udvalgt fra vævet bank. Patient karakteristika er sammenfattet i tabel 1. Den mediane alder af patienterne i undersøgelsen var 65 år (spændvidde, 37-86 år). Alle patienter blev diagnosticeret med fremskreden (71% stadie III, 29% stadie IV) sygdom, blev optimalt debulked, og havde tumorer med serøs morfologi. Median overlevelse i dårligt resultat gruppen var 12,4 måneder (spændvidde 3,0-16,7) og den mediane overlevelse i godt resultat gruppen har endnu ikke nået med 73,8 måneder median opfølgning (interval fra 60,1 til 116,8).
godt resultat
Poor Outcome
(
n
= 31) (
n
= 21) P-valueAge på DiagnosisMedian62.069.00.0059Range (37,0-80,0) (50,0-86,0) StageIII23 (74,2%) 14 (66,7%) 0.56IV8 (25,8%) 7 (33.3%) GradeLow3 (9,7%) 0 (0,0%) 0.20High28 (90,3%) 21 (100 %) Vital StatusAlive24 (77,4%) 0 (0,0%) NADead7 (22,6%) 21 (100,0%) første linje ChemotherapyPlatinum2 (6,5%) 1 (4,8%) 0.20Platinum og Taxane27 (87,1%) 15 (71,4%) Andet2 (6,5%) 5 (23,8%) tabel 1. Patient Karakteristik
godt resultat 60 måneder overlevelse, dårligt resultat 18 måneder overlevelse; alle tilfælde var serøse kræft og optimalt cytoreduced. CSV Hent CSV
Optælling af intraepithelial tumor-infiltrerende T-celler
intraepithelial infiltrerende celler (CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs, CD4
+, CD8
+, CD3
+, CD4
+ CD25
+ foxp3
– og CD4
+ CD25
-FOXP3
+) blev kvantificeret og analyseret på alle områder. Repræsentative scannede områder af tumorinfiltrerende formodede CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs samt CD4
+ CD25
+ Foxp3
– er vist i figur 1A. Figur 1B viser repræsentative CD8
+ og CD3
+ T-celle infiltration. Analyse afslørede en beskeden, men statistisk signifikant lineær korrelation mellem tællinger af CD3
+ T-celler og CD4
+ eller CD8
+ T-celler (figur 1C).
(A) Foto af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs i æggestokkene tumor prøver. Top venstre panel viser CD4 udtryk (rød signal), øverste højre panel viser CD25-ekspression (grøn signal), nederste venstre panel viser Foxp3 udtryk (blå signal) og nederste højre panel viser de kombinerede signaler med pile, der peger at tredoble farves CD4
+ CD25
+ foxp3
+ tregs. I dette billede tregs ses i tæt kontakt med CD4
+ CD25
+ Foxp3
– celler. (B) Foto af intraepithelial infiltrerende CD8
+ cytotoksiske T-celler (venstre panel) og CD3
+ lymfocytter (højre panel) i kræft i æggestokkene. Dette repræsentative scanning viser CD8 og CD3-ekspression (rødt signal = CD8 eller CD3, blå signal = DAPI) i æggestokkene tumormasse. (C) Korrelation plot sammenligne CD3 tæller til enten CD8 (fyldte symboler) og CD4-tal (åbne symboler). Symbolerne repræsenterer summen af de 20 felter tælles for en unik patient. Alle patienter er repræsenteret. Det indsatte linjer er produktet af lineær regressionsanalyse. (D) Viser det samlede gennemsnit (± SEM,
n
= 52) CD3
+, CD4
+, og CD8
+ T-celletal (sum af 20 felter) for alle patienter. (E) Korrelation plot sammenligne de samlede treg (dvs. CD4
+ CD25
+ Foxp3
+) tæller med summen af de maksimale 3 (max3) felter eller den maksimale felt tæller (max1). Symbolerne repræsenterer summen af de 20 felter tælles for en unik patient. Alle patienter er repræsenteret. Det indsatte linjer er mindste kvadraters regression linjer.
Da tidligere undersøgelser undersøgt og optalt ikke-tilfældige T-celle beriget felter, undersøgte vi gyldigheden af denne tilgang ved at vurdere sammenhængen mellem det samlede CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ treg optælling på tværs af alle 20 felter og max1 og max3 tæller. Som vist i figur 1 D, der var meget stærke statistisk signifikante korrelationer, hvilket antyder at kendte fremgangsmåder til at optælle infiltrerende T-celler er stort set gyldige.
T-celletal ikke direkte korrelerer med det kliniske resultat i human serøs ovariecancer
Initial analyser fokuseret på korrelation af celletal med resultatet grupper. I modsætning til tidligere arbejde, intraepithelial CD3
+ T-celler blev ikke observeret ved signifikant forskellige niveauer hos patienter med godt resultat (median 154 celler (sum af 20 felter), IQR 89-297) sammenlignet med patienter med dårligt resultat (median 179, IQR 73-333, tabel 2). Tilsvarende mængderne af infiltrerende CD4
+ (370, IQR 249-461 i god gruppe vs. 377, IQR 264-524 i den fattige gruppe) og CD8
+ T-celler (115, IQR 53-180 i god gruppe vs. 48, IQR 17-180 i den fattige gruppe) var ikke signifikant forskellig mellem de gode og dårlige udfald grupper.
God Outcome (n = 31)
dårligt resultat (n = 21)
Median
IQR
Median
IQR
P- værdi
Cell Counts
1CD3
+15489-29717973-3330.881CD4
+370249-461377264-5240.514CD8
+11553-1804817-1800.271CD4
+CD25
+FOXP3
+10155-16110992-1460.444CD4
+CD25
+FOXP3
-14890-187147105-2310.251Ratios
2CD8
+/CD3
+0.580.34-0.910.430.20-0.700.198CD4
+/CD3
+2.061.33-3.431.731.32-3.670.985CD8
+/CD4
+0.270.20-0.440.130.07-0.370.050CD3
+/CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ 1.720.95-2.681.380.79-2.490.695CD3
+ /CD4
+ CD25
+ Foxp3
-1.310.71- 2.061.240.72-1.640.490CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ 0.980.49-1.790.320.25-1.020.027CD8
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
-0.650.43-1.190.460.13-0.770.048CD4
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
+ 2.912.59-4.313.042.39-3.460.332CD4
+ /CD4
+ CD25
+ foxp3
-2.501.94-3.192.161.80-2.640.351Table 2. Sammenligninger af T-celle niveauer eller nøgletal.
1Sum celle optællinger af alle 20 felter,
2Ratio af summen af alle 20 felter; IQR, interkvartile interval; statistisk signifikante ændringer er vist med fed skrift. CSV Hent CSV
Brug af CD25 og Foxp3 markører, kunne CD4
+ T-celler opdeles i fire grupper. De to store grupper var CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs (~ 33,2% blandt alle patienter) og CD4
+ CD25
+ Foxp3
– T-celler (~ 43,1 %). De to andre mindre grupper var CD4
+ CD25
-FOXP3
+ T-celler (~ 14,4%) og CD4
+ CD25
-FOXP3
– T-celler (~ 9.3 %). Vi så ingen forskel i niveauet af CD4
+ CD25
+ Foxp3
– T-celler mellem patient outcome grupper. De mediane niveauer var 148 celler (IQR 90-187) i godt resultat gruppen og 147 (IQR 105-231) i dårligt resultat gruppen (tabel 2). Tilsvarende medianen tællinger af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs blandt patienter med godt resultat var ikke anderledes i forhold til patienter med dårligt resultat. Alle tumor prøver viste CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ treg infiltration med en kombineret vifte af 14-350 celler. Procentdelen af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs blandt den samlede intraepithelial CD4
+ infiltrerende celler var 31 ± 10% i godt resultat gruppen sammenlignet med 34 ± 11% i dårligt resultat gruppe patienter (p = 0,319).
En bemærkelsesværdig observation fra disse sammenligninger er, at CD4
+ T-celletal var højere end CD3
+ tæller, når ækvivalens var forventet. (Figur 2A). En mulig grund til den manglende korrelation kunne være, at CD4- og CD8-antistoffer er farvning af en blanding af både lymfoide og myeloide celler, da det er blevet tidligere rapporteret, at begge markører kan udtrykkes på forskellige leukocytundergrupper herunder lymfoid og myeloid. Alternativt CD3 kunne nedreguleret i T-celler på grund af kronisk stimulering i tumormikromiljøet [26,27]. I betragtning af disse spørgsmål, vi renset tumor infiltrerende mononukleære celler fra tre patienter med kræft i æggestokkene, farvede dem med forskellige lymfoide og myeloide markører og udførte flowcytometrisk analyse. Farvning afslørede, at 26 ± 3% (n = 3, SEM) og 34 ± 4% af CD4
+ og CD8
+ -celler, er henholdsvis CD3 negative (figur 2B-C). Analysen af CD11c
+, BDCA2
+, og CD68
+ -celler antyder, at myeloid DC, plasmacytoide DC og makrofager udgør tilsammen mindre end i alt 5% af hver af CD4
+ og CD8
+ celler i æggestokkene tumorer (figur 2D-G).
(AB) Bar grafer, der viser den gennemsnitlige (± SEM,
n
= 3) niveauer af CD3-CD4
+ eller CD8
+, henholdsvis som en procentdel af den samlede CD4
+ eller CD8
+ T-celler. (C) vist er 4 repræsentative dobbelt farve dot plots farvning enten CD4 eller CD8-gated celler. De antistofspecificiteter noteres med aksen. (D) Vist er middelværdien (± SEM,
n
= 3) niveauer af CD11c
+, BDCA2
+ og CD68
+ celler som en total CD4
+ eller CD8
+ celler (X-aksen).
T-celle-forhold korrelerer med kliniske resultater i human serøs ovariecancer
at se ingen associationer mellem de absolutte tællinger af CD4
+ CD25
+ foxp3
+ tregs og klinisk resultat, vi fokuseret på nøgletal som tidligere var blevet beskrevet [8,28]. Medianen CD8
+ /CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ Treg forhold blev fundet signifikant højere hos patienter med godt resultat sammenlignet med de patienter med dårligt resultat (0,98 vs. 0,32, p = 0,027 , tabel 2, figur 3A). I modsætning hertil medianen CD3
+ /CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ Treg og CD4
+ /CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ treg forhold var ikke signifikant forskellig mellem grupperne. Ved yderligere undersøgelse, uventet opdaget vi også, at de gode resultatet patienter havde en median CD8
+ /CD4
+ CD25
+ Foxp3
– ratio, der var signifikant højere i god gruppe (0,65) som sammenlignet med den dårlige gruppe (0,46, p = 0,048) (tabel 2, figur 3B). Når CD8
+ /CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ Treg og CD4
+ CD25
+ Foxp3
– nøgletal blev behandlet samlet (dvs. alle CD4
+ CD25
+) og som vist i figur 3C, forholdene mellem de to grupper forblev signifikant forskellige. Som alder viste sig at være lidt anderledes mellem de to grupper, vi bekræftet, at sammenhængen mellem celletal og gruppe status forblev konsekvent efter justering for alder i en logistisk regressionsmodel (data ikke vist).
(A) Lagkagediagram viser fordelingen af CD4
+ T-celler med hensyn til CD25 og Foxp3 farvning hos alle patienter. (BD) Scatter dot plots af forholdene mellem CD8
+ T-celletal til tregs (CD4
+ CD25
+ Foxp3
+) (B), CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler (C), eller kombineret CD4
+ CD25
+ foxp3
+ og CD4
+ CD25
+ foxp3
– T-celler (D) for både godt resultat og dårligt resultat grupper.
Når man sammenligner forholdene beregnet ud fra de tre store pletter (CD3, CD4, og CD8), kun medianen CD8
+ /CD4
+ T-celle-forhold, som var 0,27 og 0,13 for henholdsvis de gode og dårlige udfald grupper, var statistisk signifikant forskellige (p = 0,050), hvilket er i overensstemmelse med de væsentlige forhold af CD8
+ T-celler til enten CD4
+ CD25
+ foxp3
+ tregs eller CD4
+ CD25
+ foxp3
– beskrevet ovenfor. Ingen andre nøgletal (fx CD8
+ /CD3
+ T-celle og CD4
+ /CD3
+ T-celle-forhold) signifikant forskellig mellem de gode og dårlige udfald grupper (tabel 2).
Endelig, efter at have set, at både Foxp3
+ og Foxp3
– CD4
+ T-celler var forbundet med resultatet, når undersøgt som et forhold med CD8
+ T-celler, vi spekuleret at disse celler var tregs stand til at producere immun regulerende cytokin, TGF-β. For at teste dette, vi renset tumorinfiltrerende leukocytter (TIL) og stimuleret derefter direkte
ex vivo
med ConA, efterfulgt af intracellulær cytokin farvning. Som vist i figur 4A, TIL’er afledte CD4
+ CD25
+ T-celler var en blanding af foxp3
+ og Foxp3
– T-celler. I fravær af stimulering, en fraktion (12 ± 4%, n = 3, ± SEM) af de oprensede T-celler opretholdes ekspression af foxp3. Ved stimulering, procentdelen af CD4
+ CD25
+ T-celler, der udtrykker Foxp3 øget til 42 ± 9% af den samlede CD4
+ CD25
+ T-celler. I fravær af stimulering, 5 ± 3% af CD4
+ CD25
+ T-celler produceret TGF-β og efter stimulering, steg dette til 34 ± 9% (p = 0,04, figur 4B).
(A) Vist er to prikker plots af oprensede tumor-infiltrerende CD4
+ T-celler stimuleret med ConA eller medie alene. Celler gated på CD4 og CD25. (B) Bar diagrammer viser middelværdien (± SEM,
n
= 3 unikke patientprøver) procentdel af foxp3
+ og TGF-β T-celler blandt den samlede CD4
+ CD25
+ T-celler stimuleret med enten ConA eller medier alene. P-værdi opnås ved en parret Students t-test.
Diskussion
Forstå patologiske rolle tregs, der har evnen til at undertrykke aktiverede T-celler i kræft i æggestokkene mikromiljø er vigtig for at udvikle nye immun-baserede terapier og bestemme patientens prognose. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi for første gang, at CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ tregs er forbundet med udfaldet specifikt i serøs ovariecancer men kun i forbindelse med CD8
+ T-celler . Den omstændighed, at indflydelsen af tregs er kun detekterbart når de evalueres som et forhold med cytotoksisk CD8
+ T-celler er i overensstemmelse med den model, der potentielt destruktive tumorspecifikke immunresponser opvejes i tumormikromiljøet af stærk immunsuppression [29] . Dette tyder på, at strategier, der tager sigte på udtømning af tregs og samtidig vaccine stimulering af effektor T-celler ville være effektive til at fjerne æggestokkene kræftformer og forbedre overlevelsen [30]. Adskillige lægemidler, som vides at være anvendelige som Treg-nedbrydende midler, såsom cyclophosphamid, anti-CD25-antistof, eller denileukin diftitox er tilgængelige for kombinationsbehandling med hidtil ukendte vaccine eller adoptiv T celleterapi metoder [31,32]. Alternativt Quezada og kolleger viser, at checkpoint anti-CTLA-4-blokade i kombination med vaccine terapi også kan være effektiv til at ændre balancen uden at eliminere tregs, hvilket tyder på en potentiel anvendelse til den nyligt godkendte anti-humant CTLA-4-antistof i ovariecancer [ ,,,0],33,34].
Vores
ex vivo
forsøg viste, at en lille procentdel af ikke-stimulerede CD4
+ CD25
+ T celler fastholdt foxp3 udtryk, som senere steg på aktivering. Denne lavere hyppighed af foxp3
+ T-celler, i forhold til immunfluorescensfarvning resultater, kan afspejle nedregulering af foxp3, til observationer, at human Foxp3 ekspression reguleres af T-celleaktivering og ikke udviklingsmæssigt programmeret som det er i murine tregs [ ,,,0],35]. Følgelig har ekspressionen af foxp3 i T-celler efter aktivering førte til en vis uenighed om, hvorvidt Foxp3 er en Treg-specifik markør i mennesker. Faktisk har nogle undersøgelser vist, at Foxp3 udtryk fremkaldes i aktiverede T-celler uden regulatoriske aktiviteter, som kunne føre en til at spekulere i, at nogle af CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ T-celler i kræft i æggestokkene kan ikke være regulerende. I modsætning hertil har andre undersøgelser vist, at aktiverede T-celler, opregulere Foxp3 gør det faktisk overbringe suppressiv aktivitet i en celle-kontakt eller cytokin-afhængig måde (dvs. IL-10 og TGF-β) [36,37].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.