PLoS ONE: MIR-107 og MIR-185 kan fremkalde cellecyklusstop i Human Ikke småcellet lungekræft Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er korte enkeltstrenget ikke-kodende RNA, der undertrykker genekspression gennem enten translationel undertrykkelse eller nedbrydning af target mRNA. Annealing mellem messenger-RNA’er og 5 ‘frø region miRNA menes at være essentiel for den specifikke undertrykkelse af målgenekspression. Én miRNA kan have flere hundrede forskellige mål i en celle. Hurtigt akkumulere tyder på, at mange miRNA er involveret i cellecyklus regulering og som følge heraf spille kritiske roller i carcinogenese.

Metode /vigtigste resultater

Indførelse af syntetisk miR-107 eller miR-185 undertrykt vækst de humane ikke-småcellet lungekræft cellelinier. Flowcytometri-analyse afslørede disse miRNA inducerer en G1 cellecyklusstandsning i H1299 celler og undertrykkelsen af ​​cellecyklusprogression er stærkere end den af ​​Let-7 miRNA. Ved genekspressionen analyser med oligonucleotid-mikroarrays, finder vi hundreder af gener påvirkes ved transfektion af disse miRNA. Brug miRNA-target forudsigelse analyser og array data, vi listet en række sandsynlige mål for miR-107 og miR-185 for G1 cellecyklusstop og validere en delmængde af dem ved hjælp af real-time RT-PCR og immunoblotting for CDK6.

konklusioner /betydning

Vi identificerede nye cellecyklus regulering miRNA, miR-107 og miR-185, lokaliseret i hyppigt ændrede kromosomale regioner i human lungekræft. Især for miR-107, er et stort antal down-regulerede gener kommenteret med genet ontologi udtrykket »cellecyklus«. Vores resultater tyder på, at disse miRNA kan bidrage til at regulere cellens cyklus i humane maligne tumorer

Henvisning:. Takahashi Y, Forrest ARR, Maeno E, Hashimoto T, Daub CO, Yasuda J (2009) MiR-107 og MiR -185 kan fremkalde cellecyklusstop i human ikke-småcellet lungekræft cellelinier. PLoS ONE 4 (8): e6677. doi: 10,1371 /journal.pone.0006677

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 24, 2009; Accepteret: 17 Juli 2009; Udgivet: 18 August, 2009

Copyright: © 2009 Takahashi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Research Grant for Riken omik Science center fra MEXT til Yoshihide Hayashizaki Grant for Riken Frontier Research System, Funktionel RNA forskningsprogram YH og Grant-in-støtte til videnskabelig forskning til J.Y. ARRF understøttes af en CJ Martin Fellowship fra den australske NHMRC (ID 428.261). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

miRNA er 19 til 23-base lange enkeltstrengede RNA, der spiller kritiske roller i biologiske processer [1]. Nukleotidsekvenserne af miRNA ofte evolutionært konserveret blandt flercellede organismer [2]. De miRNA er udtrykt som hårnål formede dobbeltstrengede pre-miRNA og sekventiel behandling ved forskellige RNase III enzymer, drosha og Dicer, genererer modne miRNA [3] .Den modne miRNA binder med et sæt af proteiner, herunder Agonaute, til dannelse af en miRNA induceret silencing kompleks (miRISC). Den miRISC menes at gøre et kompleks med target messenger-RNA’er og post-transkriptionelt undertrykker ekspressionen af ​​target-gener. Virkningsmekanismen af ​​miRISC er stadig kontroversiel [4], men der er en generel enighed om, at størstedelen af ​​mål-messenger-RNA’er har bindingssteder for de miRNA i den 3′-utranslaterede regioner. Fra anden til ottende baser af 5′-ende sekvens af miRNA kaldes frø sekvens og menes at være afgørende for anerkendelse af target messenger RNA ved miRNA.

Det er blevet klart, at nogle miRNA spiller kritiske roller i cellecyklus regulering i samarbejde med onkogener eller tumorsuppressorgener (se gennemgang [5], [6]). Et eksempel på cellecyklus regulerer miRNA er

Lad-7

(for

HSA-lad-7a

, MIMAT0000062). Indførelsen af ​​syntetisk præ-let-7 bevirker cellecyklusstandsningen i lungecancerceller [7]. Mange miRNA vides at nedregulere cellecyklus beslægtede gener. MIR-17~92 klynge blev identificeret som den nedstrøms for

MYC

onkogen [8] og nedregulere E2F transkriptionsfaktorer, som er kendte mediatorer af cellecyklusprogression [9] .En anden vigtig tumor relateret gen,

TP53

, inducere ekspressionen af ​​miR-34 familiemedlemmer og overekspression af miR-34 forårsagede cellecyklusstandsningen ved G1 fasen [10] – [16]

Her har vi rapporterer. potentiel cellecyklus regulerer miRNA under søgningen af ​​kræftrelaterede miRNA i humane lunge kræftceller. I denne undersøgelse gense vi et sæt genomiske regioner identificeret af Zhao

et al

. der amplificeres eller slettes i humane lungecancere [17]. I løbet af undersøgelsen, fandt vi, at

miR-107 Hotel (MIMAT0000104) og

MIR-185

(MIMAT0000455) undertrykker proliferation i lunge adenocarcinom cellelinjer og inducere cellecyklus arrest ved G1 fase af cellecyklus. Vi har forsøgt at karakterisere nedstrøms target messenger RNA i disse miRNA ved brug af microarray profilering med gen-ontologi analyser og Targetscan forudsigelser [18].

Resultater

Angivelse af miR-31, 107, og 185 i humant væv samling herunder lungekræft væv og cellelinjer

fra regionerne identificeret af Zhao

et al

. [17], fandt vi 13 og 26 kommenterede miRNA i homozygot slettede og forstærkede områder henholdsvis (supplerende tabel S1). Fordi mange af de kræftrelaterede gener bidrager til malign transformation i bredt spektrum af celletyper, vi prioriteret miRNA, der har været impliceret i andre voksen-debut humane cancere. Derefter valgte vi tre miRNA: MIR-107, mir-185, og MIR-31 (MIMAT0000089) [19] – [22]. Vi tilføjet Lad-7a for cellevækst og cellecykluskontrol fordi miRNA kan undertrykke cellevækst i lungen cancercellelinier [23] og inducerer standsning af cellecyklus i HepG2-cellelinien [7].

Brug Taq-Man kvantitativ RT-PCR-teknologi, målt vi ekspressionen af ​​de fire miRNA i den humane lungecancer-cellelinjer A549 og H1299 og på tværs et panel af kommercielt tilgængeligt RNA’er fra normale væv og lungekræft prøver (fig. 1). De fleste af de miRNA viste relativt allestedsnærværende udtryk blandt raske væv (fig. 1). Det er interessant, at ekspression af de analyserede miRNA (MIR-107, 185, og lad-7a) var lavere i lunge tumor og lungekræft cellelinier end i normal lunge. MIR-31 blev højt udtrykt i lungen cancercellelinier.

miRNA ekspressionsniveauer blev målt ved miRNA TaqMan QRT-PCR i normal lunge, hjerne, hypofyse, lever og ovarievæv, en lunge tumor prøve og også i lungen tumorcellelinjer, H1299 og A549. Den lodrette akse angiver den relative ekspression af hver miRNA normaliseret med den for RNU44.

Vækst undertrykkelse og cellecyklusstop ved overekspression af kandidat miRNA i menneskelig lungekræft cellelinjer

effekten af ​​disse miRNA på proliferation blev testet ved MTT-assay med præ-miRNA transficerede H1299 og A549-celler. Transfektion af HSA-MIR-107 og HSA-MIR-185 dramatisk reduceret celleproliferation i begge cellelinier (fig. 2). I tilfælde af H1299-celler, viste Lad-7a miRNA signifikant reduceret proliferation mens effekterne var mindre tydelige i A549-celler. Omfanget af vækst undertrykkelse af A549 ved Lad-7a ligner den af ​​rapporterede [7]. MIR-31 viste svag undertrykkelse af cellevækst, men undertrykkelse niveauerne var ikke statistisk signifikant på mange tidspunkter for begge celler (fig. 2).

Vækst undertrykkelse effekt af miRNA kandidat transfektioner på H1299 (til venstre panel) og A549 (højre panel) som målt ved MTT-assayet. Den lodrette akse angiver relative forhold mellem A450 nm, nemlig dag 0 i hver celle som 1. Bemærk MIR-107 og MIR-185 undertrykker proliferation i begge cellelinier

DNA indholdsanalyse af. flowcytometri afslørede transfektion af HSA-mIR-107 og HSA-mIR-185 inducerede en signifikant stigning i procentdelen af ​​celler i G1-fasen af ​​cellecyklussen, til lignende niveauer som en lad-7a kontrol, mens en kodet negativ kontrol ikke gjorde (fig. 3). Vi har ikke observere enten nogen tilsyneladende stigning i sub-G1 befolkning i flowcytometri eller andre apoptose-relaterede morfologiske ændringer, såsom nuklear blebbing og kondens under fasekontrast mikroskop (data ikke vist). Dette antyder, at væksthæmning induceret af HSA-MIR-107 og HSA-MIR-185 transfektion skyldtes induktion af G1 arrest snarere end apoptose.

Histogrammer af DNA indhold opnået ved FACS analyse er vist. Procenterne af hver cellecyklus faser er vist i det indsatte af histogrammer. Der var ingen gate anvendes på de begivenheder, så at der ikke var nogen indlysende ophobning af sub-G1 befolkninger i alle forsøgene.

Identifikation af kandidat target mRNA af miRNA ved gen profilering analyse

microarray profilering blev gjort for at bestemme de globale ændringer i mRNA-ekspressionsniveauer i H1299-celler transficeret med vækst suppressive miRNA sammenlignet med en negativ kontrol. I HSA-miR-107, HSA-miR-185 og HSA-lad-7a transficerede celler der var 561, 646 og 812 udskrifter ned-regulerede og 608, 698 og 949 opreguleres med 1,5 gange eller mere, hhv. Gene ontologi analyse blev udført på generne nedreguleret i transfectans. Tabel 1 viser de mest markant beriget GO forretningsbetingelser for de ned-regulerede gener med hver miRNA. De fem bedste vilkår i gener nedreguleret af HSA-miR-107 var alle cellecyklus relaterede (tabel 1). Nedreguleres gener med den lad-7a var hovedsageligt involveret i rRNA metabolisme, ribosom biogenese, og M-fasen af ​​cellens cyklus. Endelig ned-regulerede gener med HSA-miR-185 viste ingen berigelse for cellecyklus relaterede vilkår, i stedet for de vilkår i forbindelse med udvikling og differentiering var fremtrædende. Desuden de 127 og 33 gener almindeligvis nedreguleret og opreguleres henholdsvis begge miRNA viste ingen gen ontologi berigelser, antyder, at disse miRNA inducerer standsning af cellecyklus med forskellige signalveje (tabel 2, 3 og data ikke vist).

Vi sammenlignede miRNA target forudsigelser med Targetscan software [18] for disse miRNA til generne nedreguleret i vores udtryk profilering datasæt. For både konserverede og ikke-konserverede sites, fandt vi medianen gange ændring af forudsagte mål var konsekvent lavere end det for alle gener påvist i arrayene (fig. 4). Der er en tendens til, stærkere forudsagte mål at være mere nede-reguleret end svage forventede mål. Tilsvarende de konserverede mål tendens til at være flere forudsigelser nedreguleret end alle forventede mål (fig. 4).

Target scanne blev udtrukket for miRNA 185, 107 og let7a. Median ekspression signal vises kun for gener, der betragtes som detekteres af Agilent software. Y-aksen viser den mediane gange ændring for sæt forudsagte microRNA målgener ved forskellige tærskelværdier, sammenlignet med alle gener på microarray (vist med sort). I alle tilfælde medianen signal med forudsagte mål er lavere end observeret hvis der anvendes alle prober. Når forsøget er forlænget ud til tre dage, vi observerer mindre effekt, hvilket tyder på direkte mål mere berørt i den første dag.

Vi matchede derefter disse edb-forudsagt mål til generne down- reguleres mere end 0,75 gange på RNA-niveau til at indsnævre de potentielle mål for disse miRNA. Vi fandt mange af disse potentielle mål blev kommenteret med udtrykkene “cellecyklus” i Entrez Gene anmærkninger (tabel 2) antyder, at disse tre miRNA direkte kan regulere cellecyklusprogression via disse gener. Interessant nok i vores side lad-7 ikke undertrykke ekspressionen af ​​CDK6 (NM_001145306) mRNA, som undertrykkes af overekspressionen af ​​lad-7 i den tidligere undersøgelse [7]. Tabel 3 viser, at forskellige sæt af kendte onkogener er nedreguleres af disse miRNA.

Ud fra disse lister og andre liste beskriver kandidat miRNA mål kommenteret med vilkår cellecyklus, lungekræft, onkogen eller tumor suppressor i Entrez Gene anmærkninger ( supplerende tabel S2), valgte vi en delmængde af udskrifter til validering af QRT-PCR ved sammenligningen med målet lister, som Targetscan [18] og PicTar [24] software (fig. 5A). For miR-107, bekræftede vi mRNA nedregulering af

CCNE1

(NM_001238),

CDK6

,

CDCA4

(NM_017955.3),

RAB1B

(NM_030981.2) og

CRKL

(NM_005207.3), og for miR-185, bekræftede vi nedregulering af

CCNE1

,

CDK6

,

Akt1

(NM_001014431.1),

HMGA2

(NM_003483.4) og

CORO2B Hotel (NM_006091.3) (fig. 5B). Vi bemærker, at både MIR-107 og MIR-185 transfektion forårsaget nedregulering af cyclin E1 (CCNE1) og cyclin-afhængig kinase 6 (CDK6) mRNA niveauer selv om undertrykkelse niveau af CDK6 af MIR-185 er beskeden (fig. 5B). Vi derefter bekræftet af western blotting, at cdk6 protein niveauer er også nedreguleret af miR-107, mens CDK6 udtryk var relativt uændret ved miR-185 (fig. 5C). Fordi undertrykkelse niveau af CDK6 mRNA-ekspression af miR-185 er meget beskeden, kan den efterfølgende nedgang i CDK6 proteinekspression på det tidspunkt for observation (24 timer efter transfektion) være for lidt, der skal overholdes de konventionelle immunoblottings.

A) repræsentant nukleotidsekvens matcher mellem mulige målgener og miRNA. Tallene i parentes angiver positionerne af målnukleotider fra stopcodonen. Kun matchede nukleotider med miRNA frø sekvenser er vist med lodrette linjer. B) Den kvantitative RT-PCR-analyser af potentielle mål for miR-107 (CCNE1, CDK6, CDCA4, RAB1B og CRKL) og miR-185 (CCNE1, CDK6, Akt1, HMGA2, CORO2B) er vist. Den lodrette akse angiver relative ekspression forholdet hvert gen normaliseret med den for GAPDH. C) Western Blot viser nedregulering af CDK6 protein ved miR-107.

Diskussion

Vi sket for at finde, at miR-107 og miR-185 kan undertrykke celleproliferation i to lunge cancer cellelinjer og inducerede en G1 anholdelse af cellecyklus. Omfanget af vækst undertrykkelse af disse miRNA svarer til den af ​​tumoren undertrykkende miRNA, lad-7. Genekspressionsprofilering analyse med transfektion af disse miRNA angav, at kun MIR-107 viste signifikant berigelse af cellecyklus regulatorer for de nedstrøms effektorer. På den anden side, havde MIR-185 ikke signifikant undertrykke cellecyklus regulator samt lad-7, en kendt cellecyklus regulering miRNA [6]. MIR-185, men kunne undertrykke mRNA ekspressionen af ​​cellecyklus regulering gener såsom CDK6 og Akt1.

De almindeligt regulerede gen sæt med alle tre vækst undertrykkende miRNA er ikke så mange, og ikke så stærkt relateret til den cellecyklusregulering (tabel 2). Disse resultater antydede, at de tre miRNA regulere distinkte cellulære signalveje. Da miRNA har en bred vifte af mål i en celle (dvs. mindre specifik), og eftersom omfanget af undertrykkelse af mål-ekspression ved miRNA er generelt moderat, skal funktionen af ​​miRNA betragtes som den “fine tuning” af genekspression i pattedyr celler [25]. Ophobningen af ​​disse små regulerende virkninger kan forårsage betydelige biologiske reaktioner i cellerne [5] .På den anden side kan et par potentielle målmolekyler såsom CCNE1 og CDK6 være kritisk for cellecyklusregulering af disse miRNA. For eksempel reduktion af CCNE1 med siRNA forårsager cellecyklusstop i leverkræft cellelinjer [26]. I tilfælde af CDK6, reduktion af CDK6 af siRNA forårsagede langvarig S-fase i humane embryonale stamceller [27]. Generelt betydningen af ​​miRNA i celle cyklus regulering er helt rimeligt, fordi miRNA formodes at være vigtige molekyler til induktion af celledifferentiering, som ledsager med cellecyklusstop i mange tilfælde.

Med hensyn til miR-107 , andre beviser understøtter en rolle for denne miRNA i G1 anholdelse og vækst undertrykkelse. miR-107 aktier 7 af de 8 baser af dens frø sekvens med miR-16 familie af miRNA, som inducerer G1 anholdelse ved at målrette flere cycliner og cellecyklus-regulatorer, herunder CDK6 som vi bekræftet som et miR-107 mål [28]. Endvidere en tidligere undersøgelse fandt, at syntetiske inhibitorer til MIR-107 stigning proliferation af A549-celler, men påvirker ikke HeLa-celler [29] tyder MIR-107 kan faktisk spille en lunge specifik rolle i at reducere proliferation. Interessant, miR-107 viste overexpressions i pancreascancer tyder denne miRNA har nogle positive rolle i bugspytkirtlen carcinogenese [21]. På den anden side, under fremstillingen af ​​dette manuskript, Lee et al. rapporterede, at demethylering og deacetylering behandlinger til menneskets bugspytkirtel kræft cellelinjer inducerede overekspression af miR-107 og overekspression af miR-107 undertrykt cellevækst og ekspression af CDK6 i de menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer [30]. Sidstnævnte undersøgelse er kompatibel med vores data i form af CDK6 som kandidat nedstrøms mål for miR-107. Det er interessant, om dette miRNA havde nogen specifikke cellulære funktioner i cellerne snarere end cellecyklusregulering. Safdar

et al

. foreslog, at MIR-107 er blevet induceret i mus udøves quadriceps musklerne [31]. Ifølge gennemgang af Wilfred et al., At miR-107 og dens paralog, miR-103, kan fungere i reguleringen af ​​cellulær metabolisme [32]. Det kan være interessant mulighed, at disse miRNA regulerer de grundlæggende cellulære funktioner, såsom metabolisme eller cellecyklusprogression snarere end specifikationen af ​​celledifferentiering.

Mekanismen for standsning af cellecyklus ved MIR-185 er ikke klart. Antallet af cellecyklus regulatorer i de nedstrøms undertrykte gener er meget lavere ved miR-185 end ved miR-107. En gruppe forskere foreslået, at denne miRNA overudtrykkes i blærecancer [20]. I det andet papir, Choong rapporteret, at MIR-185 har stærk positiv korrelation til udseendet af erythroide overfladeantigener (CD71, CD36, og CD235a) i humane navlestrengsblod celler stimuleret med vækstfaktorer og induceret erythroid differentiering [33]. Generelt, induktion af celledifferentiering normalt par med undertrykkelsen af ​​cellecyklusprogression. I betragtning af de miRNA funktioner i andre metazoans, mange af de miRNA inducerbar med celledifferentiering kan have nogle cellecyklus undertrykkende funktioner. Den miRNA bør have andre biologiske funktioner i forskellige celletyper. Det er derfor interessant at undersøge, om MIR-185 har nogen differentierende funktioner i lungecancerceller. Et andet vigtigt spørgsmål er, at MIR-185 udviste vækst suppressive funktioner (figur 2, 3) og fald i ekspression i lungecancerceller (figur 1), selv om miRNA er lokaliseret i en kromosomal region amplificeret i to lung cancer cellelinjer ([17 ] og supplerende tabel S1). Disse resultater er counter-intuitive. Det er imidlertid muligt, at de tumorsuppressorer kan lokaliseres i en region, der viser kromosomal amplifikation i tumorceller. Et eksempel er en potentiel tumor undertrykkende gen,

GSDMA

(NM_178171.4) [34], er lokaliseret i en kromosomal region forstærket i gastriske cancerceller [35]. Dette gen nedreguleres i de humane gastriske cancere selvom genet viste amplifikation i tumorceller [35]. I tilfælde af MIR-185, kan epigenetisk inaktivering af miRNA forekomme forud for genamplifikation af kromosomet 22q21.1 regionen. Yderligere undersøgelse klart behov for at tage fat på disse spørgsmål grundigt.

Endelig har vi rapportere, at nye ansøgerlande miRNA som kan regulere cellecyklusprogression i humane ikke-småcellet lungekræft-cellelinjer. Det er stadig et åbent spørgsmål, om der somatiske genetiske ændringer kan forårsage suppression af disse miRNA i human lungecancer eller andre maligne tumorer. Yderligere karakterisering af den genomiske loci af disse miRNA er nødvendig for at gøre spørgsmålet klart.

Metoder

Udvinding af miRNA position

Kommenterede miRNA loci blev udvundet fra områder af kromosomal gevinst og tab identificeret af Zhao

et al

. [17] i et stort panel af humane lungecarcinomer ved anvendelse SNP arrays. De HG16 koordinater blev konverteret til deres Hg18 hjælp ækvivalenter ved hjælp af UCSC Lift-Over værktøj (https://genome.ucsc.edu).

Cellelinjer

menneskelige lunge kræft cellelinier , H1299 og A549, blev indkøbt hos ATCC. Cellelinierne blev dyrket i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 ug /ml penicillin /streptomycin og 292 ug /ml L-glutamin (Invitrogen, Carlesbad, CA, USA).

RNA præparater og kvantificering af RNA ved hjælp af real-time PCR

Alle realtime PCR blev udført med StepOnePlus realtime PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i fire eksemplarer. Total RNA blev ekstraheret fra H1299 og A549 celler med

mir

Vana miRNA isolation kit (Ambion, Austin, TX, USA). Total RNA af humane væv blev indkøbt fra BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, USA; katalognumre: R1234152-50, R1235152-50, R1234035-50, R1234068-10, R1234149-50, R1234183-50). Til kvantificering af miRNA blev 100 ng af total RNA analyseret med TaqMan MicroRNA Reverse Transcription (RT) Kit (Applied Biosystems) med RNU44 som ladningskontrol. Til kvantificering af mRNA’er, blev 500 ng af total RNA revers-transkriberet under anvendelse af PrimeScript II RT Enzyme (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) og PCR blev udført med SYBR premix Ex Taq (Perfect Real Time: Takara Bio, Inc. ) med GAPDH som lastning kontrol. Alle real-time PCR-analyse blev udført tre gange.

miRNA transfektion

Syntetisk pre-miRNA og uspecifik negativ kontrol (miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control # 1) blev indkøbt fra Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA). De præ-miRNA blev transficeret ved en slutkoncentration på 10 nM med lipofectamin 2000 (Invitrogen), og mediet skiftet 24 timer efter transfektion.

Cellevækst måling

Celler blev udpladet i plader med 96 brønde og inkuberet ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Cellelevedygtighed blev evalueret ved MTT-assay ved anvendelse af Celletælling kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan) ifølge fabrikantens protokol. Efter 1 times inkubering med medier indeholdende tetrazoliumforbindelse blev absorbansen ved 450 nm detekteres i 0,1 sek med Arvo MX 1420 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Cellecyklusanalyse

Celler blev høstet efter 72 timer og fikseret i 70% iskold ethanol og efterfulgt af RNAse a behandling, farvet med 50 ug /ml propidiumiodid for DNA-indhold analyse ved flowcytometri analyse på en FACS Calibur-system (Becton Dickinson, Franklin, NJ, USA). Dataene blev indsamlet og behandlet ved hjælp af FlowJo FACS analyse software (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Expression profilering ved hjælp af Agilent Gene udtryk vifte

cRNA probe blev genereret fra total RNA (500 ng) med Low RNA Input lineær forstærkning Mærkningskit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Cy3-mærket cRNA (1,65 mg) blev derefter fragmenteret og relative udtryk blev målt ved hybridisering til 4 × 44K hele den menneskelige oligo microarray (Agilent). Feature Extraction ver. 9.1 software (Agilent) blev anvendt til at analysere billedet af microarray. Mikroarrayet analyser blev udført in duplo. Alle microarray data rapporteret i manuskriptet er beskrevet i overensstemmelse med MIAME retningslinjer og dataene er blevet deponeret i CIBEX (Center for Information Biologi genekspression) database [36] på Center for Information Biologi og DNA data Bank of Japan (DDBJ), National Institut for Genetik (Mishima, Japan). Tiltrædelsen nummer for datasættet er CBX79.

Microarray og Gene ontologi analyse

Microarray data blev visualiseret og normaliseret hjælp Genespring GX 7.3 software (Agilent). Værdier under 0,01 blev sat til 0,01. For hver chip hver måling blev divideret med den 50. percentil af alle målinger for den chip. Så for hver probe målingerne blev normaliseret til de negative kontrolmålinger. På grund af begrænsningen af ​​de ressourcer, statistikken

s

-værdi kan ikke være gældende kriterier for gen-udvælgelse af vores datasæt. Dermed for gen ontologi analyse, differentielt udtrykte gener blev defineret som ≥1.5 folde op eller ned i forhold til den negative kontrol på den tilsvarende dag. Gene ontologi sigt berigelse i op og ned regulerede gen sæt blev vurderet ved hjælp af GOstat web-værktøj [37]. Den GOstat web værktøj giver en p-værdi på om genet liste er betydeligt beriget for gener annoteret med et bestemt gen ontologi. Dette beregnes baseret på, hvor mange gener i genet sæt er kommenteret med den givne ontologi, og hvor mange gener på hele microarray (baggrunden) er kommenteret med samme ontologi. Vi definerede baggrunden som det sæt af gener detekteres i mindst én af opstillingen eksperimenter.

Antistoffer og immunblotting analyse

Antistoffer mod α-tubulin (Sigma) og CDK6 (Santa-Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA) blev anvendt. Dyrkede celler (5,0 x 105 celler /brønd) blev dyrket på 6-brønds pladen, brønde og transficeret med miRNA. 24 timer efter transfektion blev cellerne lyseret og underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese. De separerede proteiner blev overført til Immobilon membran (Millipore, Billerica, MA) ved elektroblotting. Immunkomplekser blev påvist ved forøget kemiluminescens (Perkin Elmer) og visualiseret med LAS 3000 billede analysator (Fuji film, Tokyo, Japan).

Støtte oplysninger

tabel S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0006677.s001

(0,03 MB XLS)

tabel S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0006677.s002

(0,27 MB XLS)

Tak

Vi takker Mses. Satomi Fujiwara, Asami Hirakiyama, og Kana Nakamura for deres tekniske assistance.